方法

在 Google Scholar 和 PubMed 数据库上对 2003 年 1 月 1 日至 2022 年 12 月 31 日期间发表的文献进行了全面搜索。检索词包括“印度的狂犬病”、“狂犬病的实验室诊断”、“狂犬病监测”、“国家狂犬病控制规划”和“新的狂犬病诊断测试”。审查了各种出版物，包括原始研究文章、系统评价、书籍章节、标准手册以及国际和国家卫生政策和报告。我们还检查了根据金标准评估新测试的出版物，即使这些测试尚未纳入标准测试算法。

需要实验室确认

临床狂犬病和鉴别诊断：狂犬病有两种临床形式：脑炎型（狂暴型）和麻痹型（哑巴）。症状通常在接触后 20-90 天内出现；但是，潜伏期可以从一周到一年多不等1。非特异性前驱症状包括发热、感觉异常、暴露部位附近疼痛或瘙痒、不适、喉咙痛、吞咽困难、焦虑、易怒、失眠和烦躁不安。脑狂犬病的神经期特征是意识波动、痉挛、自主神经功能障碍和恐水症 1,3。麻痹性狂犬病的特征是逐渐发作的上行性弛缓性麻痹。它通常从被咬伤的肢体开始，逐渐扩散到所有肢体，以及咽肌和呼吸肌3,4。恐水症并不常见。如果不进行重症监护，这两种形式最终会导致昏迷和在症状出现后 1-2 周内死亡5。

狂犬病的脑炎型狂犬病以典型的临床特征为特征，在有狂犬病暴露史的情况下病情进展迅速，通常不需要实验室确诊。然而，对于表现为麻痹或非典型特征的受影响个体，诊断狂犬病变得具有挑战性，尤其是在没有暴露史的情况下。虽然脑炎型被认为更为普遍，但近年来印度报告的瘫痪/非典型表现病例有所增加 6,7,8。

麻痹性狂犬病可由吉兰-巴雷综合征类似，包括急性炎性脱髓鞘性多发神经根病和急性运动感觉轴索神经病。其他需要考虑的鉴别诊断包括疫苗后脑脊髓炎，但由于印度自 2005 年以来禁止接种神经组织来源的狂犬病疫苗，因此很少见。类似于狂犬病的其他疾病包括抗 N-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎、感染性病因，如破伤风、脑疟疾、单纯疱疹和其他病毒性脑炎，以及狂犬病歇斯底里、精神疾病、蝎子和蛇毒液、非法药物使用和有机磷中毒 9,10,11,12.虽然临床特征、神经影像学检查和常规实验室检查可以帮助区分这些疾病与狂犬病，但需要特定的实验室检查来明确确认或排除狂犬病诊断。

临床管理：狂犬病的早期实验室确认在避免不必要的检查和治疗方面起着至关重要的作用，允许开始适当的支持和姑息治疗，并采取感染控制措施。此外，及时确认有助于有效地将预后传达给家庭成员，促进病例结案并提供必要的悲伤咨询12,13。

目前，狂犬病没有有效的治疗方法，一旦出现症状，这种疾病就被认为几乎是致命的。提供支持性护理，包括镇静、补液、镇痛和退热药，以减轻痛苦。全世界记录的狂犬病存活病例不到 30 例14；其中超过 15 例来自印度，主要在过去十年中6、14、15、16、17、18。其他几个病例显示生存期延长，从数周到第7、8、19、20 个月不等。直到最近几年，印度其他具有类似结果的病例可能尚未被诊断或报告。这种不断发展的狂犬病存活临床特征以前在印度是未知的，除了 2002 年报告的一例部分康复病例21。

在过去十年中，一些狂犬病病例的临床病程延长，生存期更长，这可归因于先前部分或完全接种狂犬病疫苗、提高对狂犬病的认识、改善印度获得医疗保健的机会等因素 6,15,16,17,18,19,20,22,23，生前实验室确认以及有效的重症监护和支持治疗 19。虽然大多数幸存者经历了中度至重度神经系统后遗症，但来自印度和其他地方的少数病例显示几乎完全康复，后遗症最少 18,22,23,24。这种具有良好结果的罕见病例重新燃起了希望，并激发了医生和受这种毁灭性疾病影响的个体的家庭成员对探索积极管理和实验方案的兴趣。

医学的快速发展为不久的将来狂犬病结局的改善提供了乐观的理由。生前诊断设施的可用性在狂犬病的早期实验室确认和在尝试积极管理的病例中监测治疗反应方面起着至关重要的作用 19,22,25。大多数记录在案的狂犬病幸存者在接受或未接受治疗后表现出早期和强大的免疫反应，仅通过脑脊液 （CSF） 和/或血清中存在中和抗体来诊断，而没有可检测到的病毒抗原或核酸 14,18,26。一项针对印度实验室确诊狂犬病病例的研究发现，与病毒核酸检测呈阳性的个体相比，无论有无中和抗体，在初步诊断时仅中和抗体检测呈阳性的个体的生存期更长7。以前接种过疫苗、在疾病早期出现、狂犬病病毒抗原/RNA 诊断检测阴性和 CSF/血清中狂犬病中和抗体检测阳性的年轻人被认为是尝试在重症监护病房进行积极管理的合适人选14。实验室检测的可用性有助于临床医生做出有关支持性、姑息性或积极性管理的关键决策，并有助于解决他们在这种情况下可能遇到的道德和伦理困境。

2005 年，美国一名青少年在接受涉及治疗性昏迷、抗兴奋性毒性措施和抗病毒策略的实验性治疗后从狂犬病中幸存下来22。然而，随后在其他案件中复制这一成功的尝试，包括一些来自印度的案件，在很大程度上都失败了 25,27,28,29。治疗方案经过多次修订，当前版本强调支持性重症监护，重点是在早期预防致命的自主神经功能障碍，同时允许中和抗体的自然发展以清除感染11,30。

最近的 WHO 磋商强调需要以合乎道德的方式进行仔细规划和验证的研究，以探索治疗狂犬病的新管理方案、免疫调节程序和潜在的抗病毒药物1。在一个狂犬病死亡人数仍然高得惊人的国家，印度具有适当诊断、临床和研究能力的精选医学学术机构必须加紧迎接这一挑战。这些机构处于有利地位，可以为开发和实施抗击这种致命疾病的创新方法做出重大贡献。

感染控制和公共卫生：狂犬病的人际传播很少见，通常通过受感染的组织或器官移植发生。标准的预防措施，例如在插管和抽吸等手术过程中避免接触粘膜表面感染狂犬病的生物材料和破损的皮肤，可显著降低传播给医护人员的风险。患者的密切接触者，包括家庭成员和医务工作者，应根据个体风险评估接受暴露后预防1。实验室确认在评估风险和指导参与尸体防腐、尸检或处理的人员采取适当的预防措施方面起着至关重要的作用。

全球报告的通过实体器官或组织移植传播狂犬病的病例凸显了在狂犬病流行的印度等国家筛查供体的重要性，尤其是那些患有不明原因的神经系统疾病和其他风险因素的供体 31,32,33。随着组织和器官移植数量的增加，实施筛查方案以防止狂犬病意外传播给受者变得至关重要。

监测：狂犬病病例的漏报对应对这种被忽视的人畜共患疾病构成了重大挑战。为了实现到 2030 年消除犬类介导的狂犬病导致的人类死亡的全球目标34，印度国家狂犬病控制规划 （NRCP） 制定了犬介导的狂犬病消除国家行动计划 （NAPRE）35。该计划强调系统性疾病监测的重要性，并采用全面的“同一个健康”方法来控制狂犬病。

作为 NAPRE 的一部分，计划在国家、区域和州各级建立狂犬病诊断实验室，以加强对人类和动物狂犬病的实验室监测35。该倡议旨在加强狂犬病病例的报告和监测，从而更准确地评估疾病负担。

印度朝着消除狂犬病迈出的重要一步是最近宣布人类狂犬病为法定报告疾病2。印度政府向所有邦发布的这项指令强调了及时报告和监测人类狂犬病病例的重要性，以促进有效的疾病控制措施。

疾病监测通过评估疾病负担、早期发现和监测疫情以及评估干预效果，在 NRCP 中发挥着至关重要的作用。特别是基于实验室的监测是该计划的重要组成部分。

实验室检测有助于确认和描述狂犬病病例的特征。它允许通过部分或全基因组测序等技术来识别病毒。病毒的详细特征为疾病流行病学提供了有价值的见解，包括识别流行变异、非 RABV病毒的存在、涉及的宿主物种、地理起源和感染源 36,37,38。

RABV 的基因组多样性对依赖于特定靶序列扩增的基于 PCR 的检测方法构成了挑战。在某些情况下，靶区域内的遗传变异会阻止引物和探针的适当结合，导致病毒核酸检测失败并产生假阴性结果 39,40,41,42,43。RABV 毒株的定期监测和基因组表征有助于开发有效的 PCR 检测方法，从而可以解释遗传多样性并提供准确的结果。

RABV 是 lyssaviruses 的成员，这是一组不同的病毒，由超过 16 种基因不同的病毒组成26.虽然 RABV 是全世界人类狂犬病死亡的主要原因，但所有 RABSA 病毒都有可能导致这种疾病。印度是否存在其他 lyssavirus 尚不明确。除了在大多数情况下狗是狂犬病传播的主要来源外，野生动物和蝙蝠在将狂犬病病毒传播给人类方面的作用在印度被严重低估，尽管全球都报告了此类事件44。最近在邻国斯里兰卡的果蝠中检测到一种名为 Gannoruwa bat lyssavirus 的新型 lyssavirus 以及在印度东北部的一个邦对蝙蝠进行的一项研究表明，lyssavirus 可能在全国各地的蝙蝠种群中传播45,46。

基因组数据是监测的有力工具，可提供对狂犬病传播的见解并指导控制工作。下一代测序使获得完整的 lyssavirus 基因组变得更加容易，从而能够全面分析病毒传播模式 47,48。使用基因组数据研究系统发育情况有助于量化州际和地区间传播，有助于制定有效的狂犬病控制国家战略，并监测大规模犬类疫苗接种计划的影响。此外，加强对 Lyssavirus 多样性的监测将有助于我们了解用于预防和控制狂犬病的现有生物制剂的有效性。

在人类狂犬病病例有所下降并正在积极努力消除狂犬病的国家或地区，持续的实验室监测变得更加重要。这在印度受欢迎的全球旅游目的地果阿的案例中很明显，它在消除犬类狂犬病方面取得了重大进展，在过去四年中没有报告人类死亡49,50 人。持续的实验室监测在监测和验证这一里程碑的实现情况方面发挥着至关重要的作用，确保保持进展并及时发现和处理潜在的疫情。

同样，对于印度安达曼岛、尼科巴岛和拉克沙群岛等地区，持续的实验室监测对于确保其无病状态至关重要51。即使在长期保持无狂犬病的地区，病毒再次引入的风险也始终存在。一个典型的例子是马来西亚，在 20 年没有任何病例报告后，该国最近爆发了犬类狂犬病52。这次疫情导致超过 15 人死亡，凸显了跨界入侵的持续威胁，并强调了保持警惕监测的必要性。

狂犬病的实验室诊断测试

常规实验室检查在初始阶段可能是正常的，除了轻度脑脊液细胞增多和脑脊液中蛋白质轻度升高，并且无助于诊断。需要特定的实验室测试来确认狂犬病，并且可以对生前或生后获得的临床标本进行 1,7,8,11,12,13,26,41,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66 （表）。

只有在发病后才有可能进行狂犬病的实验室诊断；在潜伏期内，没有测试可以诊断它。

诊断方式： 有多种技术可用于狂犬病的实验室诊断。这些大致分类如下：

病毒抗原检测：直接荧光抗体检测 （FAT） 是最早和最可靠的狂犬病死后诊断技术之一。即使在今天，它仍然是确认人类和动物尸检样本中狂犬病的金标准 1,53。它基于对触摸印模脑涂片中的狂犬病核蛋白抗原的检测，使用异硫氰酸荧光素标记的特异性狂犬病抗体，允许在荧光显微镜下观察抗原。另一种方法，直接快速免疫组织化学检测 （dRIT），利用生物素化单克隆抗体的混合物，可以在光学显微镜下观察。与 FAT 不同，dRIT 不需要使用荧光显微镜，这使得它在具有基本诊断测试设施的实验室中更容易获得55。FAT 可用于角膜涂片和颈部皮肤活检等样本中的抗原检测。然而，在这些样本中，FAT 的敏感性和特异性相对较低。此外，由于角膜瘢痕化的潜在风险，不鼓励使用角膜涂片 1,12。

狂犬病的诊断可以通过组织病理学检测福尔马林固定脑组织中独特的嗜酸性粒细胞胞浆内包涵体（称为“Negri 小体”）来确认。然而，阴性结果并不能最终排除狂犬病的诊断。因此，尽管它作为狂犬病诊断的补充测试很有用，但不建议将其作为主要诊断测试12。

快速免疫层析诊断试验 （RIDT） 或侧流测定 （LFA），尤其是在现场环境中，可用于筛查动物的脑和唾液标本。这些易于执行的检测不需要昂贵的设备、试剂、冷链设施或技术专长 56,67,68,69,70,71。在果阿进行的一项研究中，LFA（Anigen 快速狂犬病抗原检测试剂盒，Bionote，韩国）用于在常规监测期间对狗的狂犬病进行快速尸检。与金标准 FAT 相比，该测试显示敏感性为 0.96 [95% 置信区间 （CI）：0.91-0.99]，特异性为 0.99 （95% CI：0.94-1）68，这与其他人报告的结果相似67,69。然而，将各种市售 RIDT 与金标准进行比较，发现敏感性和特异性存在显着差异 56,70,71。保存样本的结果，即使经过适当冷冻，也可能不如新鲜的脑样本准确或理想。需要进一步的验证研究来评估这些检测方法诊断人类狂犬病的可靠性和性能。

病毒特异性抗体的检测：快速荧光病灶抑制试验或荧光抗体病毒中和试验用于检测 CSF/和血清样品中针对 RABV 的中和抗体 1,12,66。这些测试的性能受多种因素的影响，例如所用细胞系的生长、实验室适应的 RABV 的增殖和滴定、样品质量（CSF 和血清）、使用的狂犬病偶联物、功能性荧光显微镜的可用性以及分析人员的技术专长和技能 12,57,72.为了提高安全性并减少生物危害措施，可以使用基于假型病毒的中和测定代替活 RABV。这些检测涉及报告基因，具有样品量要求低和费用低等优点，使其更适合资源有限的实验室 57,59,72,73,74。

间接荧光抗体 （IFA） 检测是一种简单快速的检测方法，可用于检测抗 RABV 的 IgM 和 IgG 抗体。然而，由于与其他病毒性脑炎75 的交叉反应性，其特异性受到限制。另一方面，ELISA 可以检测与糖蛋白和/或核蛋白的结合抗体，提供了一种安全、易于执行且具有成本效益的替代方案，适用于具有基本设施的外围实验室 60,76,77。

病毒核酸检测：常规或实时逆转录酶 （RT-PCR）、基于核酸序列的扩增、环介导的等温扩增和基于微阵列的检测是狂犬病 1,12,66,73,78,79,80,81,82 的病毒核酸检测技术.在实验室中，无论是宰前还是宰后样本，确认狂犬病诊断的最常用方法是常规或实时 RT-PCR。有几种靶向核蛋白 （N） 基因或其他狂犬病相关基因40、41、42、43、61、66、73、83 的标准化 PCR 方案。

PCR 在混合唾液和颈部皮肤样本中表现出较高的敏感性，但在 CSF、尿液样本和提取的毛囊中表现出较低的敏感性 7,8,12,62,81,83,84,85。PCR 技术可应用于分解、自溶和存档的脑样本，而 FAT 可能无法对此类样本产生可靠的结果 1,8,12,66。这些分析适用于储存在 RNA 溶液/缓冲液中的样品，以及在过滤纸/FTA 纸和侧向流装置试纸66、67、86 上收集和干燥的样品。

最近在印度进行的一项试点研究87 评估了一种便携式电池供电的基于芯片的实时 PCR 检测（Truenat；Molbio Diagnostics）使用动物大脑样本。该研究报告称，与 FAT87 相比，灵敏度为 92.3%，特异性为 100%，诊断准确性为 95.8%。然而，该测定尚未经过验证可用于人类样品。最近开发了另一种用于狂犬病诊断的便携式实时 RT-PCR（PCR1100 检测法），并在动物样本上进行了测试，使用脑组织报告的灵敏度和特异性为 100%88。这些快速、用户友好且经济高效的分析方法无需样品运输，因此具有分散实验室服务的巨大潜力。这种分析可以方便地在护理点进行，从而减少对集中式实验室设施的依赖。这不仅节省了时间，而且最大限度地降低了运输过程中样品降解的风险。

病毒分离：可以通过狂犬病组织培养感染试验 （RTCIT） 或小鼠接种试验 （MIT） 来分离活病毒1,12。RTCIT 可以对各种样本类型进行，包括脑组织、唾液和脑脊液。它涉及使用特定细胞系，例如小鼠神经母细胞瘤细胞 （Neuro-2a）、人胚胎肾细胞系 （HEK-293）、鸡胚胎相关细胞或婴儿仓鼠肾细胞 （BHK-21）。这些细胞系为病毒的生长和复制提供了合适的环境，使其能够检测和分离 12,63,65,66。在 MIT 中，通过将临床样本脑内接种到 3-4 周龄的小鼠中分离出病毒；可以通过观察临床体征和对感染组织的实验室测试来检测病毒的存在 64,65,66。

然而，RTCIT 和 MIT 都有局限性，作为常规诊断技术可能不实用。在配备细胞培养设施的实验室中，应尽可能用 RTCIT 取代 MIT。细胞培养技术具有多种优势，包括避免使用活体动物、成本效益高和获得结果更快。

狂犬病的其他诊断测试：狂犬病的其他潜在诊断方式包括用于证明狂犬病病毒抗原和抗体的流式细胞术89、用于检测狂犬病病毒肽的基于质谱的蛋白质组学技术90 和生物传感器的利用82。然而，要使这些检测成为标准护理检测，必须进行彻底和广泛的验证。

诊断测试结果的解释：几个因素，包括病程、疾病的临床表现、唾液等临床样本中病毒的间歇性脱落、既往狂犬病疫苗接种和患者的免疫状态，都会影响狂犬病诊断检测的结果。死前检测，如病毒分离、病毒抗原检测和病毒 RNA 检测，更有可能在疾病早期产生阳性结果，然后中和抗体出现并导致组织“自动灭菌”10。

血清学诊断涉及检测 CSF 和/或血清中的病毒抗体，由于大多数受影响个体的狂犬病临床病程快速且短暂，因此其实用性有限。在疾病进展的后期，可能会产生可检测水平的抗体，这使得血清学检测对早期诊断的可靠性较低。然而，对于存活超过 1-2 周的个体，血清学检测对于确认诊断可能很有价值 7,8,12。

据报道，中和抗体的存在与临床样本中病毒 RNA 的检测呈负相关 7,8,12,13,25,54。此外，个体免疫接种状态也会影响用于病毒 RNA 检测的 PCR 检测结果。与未接种疫苗的人相比，在发病前至少接受过部分狂犬病疫苗接种的人不太可能出现 PCR 检测结果呈阳性7。

图 1 和图 2 提供了诊断算法以及用于死前和死后实验室确认狂犬病12 的推荐测试。

狂犬病实验室诊断的挑战

印度迫切需要分散狂犬病诊断设施，因为目前参与人类狂犬病诊断的实验室数量有限，如 NAPRE 第35 号文件所列。为了解决这个问题，NRCP 正在努力建立新的狂犬病诊断设施并增强现有实验室的能力。此外，在 COVID-19 大流行期间建立的实验室可以重新用于诊断其他传染病，包括狂犬病，以优化其利用。

狂犬病的死前实验室检测涉及几个可能影响结果和解释的因素，通常需要广泛或重复的检测来确认诊断。在班加罗尔 NIMHANS 的神经病毒学实验室进行的两项研究是世卫组织狂犬病转诊实验室，审计了从印度各地收到的临床样本，突出了与死前诊断相关的挑战。在这些研究中，40.6%（2012 年至 2014 年为 128 例）和 42.3%（2015 年至 2017 年为 130 例）的临床疑似狂犬病病例实现了死前实验室狂犬病确诊7,8。测试的有限敏感性归因于缺乏连续采样和无法测试多个临床样本。由于病例的地理分布，样本必须长途运输到实验室，这对维持冷链、影响样本质量和检测结果构成了挑战。这个问题在全年环境温度高的地区尤为严重。

狂犬病死前检测的一个主要局限性是阴性结果并不能排除该病的诊断 1,7,12。诊断的黄金标准是对死后获得的脑组织进行检测，然而，由于后勤、宗教、生物安全和其他考虑，这带来了重大挑战。

在尸检或开颅手术采集脑样本不可行的情况下，医生应意识到可以通过其他途径进行死后脑活检，确保考虑适当的诊断方案来确认或排除狂犬病的诊断。一种方法是使用 tru-cut 活检针通过眼眶或经鼻途径。另一种选择是使用腰椎穿刺针83,91 通过枕骨途径穿过枕骨大孔。

结论

实验室设施的分散是改善印度获得狂犬病诊断服务的一项关键战略。通过加强实验室基础设施和扩大其范围，印度可以加强公共卫生基础设施，改善传染病管理，并为到 2030 年消除人类狂犬病做出重大贡献。

除了诊断功能外，现代狂犬病实验室还应发挥多维作用，并积极整合“同一个健康”原则，为狂犬病病例的评估、规划和调查做出贡献。