关于狂犬病的 One Health Lens：马拉维利隆圭农村狂犬病病毒的人类-蝙蝠相互作用和基因组见解

1. 引言

狂犬病是一种致命的人畜共患病毒性疾病，主要影响非洲、亚洲和拉丁美洲的人类、家畜和野生动物。经典狂犬病病毒 （RABV） 属于 Lyssavirus 属，是狂犬病的病原体 [1]。RABV 基因组是一种单链负链 RNA，编码该序列中的五种结构蛋白：核蛋白 （N）、磷蛋白 （P）、基质蛋白 （M）、糖蛋白 （G） 和 RNA 聚合酶 （L） [2]。核蛋白负责 RNA 的封装和转录 [3]。磷蛋白与 N-RNA 模板结合，通过与细胞质动力蛋白链相互作用有助于病毒核衣壳的运输 [4]。基质蛋白下调病毒转录并有助于细胞致病机制 [5]。糖蛋白是病毒附着于宿主细胞和致病性的关键 [6]。L 蛋白是核蛋白核心中的一种聚合酶，对 RNA 转录和复制至关重要 [2]。RABV 通过受感染动物（尤其是患有狂犬病的狗）的咬伤或抓伤传播 [7]。狂犬病每年导致全球约 59,000 例死亡，其中非洲和亚洲占病例的 95% 以上 [8]。

食肉目（豺）和手翅目（蝙蝠）中的一些物种被认为是狂犬病病毒的宿主[9]。除了RABV，在蝙蝠科和其他蝙蝠物种中也发现了一系列狂犬病相关裂解病毒（RRV）[10]。其中包括尼日利亚的拉各斯蝙蝠病毒、肯尼亚的 Shimoni 蝙蝠病毒和南非的 Duvenhage 病毒 [11]。非洲的RABV分为谱系1、1a、1b、2、3和4[12]，分别分布在北非、东非和南部非洲、西非和中非、南部非洲和埃及[13]。根据Kainga等[14]的研究，马拉维的RABV毒株属于非洲1b谱系；然而，这一结论仅基于单个 N 和 G 基因 [14]。

马拉维的狂犬病病毒主要由受感染的狗 （Canis familiaris） 通过叮咬传播，感染其他宿主，包括人类 （Homo sapiens） 和牛 （Bos indicus）。据估计，马拉维每年有 500 人死于人类狂犬病 [8]，儿童是受影响最大的人群 [15]。从 2008 年到 2021 年，马拉维报告了 683 例非人类确诊狂犬病病例，其中最多的是家犬 （n = 435），其次是牛 （n = 94）。在马拉维的食虫蝙蝠中也有 RABV 的记录 [14]。与许多国家一样，马拉维农村地区的畜牧业与人密切共存，家庭结构通常允许家畜和野生动物进入食物和住所[16]。在这些社区中，蝙蝠肉被认为是一种美味佳肴，而蝙蝠狩猎的程度较低，这表明这些人与蝙蝠互动背后缺乏知识。此外，在首都利隆圭的城郊地区也观察到了蝙蝠的栖息地[17]。总之，这些观察结果突出了人类、家畜和野生动物之间不断缩小的差距，从而增加了暴露于 RABV 的风险。

这些例子强调了 One Health 方法对理解人类、动物和环境健康的重要性 [18]。“同a健康”监测对于研究人类-蝙蝠相互作用如何导致RABV和其他狂犬病病毒在人类-野生动物界面处从动物溢出到人类种群至关重要[19,20]。将基因组和流行病学数据整合到 One Health 框架内，通过深入了解在动物和人类之间传播的 RABV 毒株，加强狂犬病监测。本研究为制定跨人类和动物种群的协调多部门控制策略提供了基线流行病学数据。马拉维的研究工作主要集中在人类和牲畜的健康上，很少关注野生动物，特别是蝙蝠。马拉维以往对RABV的基因组研究主要集中在单个基因上[14]，但迄今为止尚未进行全长病毒基因组分析。在这里，我们首次对马拉维传播的人类、家养和野生动物宿主的 RABV 进行了全基因组分析。

2. 材料和方法

3. 数据分析

4. 结果

5. 讨论

狂犬病仍然是应该重大的公共卫生挑战，狗是主要的感染源。然而，蝙蝠越来越被认为是人畜共患病原体（包括狂犬病病毒）的宿主，人类与蝙蝠的相互作用推动了病原体溢出事件[32,33]。本研究调查了马拉维农村社区的人与蝙蝠互动，包括相关知识和实践。我们还研究了蝙蝠中的狂犬病病毒，并使用 WGS 表征了来自人类和家养宿主的狂犬病病毒。通过结合社区层面的见解和基因组分析，本研究旨在加强对狂犬病流行病学的理解，并为有效的预防和控制策略提供信息。这些发现进一步旨在支持全球狂犬病控制工作，并推进 One Health 方法来对抗人畜共患疾病。

本研究表明，一半的受访者报告了与蝙蝠的各种形式的互动，包括使用蝙蝠洞进行传统医学和食用蝙蝠。然而，只有不到一半的人知道蝙蝠可能是人畜共患感染的来源。这些发现与在坦桑尼亚进行的一项研究一致，该研究57.5%（187/325）的参与者报告与蝙蝠有接触，但只有4%的参与者认为蝙蝠可以传播狂犬病[34]。肯尼亚和危地马拉也进行了类似的观察，危地马拉报告说，尽管该国有记录显示存在狂犬病，但 90% 的受访者对蝙蝠的狂犬病知之甚少或一无所知 [35,36]。蝙蝠介导的狂犬病暴露虽然罕见，但在苏格兰[37]、肯尼亚[35]和南非[38]已导致死亡。

在非洲进行的多项研究一致记录了人类与蝙蝠的互动模式，主要是通过狩猎和传统医学来驱动的[39,40,41,42]。本研究中观察到的人类与蝙蝠的互动进一步与文献一致，特别是Wright等人的一项研究，其中报道全球暴露于蝙蝠的模式是有意为之的，并且通常与家庭活动有关[43]。教育成为塑造知识和行为的重要因素，参与者表现出更高的意识并采取更安全的做法证明了这一点，这与在马拉维 [44]、孟加拉国 [45] 和韩国 [46] 进行的研究观察一致。此外，在非洲和亚洲进行的大量研究结果证实了与人类-蝙蝠互动相关的知识和实践存在重大差距，职业被认为是a关键因素[16,47,48]。

目前的研究表明，报告蝙蝠没有进入他们的住所的受访者不太可能与蝙蝠互动。这意味着住宅内有蝙蝠会显着增加蝙蝠接触的可能性，而室内没有蝙蝠是防止蝙蝠接触的保护因素。这一发现与在肯尼亚农村地区进行的一项研究一致，在该研究中，人类和蝙蝠使用同一栋建筑导致频繁的相互作用，从而增加了病原体溢出的风险 [49]。塞拉利昂的另一项研究表明，人类活动，如居住在蝙蝠栖息地附近或蝙蝠栖息的建筑物内，增加了人与蝙蝠相互作用的可能性，从而增加了暴露于蝙蝠病原体的可能性[50]。这些发现强调了采取措施密封家中的任何蝙蝠入口点以减少这些互动并减轻健康风险的重要性。采用 One Health 方法，整合人类、动物和环境卫生部门的努力，可以加强监测，促进社区教育，并加强合作，以解决观察到的风险因素并防止潜在的溢出事件。

在北非进行的一项研究未在蝙蝠样本中检测到狂犬病病毒 [11]。同样，在比利时的另一项研究中，在蝙蝠唾液样本中未检测到狂犬病病毒[51]。这些发现证实了本研究的结果，其中通过 RT-PCR 在蝙蝠样本中未检测到 lyssavirus 基因组。相反，西班牙的一项研究表明血丸中存在狂犬病病毒抗体，使用 RT-PCR 对脑和血液样本的检测结果进一步证明呈阳性 [52]。在蝙蝠样本中未检测到 lyssavirus 可能是由于本研究的样本量有限。检测狂犬病病毒可能具有挑战性，因为感染可能是散发的，病毒载量可能会波动，从而导致可能低估蝙蝠种群的患病率[51]。溶菌病毒在蝙蝠中的散发性和波动性表明狂犬病传播风险不同。建议进行评估 bat 到人类传播率的研究，这对于准确量化这种风险至关重要。此外，在雨季进行了采样，雨季的特点是凉爽到中等的温度和接近冬季冬眠的 Miniopteris natalensis 蝙蝠。以前的研究已经注意到蝙蝠狂犬病发生的季节性影响，据报道，旱季的狂犬病发病率更高[39,53]。在喀麦隆和巴西，已经观察到狂犬病蝙蝠在旱季迁徙到群体中，以及蝙蝠种群中狂犬病感染的波动和周期性模式[54,55]。这些观察结果表明，狂犬病检测研究在病毒活动和传播风险可能较高的旱季可能更有效。

核蛋白在任何 RABV 毒株中都是高度保守的。关键位点，包括 Ser_389、酪蛋白型磷酸化和抗原位点 I、B 细胞表位和 IV，在马拉维毒株和其他非洲 RABV 毒株中都是保守的 [56]，表明该地理区域中常见的宿主-病毒相互作用形成了进化限制。此外，MW3 毒株的 RNA 结合结构域（氨基酸 298-352）在 322 位 （Iso322Val） 表现出异亮氨酸到缬氨酸的取代，这种突变也在欧洲蝙蝠溶氨酸病毒 2 （EBLV-2；GenBank #A4UHQ3）、PV （GenBank #P06025） 和中国 MRV 毒株 （GenBank #Q0GBY4），表明由环境或宿主压力驱动的趋同进化。这种替换值得注意的是它在适应性进化中的潜在影响，因为它可能会增强特定生态条件下和跨物种感染下的 RNA 结合或复制效率，因为狂犬病病毒的类似变化表明适应性可能影响宿主范围和人畜共患潜力 [57\u201258]。

可变结构域 1 （VD1） 中存在 Glu71 和 Thr72，可变结构域 2 （VD2） 中存在 Pro140，这突出了马拉维毒株的不同进化轨迹，对功能特化具有潜在影响，例如在免疫逃避或宿主因子相互作用中的作用以及致病性和宿主范围，因为磷蛋白（P 基因）的变化可能会影响与宿主细胞机制的相互作用， 特别是干扰素拮抗作用。马拉维 RABV 毒株编码a 212 aa M 基因，比印度、RC EH 和 DRV 中国毒株长 10 个氨基酸。MW 毒株与从食虫蝙蝠中分离的澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒 （Q9QSP2） 也有 85% 的相似性 [30]。这种相似性可能表明，尽管地理和宿主存在差异，但两种病毒都保留了这些额外的氨基酸，以适应相似的选择压力[57,58]。进一步的比较研究可以阐明这些附加氨基酸在基质蛋白中的功能作用。

糖蛋白对于促进病毒-宿主相互作用至关重要，影响致病性和跨越物种屏障的能力 [6]。它还会触发免疫系统产生中和抗体，这对于针对病毒的保护性免疫至关重要 [59]。鉴于这种重要性，糖蛋白一直是分子流行病学研究的重点[60]。MW 毒株沿 G 基因显示几个独特的替换，包括抗原位点 IIb 和细胞质结构域。这些替代品可能会改变疫苗诱导免疫反应的有效性，这凸显了进一步研究的必要性，以持续监测这些替代品并了解它们对疫苗功效的影响 [59] 以及它们增强毒株以跨越物种屏障的能力，从而给公共卫生带来额外的挑战。

L 蛋白对转录和复制至关重要 [2]，在马拉维毒株中表现出保守的基序，包括 GHP 基序（氨基酸 372-374）、用于模板识别的结构域 II（氨基酸 544-563）、用于 RNA 聚合酶活性的结构域 III（氨基酸 728-731）和结构域 VI（氨基酸 1704-1709），一种与蛋白激酶活性相关的富含甘氨酸的基序 （GXGXXG） [3]].这些区域的保守性强调了它们在病毒复制和聚合酶功能中的关键作用，突出了它们作为抗病毒开发靶标的潜力，以抑制 RABV 毒株之间的 RABV 复制，并为 RABV 毒株之间的遗传相关性和进化限制提供系统发育见解。

使用来自多个国家和马拉维的完整基因组序列的系统发育分析证实了最近使用部分 N 基因序列对马拉维 RABV 进行的分子流行病学研究的结果 [14]，并与来自同一地理区域的病毒聚集在一起的观察结果一致 [56,61]。此外，MW03_human 和 MW36_cow 与 MW18_dog 的氨基酸相似性分别为 99% 和 92%，这与之前在赞比亚和津巴布韦进行的一项研究一致，尽管宿主和区域不同，但样本却紧密聚集 [57]。同样，约旦的一项研究发现，病毒狗基因组与以色列牛的病毒相似度>98.8%[62]。这凸显了家犬在 RABV 传播周期中的关键作用。在马拉维及其邻国的背景下，文化的相似性以及没有物理障碍为人类和动物的跨境流动提供了便利，这可能有助于病原体的跨境传播[14]。由于本研究中使用的序列样本量小，这方面无法评估，但为未来的研究奠定了基础。这强调了“同a健康”方法和区域合作在狂犬病控制方面的重要性，并进一步表明需要协调多部门监测和疫苗接种计划，以有效防止狂犬病在该地区的传播。

这项研究有一些局限性：社区调查的回复率低，而且主要是女性参与。数据收集是在雨季进行的，社区的大多数居民是从事临时工的农民；大多数家庭都是女性当家的，因为男性不在。这些可能会影响泛化性和代表性；然而，研究结果仍然与类似情况相关，在外推到更广泛的区域时应谨慎考虑。

6. 结论

尽管这项研究未能在从利隆圭农村收集的蝙蝠样本中检测到狂犬病病毒，但为马拉维人与蝙蝠的相互作用、人畜共患风险和 RABV 的分子特征提供了重要见解。它确定了公众意识和促进人畜共患疾病传播的危险行为方面的重大差距，强调了有针对性的教育和社区层面干预措施的必要性。马拉维 RABV 毒株的遗传分析强调了病毒进化和控制的复杂性，保守的功能域在病毒适应性中发挥作用，独特的取代可能影响宿主相互作用和免疫反应。这些发现强调了区域监测以监测 RABV 和相关狂犬病病毒的重要性，开发区域特异性疫苗以解决毒株特异性变异，以及采用 One Health 方法来减轻跨物种和区域传播风险。对遗传特征和传播动力学的进一步研究对于改进马拉维及其他地区的狂犬病控制策略和加强公共卫生举措仍然至关重要。

作者贡献

W.M. 构思了这项研究，W.M.、E.C. 和 H.K. 收集了样本，N.S. 和 W.M. 进行了实验室和数据分析，H.S. 提供了财政支持，N.S. 准备了原稿，W.M.、H.S.、H.K.、E.C.、J.N.、G.N.、J.C. 和 R.T. 审查和编辑了手稿。所有作者均已阅读并同意手稿的已发表版本。

机构审查委员会声明

本研究中狩猎、取样野生动物以及分析存档和收集样本的适当许可证来自马拉维国家公园和野生动物部（参考编号 DNPW 2014 年 10 月 10 日）。

知情同意书

已获得参与研究的所有参与者的知情同意。

数据可用性声明

当前研究期间使用和/或分析的数据集可应合理要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

资助声明

这项研究由日本文部科学省 （MEXT） 资助；日本医疗研究与开发机构 （AMED） 的日本传染病研究和基础设施计划 （JIDRI） （JP23wm0125008）；AMED （JP23fa627005）；以及可持续发展科学技术研究伙伴关系 （SATREPS） 框架内的日本国际协力机构 （JICA） （JP22jm0110019）。