韩国貉 （Nyctereutes procynoide koreensis） 接种了含有 ERAGS-GFP 毒株的新型狂犬病诱饵疫苗的保护性抗体反应

狂犬病是世界上最重要的人畜共患疾病之一，每年都威胁着很多人 [1]。大多数人类狂犬病病例是由患有狂犬病的动物咬伤引起的，因此可以通过动物疫苗接种 100% 预防。将狂犬病传播给人类的动物主要是狗，但包括浣熊、貉、獾、狐狸、猫鼬和蝙蝠在内的许多其他动物都与人类传播有关[2]。野生动物的疫苗接种是通过分发口服诱饵疫苗来实现的，这些疫苗旨在在不直接接种的情况下诱导免疫反应。

第一代商业口服狂犬病疫苗 （ORV） 毒株基于 SAG-2 毒株的高度减毒突变体，该突变体是使用抗狂犬病糖蛋白单克隆抗体从 SADBern 毒株中选择的 [3]。口服 SAG-2 毒株的狗和狐狸显示出对野生狂犬病病毒的有效免疫力 [3， 4， 5]。待开发的第二代 ORV 是重组载体疫苗，其中狂犬病病毒 （RABV） 的糖蛋白基因入牛痘病毒或人腺病毒 5 型载体中。自 1987 年以来，重组牛痘载体 RABORAL V-RG 诱饵疫苗（Boehringer Ingelheim， Ridgefield， CT， USA）已在全球范围内分发，并防止了浣熊狂犬病的扩大 [6]。重组腺病毒载体的安大略省狂犬病诱饵疫苗 （ONRAB；据报道，加拿大安大略省的Artemis Technologies Inc.公司也有效预防了野生动物（包括浣熊和狐狸）的狂犬病[7,8]。第三代 ORV 是基于高度减毒的狂犬病活病毒株开发的，该病毒株还包含一种或多种靶向基因组修饰，以防止恢复为毒力。基因工程狂犬病疫苗株 SPBN GASGAS （Rabitec；CEVA Sante Animale， Libourne， France）对狐狸和貉的治疗符合世界动物卫生组织 （WOAH） 制定的疗效要求 [9]。^®®®

在大韩民国 （ROK），犬介导的狂犬病是 1993 年之前人类狂犬病的主要原因；然而，通过对狗进行大规模狂犬病疫苗接种，狗介导的人类狂犬病已经消失。自 1993 年以来，从韩国非军事区向南迁移的貉 （Nyctereutes procynoide koreensis） 负责将狂犬病传播给韩国的人类和动物 [10]。从 1993 年到 2023 年，韩国报告了 7 例人类狂犬病和 486 例动物狂犬病病例，其中大部分与野生貉子有关 [11]。为了阻断貉子介导的狂犬病，自 2000 年以来，韩国兽医当局一直在向狂犬病风险地区分发第二代 ORV，该病毒载体含有表达狂犬病病毒糖蛋白基因 （V-RG） 的减毒（“改良活体”）重组痘苗病毒载体。这种分发狂犬病诱饵疫苗的政策使韩国几乎消除了动物狂犬病 [11]。然而，韩国貉可能已经学会了如何在不摄入蜡包埋的 V-RG 抗原的情况下食用诱饵配方。在分发诱饵疫苗的地区捕获的貉子中，只有 13.7% 具有狂犬病抗体 [12]。此外，有报道称，两名暴露于 V-RG 抗原的女性患上了慢性皮肤病 [13]。因此，需要一种更安全且可以提高貉子中狂犬病中和抗体水平的新型狂犬病诱饵疫苗。

基于重组技术，我们之前报道了表达绿色荧光蛋白的重组狂犬病病毒 （ERAGS-GFP） 毒株的产生，这是一种表达绿色荧光蛋白的重组狂犬病病毒，其中表达绿色荧光蛋白基因，位于狂犬病糖蛋白第 194 位和第 333 位的氨基酸被替换 [14]。在这项研究中，研究了 ERAGS-GFP 毒株在小鼠、豚鼠、狗和貉子中的安全性。ERAGS-GFP 毒株在哺乳小鼠中回传 5 次，以评估毒力恢复。此外，还评估了 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的摄取和免疫原性以及保护性免疫的持续时间。

口服狂犬病疫苗接种计划在阻止或减少狂犬病在野生动物中的传播方面非常有效 [16]。ORV 中使用的 RABV 毒株必须证明在目标和非目标动物中是安全的。所有温血动物都容易受到 RABV 的影响，人类或飞机可以直接或间接将 ORV 递送给目标动物，例如狐狸或貉子。当作为预防措施的 ORV 分发到狂犬病风险地区时，只有狐狸或貉子不会食用 ORV。因此，狂犬病诱饵疫苗的安全性对于目标动物和非目标动物都至关重要。SAG-2 诱饵疫苗的安全性在目标动物（如狐狸和貉）和非目标动物（如野生食肉动物和啮齿动物物种）中得到证实 [17， 18]。为了证明 AdRG1.3 ONRAB 毒株的安全性，在加拿大，对三种类型的狂犬病媒介动物（如红狐、浣熊和条纹臭鼬）和实验动物直接口服高剂量的 ONRAB 毒株，未观察到临床症状 [19]。最近的口服狂犬病诱饵疫苗 SPBN GASGAS 毒株的安全性也通过口服给药后粪便排泄 8 种不同的靶标和非靶标物种来证明：接种疫苗 7 天后，在 6.5% （50/758） 的粪便样本中检测到病毒 RNA，但在 PCR 阳性粪便样本中未发现感染性病毒 [20]。在我们的研究中，ERAGS-GFP 毒株的安全性通过肌肉注射小鼠、豚鼠、狗和貉狗 10 剂 （10^8.0TCID₅₀/mL） 的 ERAGS-GFP 毒株。此外，ERAGS-GFP 毒株在 1 日龄的乳鼠中传代 5 次后也没有表现出致病性，这表明 ERAGS-GFP 毒株的非致病性可能是由于与致病性相关的糖蛋白的氨基酸 333 处精氨酸被谷氨酸取代 [21， 22]。ERAGS-GFP 毒株的糖蛋白基因在小鼠中反向传代 5 次未发生突变，表明 ERAGS-GFP 毒株不太可能在田间环境中恢复致病性。因此，ERAGS-GFP 毒株的安全性已被确立为用作新型口服狂犬病诱饵疫苗株的基础。

ORV 由吸引目标动物的诱饵和含有狂犬病疫苗株的聚乙烯包装组成。ORV 的这些成分可能会影响狂犬病诱饵疫苗的疗效。因此，应在目标动物中评估乙烯基包装中的最小有效剂量和诱饵疫苗的摄取百分比。目前使用 SAG-2、V-RG、AdRG1.3 或 SPBN GASGAS 毒株的 ORV 包含超过 10 ^8.0TCID₅₀每袋 [10， 13， 17， 23]。在这项研究中，貉接种了含有 10^5.0TCID₅₀/mL 开发的平均 VNA 滴度为 6.1 IU/mL，表明该疫苗可以保护目标动物。尽管如此，考虑到生产过程中的损失和诱饵疫苗的长期稳定性，生产 ERAGS-GFP 诱饵疫苗所需的最小有效剂量被确定为 10^7.0TCID₅₀/mL 或更高。

影响 ORV 疗效的另一个因素是诱饵疫苗的采用。诱饵必须具有足够的吸引力，以便目标动物食用，因为狂犬病免疫力的传递取决于貉子是否刺穿诱饵疫苗内的聚乙烯包装[24]。由于每种食肉动物的食物偏好不同，因此开发新的 ORV 需要评估目标动物的疫苗接种情况 [25]。商业 ORV 的采用因应用的动物、地区和调查期而异。据报道，浣熊对 V-RG 和 SAG-2 诱饵疫苗的摄取率分别为 79.3% 和 59%-100% [10， 26]。我们的结果表明，貉对 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的接受率为 75.8% （163/215），与 SAG-2 诱饵疫苗相似。

由于传播狂犬病的媒介动物物种因地区而异，因此应在感兴趣的目标动物中评估 ORV 的免疫原性。接种 SAG-2 诱饵疫苗的貉子在接种疫苗 60 天后产生的 VNA 滴度为 6.59-19.9 IU/mL [7]。在分发 V-RG 和 ONRAB 诱饵疫苗的地区，分别有 38% 和 51% 的常驻浣熊显示出 RABV 阳性抗体 [27]。我们的结果表明，接种 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的貉子在给药 4 周后的平均 VNA 滴度为 4.23 IU/mL。然而，接种 V-RG 疫苗的貉子的 VNA 滴度低于接种 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的浣熊，为 1.96 IU/mL。这可能是由于貉子之间摄取率的差异，尽管如此，貉子施用 2 种类型的 ORV 超过了 0.5 IU/mL 的保护性 VNA 滴度。这表明已经接种了 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的貉子受到保护，免受有毒 RABV 的攻击。世界卫生组织和 WOAH 的目标是到 2030 年消除狗介导的人类狂犬病。然而，我们没有评估 ERAGS-GFP 诱饵疫苗在狗中的免疫原性。因此，需要对接种 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的狗进行进一步研究。

总之，ERAGS-GFP 诱饵疫苗株在乳鼠、豚鼠、狗和貉子中是安全的。貉接种 ERAGS-GFP 诱饵疫苗的摄取率高达 75.8%，狂犬病 VNA 滴度高，免疫力维持 4 个月。因此，ERAGS-GFP 诱饵疫苗有望有助于消除貉子的动物狂犬病。