用肌肉靶向脂质纳米颗粒配制的狂犬病病毒 G 蛋白 mRNA 在小鼠体内的免疫原性

This entry is part 124 of 124 in the series 狂犬病疫苗

Immunogenicity of Rabies Virus G-Protein mRNA Formulated with Muscle-Targeting Lipid Nanoparticles in Mice

Qin Li 1, Huarong Bai 1, Xueliang Yu 1, Qiang Liu 1, Rongkuan Hu 1

Starna Therapeutics Co.， Ltd.，中国苏州 215123

通信应收件人的作者。

疫苗 2025， 13（3）， 217；https://doi.org/10.3390/vaccines13030217

收到意见书： 2025 年 1 月 7 日 / 修订日期：2025 年 2 月 11 日 / 录用日期： 2025-02-12 / 出版日期：2025 年 2 月 22 日

（本文属于特刊 mRNA 疫苗：开创疫苗接种的未来)

摘要

背景：狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引起的一种可预防的人畜共患疾病，死亡率高。大多数已上市或正在开发的疫苗都存在单剂量中和滴度低、工艺复杂、成本高等问题。在 COVID-19 大流行期间，mRNA 疫苗的成功开发为预防性疫苗开辟了一条新的途径。作为一项新技术，mRNA 具有更高的可扩展性。方法：在这项研究中，我们设计了一种编码 RV-G 蛋白的 mRNA，由我们自己的肌肉靶向脂质纳米颗粒（LNP）封装，并评估了 RV-G 蛋白的体外表达、免疫原性和体内对病毒感染的保护作用。结果：结果显示 RV-G mRNA 在体外显著表达。用 RV-G mRNA-LNP 免疫诱导高病毒-IgG 结合滴度和病毒中和抗体滴度（VNT）。此外，我们的结果表明，RV-G mRNA 疫苗在小鼠中优于市售疫苗。结论：我们的研究强调了 mRNA-LNP 平台在开发下一代狂犬病疫苗方面的潜力。

关键词：

狂犬病病毒；mRNA 疫苗；肌肉输送；脂质纳米颗粒

1. 引言

狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引起的致命疾病。RABV 侵入宿主的中枢神经系统并引起病理变化。病毒一旦生效并出现症状，就无法通过免疫系统或任何药物消除，致死率接近 100%。几十年来，传统的狂犬病疫苗一直是预防这种致命疾病的基石。

RABV 具有单链 RNA 基因组和五种结构蛋白，包括糖蛋白（G）、核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）和病毒 RNA 聚合酶（L） [1]。其中，G 蛋白是 RABV 病毒粒子中唯一表面暴露的病毒蛋白。它负责与宿主细胞受体结合并促进病毒进入宿主细胞。G 蛋白还在宿主中引发免疫反应，是刺激病毒中和抗体的主要靶蛋白 [2]。所有其他成分在病毒的复制和发病机制中起着至关重要的作用。

该疾病一直是一个重要的公共卫生问题，迄今为止尚无有效的治疗方法。目前，预防主要通过疫苗接种。市售狂犬病疫苗主要有两种类型：灭活狂犬病疫苗和减毒狂犬病疫苗。灭活狂犬病疫苗是世界上最常见和应用最广泛的疫苗。狂犬病病毒是通过在细胞培养物中培养狂犬病病毒产生的，例如人二倍体细胞（HDC）、鸡胚成纤维细胞和Vero细胞[3,4,5,6]。病毒生长后，使用化学物质灭活，并确保病毒不再能够引起疾病。但是，灭活疫苗的成本很高，而且剂量过程相对繁琐。主要原因是产生的狂犬病病毒滴度低，需要多次注射才能达到更高的滴度才能获得满意的保护效果。此外，狂犬病减毒疫苗主要用于野生动物和动物的疫苗接种。迄今为止，新型 DNA 疫苗、mRNA 疫苗和病毒载体疫苗已被评估为在临床前环境中预防狂犬病感染，但这些疫苗尚未获批用于人类 [7,8,9]。

信使RNA（mRNA）疫苗代表了一种革命性的方法，受到了学术界和工业界的极大关注，尤其是在COVID-19大流行期间，显示出巨大的前景，并为疫苗开发和大流行防范开辟了新的途径[10,11]。mRNA 疫苗的工作原理是将 mRNA 分子引入体内，在那里它们作为产生特定抗原的模板。然后，这些抗原会触发免疫反应，使身体将来能够识别和防御病毒。与传统疫苗不同，mRNA 疫苗不含活病毒或灭活病毒，降低了导致疾病的风险，并具有快速开发和生产的潜力，因为制造过程不依赖于细胞培养。目前，有几项关于狂犬病 mRNA 疫苗开发的研究。CureVac 对其 mRNA 狂犬病疫苗在猴子模型中的保护功效进行了临床前研究。结果表明，与灭活疫苗 Rabipur 相比，mRNA 疫苗可以诱导更高水平的中和抗体并产生更广泛的反应性抗体保护 [12]。LVRNA001，由 Liverna 开发的 mRNA 狂犬病疫苗，只需接种两剂即可提供 100% 安全有效的免疫保护 [13]。另一项研究介绍了一种新设计的 LNP-mRNA 狂犬病疫苗，该疫苗在低剂量的恒河猴和小鼠中表现出优异的性能 [14]。mRNA 疫苗诱导的强烈免疫反应表明，它们在预防人类和动物狂犬病方面具有巨大潜力，并且有可能以更少的剂量获得更好的免疫原性和保护作用。

在这项研究中，我们开发了一种基于 mRNA 的狂犬病疫苗。这种方法在小鼠中产生了高滴度的病毒中和抗体和病毒 IgG 结合抗体，并在随后的攻击实验中显示出有效的保护功效。

2. 材料和方法

2.1. 细胞系

来源于中国北京中国科学院细胞库的 HEK293T 细胞和由西湖大学捐赠的 cos.7 细胞在补充有 10% FBS（Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和 1% 青霉素-链霉素（Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）的 DMEM（HyClone，美国犹他州洛根）中培养。两种细胞系均在无菌条件下维持，并在 37 °C 和 5% CO 的温度下孵育₂.

2.2. mRNA 设计和制备

UTR 对选自 Starna 专有的 UTR 库。RV-G mRNA 的编码序列是通过对从 GenBank （CTN-1 毒株，登录号：AY009100.1）检索的 RV-G 序列进行简单的密码子优化获得的。用于体外转录的 DNA 模板的构建由 GeneScript（中国南京）进行。对于 mRNA 制备，该过程从使用 T7 高产量 RNA 转录试剂盒（Thermo， Waltham， MA， USA， K0441）的体外合成开始。然后使用 Monarch RNA 纯化试剂盒（NEB，Ipswich，MA，USA）纯化所得的 mRNA。

2.3. 脂质纳米颗粒制备

RV-G mRNA-LNP 制剂采用专有方法制备。将脂质组分（每个组分具有确定的摩尔比）溶解在乙醇中，并在 pH 值为 4.0 的 10 mM 柠檬酸盐缓冲液中制备 RNA。合成过程采用微流控技术，乙醇与水相体积比设置为 3：1，流速比为 1：3。随后，在 1× PBS 中进行透析步骤 2 小时以精制制剂。

2.4. mRNA 转染

转染前 1 天，将 HEK-293 细胞接种在 96 孔板或 6 孔板中。转染当天，使用 Lipo2000 作为转染试剂，用 100 ng 或 4 μg 荧光素酶或 RV-G mRNA 处理细胞。孵育 24 小时后，收获细胞。通过荧光素酶测定荧光素酶活性，随后通过 Western blot 和 FACS 分析检测 RV-G 蛋白的表达。

2.5. 荧光素酶测定

根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega， Madison， WI， USA， E1910）进行荧光素酶测定。收获使用 Lipo2000 转染荧光素酶 mRNA 的细胞，去除上清液，用 100 μL PBS 缓冲液冲洗细胞一次，然后弃去缓冲液。然后，加入 105 μL 预稀释的裂解缓冲液覆盖细胞，并在室温下孵育 15 分钟。随后，将 96 孔板以 13,000 rpm 离心 5 分钟。将上清液小心转移至 96 孔检测板中，每孔 30 μL 等分试样，每个样品一式三份测定。最后，在黑暗中向每个孔中加入 30 μL 荧光素底物，并使用酶标仪（TECAN SPARK，Mannedorf，瑞士）读取发光值。

2.6. 蛋白质印迹

收获使用 Lipo2000 转染 RV-G mRNA 的细胞，并使用 Bradford 测定法测量总蛋白浓度。随后，向样品中加入 1× SDS 上样缓冲液，然后进行 SDS-PAGE 并转移到 PVDF 膜上。用含有 5% （w/v）脱脂奶粉的 TBST 封闭膜，并与一抗（绝对抗体，Ab02097-3.0）在室温下孵育 2 小时。之后，将它们与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（Jackson ImmunoResearch， Lancaster， PA， USA， 115-035-003）在 37 °C 下孵育 1 小时。用 1× PBST 洗涤 3 次后，使用显影液（Tanon， Shanghai， China， 180-5001）显影印迹。使用 Tanon 4200 成像系统捕获生成的图像。

2.7. 小鼠免疫程序和挑战

经过 3 天的适应期后，肌肉注射 6 只 6-8 周龄的 Balb/C 小鼠组（i.m.），注射 50 μL 不同的 RV-G MRNA-LNP 制剂，每组含有 5 ΜG MRNA。在注射后 7 天和 14 天收集血浆和血清样本进行血清学检测。

对于 R-G MRNA-LNP 的暴露前保护研究，小鼠在免疫程序后 14 天脑内注射 100 倍于 50% 致死剂量（LD50）的 RABV CVS-24 毒株。在第 14 天收集血清用于中和测定和测定病毒 IgG 结合滴度。

在 RV-G mRNA-LNP 的暴露后保护研究中，小鼠在免疫程序前 6 小时脑内注射 100 倍的 RABV CVS-24 毒株 50% 致死剂量（LD50）。在第 14 天收集血清用于中和测定。攻击感染后，每日监测小鼠的存活率和体重变化。

2.8. 炎症细胞因子和生化测试

使用 ELISA 试剂盒（Abcam， Cambridge， UK， #ab282874， #ab222503， #ab208348）分析血清样本的炎症生物标志物（IFNγ、IL-6 和 TNF-α）。使用自动生化分析仪（HITACHI 7100+ISE）进行血浆生化测试。

2.9. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

使用 ELISA 方法评估免疫血清中的 IgG 滴度。ELISA 板包被狂犬病病毒的重组 G 抗原（终浓度：2 μg/mL）（ABMAX Biotech，中国北京，AK100H1 月），并在 4 °C 下孵育过夜。用 PBST 洗涤两次后，在 37 °C 下用含有 2% BSA 的 PBS 封闭步骤后，将板与稀释的血清一起孵育 2 小时。随后，将板与 HRP 偶联的兔抗小鼠二抗（Abcam，Cambridge，UK，ab6728）在 37 °C 下再孵育 2 小时，以使用 TMB 底物测量抗体与 RV-G 蛋白的特异性结合。

2.10. 中和测定

狂犬病病毒攻击病毒标准株（CVS-11）在 BSR 细胞上繁殖，并遵循 Reed-Muench 方法用于实验。用 DMEM 将标准血清（获得自英国赫特福德郡国家生物标准与控制研究所）稀释至 0.5 IU/mL 浓度。向 96 孔板的每个孔中加入 100 μL DMEM 培养基，然后在第一孔中加入 50 μL 供测血清、标准血清或阴性对照血清。随后，对板进行 3 倍梯度稀释。测试血清通过第 9 孔稀释，标准血清和阴性血清通过第 6 孔稀释，从最终色谱孔中弃去 50 μL。用 DMEM 将 CVS-11 病毒稀释至每 50 μL 100 FFU 的浓度，并将 50 μL 该病毒稀释液添加到含有血清的每个孔中。然后，加入 100 μL 含有 2 × 10⁴ 的 BSR 细胞悬液向每个孔中加入细胞并在 5% CO2 中孵育在 37 °C 下培养 60 小时。

然后从 96 孔板中取出培养基，用预冷的丙酮在 -20 °C 下固定孔 30 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次。将板与狂犬病病毒核蛋白特异性的 FITC 偶联抗体（Novus， Centennial， CO， USA， NBP3-33166F）在 37 °C 下孵育 45 分钟。弃去抗体孵育液并用 PBS 洗涤 3 次后，在荧光显微镜下观察细胞。荧光的缺失记录为 “-”，而一个或多个荧光细胞的存在记录为 “+”。相应地测定中和抗体滴度。使用 Reed-Muench 方法计算病毒中和抗体滴度（VNT）。

2.11. 数据分析

使用适用于 Windows 的 GraphPad Prism 8.0.2 版（GraphPad Software， Inc.， La Jolla， CA， USA）进行数据分析。采用 T 检验评估统计学意义。使用 Kaplan-Meier 生存曲线评估攻击后生存率的统计意义。统计显著性的阈值表示如下：* p < 0.05，** 表示 p < 0.01，*** 表示 p < 0.001，*** 表示 p < 0.0001；“ns” 表示无显著差异。

3. 结果

3.1. RV-G mRNA 的优化

基于图 1A 所示的 mRNA 的关键元件，我们优化了 RV-G mRNA 序列。我们最初在 Starna 专有的 UTR 库中筛选了合适的 UTR 对。这些 UTR 对包括自然序列、优化序列、AI 生成的序列和从头设计的序列。UTR 对的完整列表可在表 S1 中找到。选择 UTR 对后，我们采用荧光素酶序列作为编码区进行初步筛选，利用其简单的作。将不同的 UTR 对掺入荧光素酶 mRNA 中，然后将其转染到 cos.7 细胞中，并测量荧光素酶（luc）活性。结果显示，所有 UTR 对中都具有出色的荧光素酶表达（图 1B），表明所有 UTR 对在整合到荧光素酶 mRNA 中时都非常有效，其中 P14 是最好的配对。

图 1.RV-G mRNA 序列的优化：（A）合成 mRNA 的关键要素；（B）基于荧光素酶序列的 UTR 对筛选结果；（C）基于荧光素酶序列的 PolyA 优化结果；（D）三种 RV-G RNA 变体的 RV-G 蛋白表达；（E）血清中的病毒中和抗体滴度。

随后，我们筛选了不同类型的 polyA 用于其应用。候选者包括全长 polyA 和片段化 polyA。具体序列如表 S1 所示。结果表明，片段化的 polyA 显示出更高的表达水平（图 1C）。到目前为止，我们筛选出了首选的 UTR 配对和 polyA。

之后，我们用三个优化的 RV-G RNA 序列替换了荧光素酶序列（表 S2）。将这些 RV-G RNA 变体转染到 HEK293T 细胞中，并采用 Western blot 分析检测 RV-G 表达。研究结果表明，RV-G-1、RV-G-2 和 RV-G-3 中 RV-G 的表达水平明显高于 HEK-293T 细胞中的空白对照，证实了这些 RV-G RNA 构建体成功表达 RV-G 蛋白（图 1D）。在体内实验中，单次注射 5 μg 后，RV-G-3 RNA 诱导的中和抗体滴度远高于 RV-G-2 RNA 激发的抗体滴度（图 1E）。因此，我们选择了 RV-G-3 RNA，它表现出更好的蛋白质表达和更高的中和抗体滴度，用于进一步研究。

3.2. 肌肉靶向 LNP 制剂筛选

为了筛选靶向肌肉的 LNP 制剂，我们介绍了五种不同的制剂，并评估了体内表达和安全相关的免疫反应。STAR-001 是一种传统的肝脏靶向脂质纳米颗粒（LNP），用作阳性对照，而对于其他 LNP，如前所述使用阳离子脂质 [15,16]。小鼠肌肉注射封装在这些不同 LNP 制剂中的编码荧光素酶（Luc）的 mRNA。注射后 6 小时，通过生物发光成像系统监测小鼠体内荧光素酶的表达。研究结果显示，所有注射 Luc mRNA-LNP 的小鼠都表现出荧光素酶表达，其中 STAR-001 制剂在肝脏中显示出最高疗效（图 2A）。在这项研究中，我们专注于开发针对肌内注射而不是肝脏靶向优化的 mRNA 疫苗制剂。我们希望在肌肉注射部位观察到更多的富集。如图 2B 和表 1 所示，除了 zeta 电位的差异外，这四种 LNP 组分的粒径和多分散指数（PDI）没有显着变化。然而，STAR-002 制剂的肌肉与肝脏比率最高。

图 2.肌肉靶向 LNP 制剂筛选：（A）小鼠注射 1 μg 编码荧光素酶的 LNP-mRNA；注射后 6 小时，荧光素酶在体内表达可见。然后，处死小鼠，在荧光下拍摄心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。（B）计算肌肉与肝脏的比率。（C）炎性细胞因子测定结果。（D）血浆的生化测试结果。

表 1.LNP 配方的大小、PDI 和 zeta。

LNP	尺寸（nm）	PDI	Zeta （毫伏）
星-001	104.20	0.054	−2.60
星-002	103.10	0.062	6.19
星空-003	100.60	0.070	3.90
星-004	107.35	0.073	−7.45
星-005	101.40	0.148	1.43

为了进一步评估 LNP 制剂的耐受性和安全性，在注射后 1 周采集血样并分析安全相关指标。数据表明，大多数小鼠的炎性细胞因子（IL-6、TNF-α 和 IFN-γ）的血清浓度和血浆生化检测结果与注射 PBS 的小鼠相似（图 2C、D）。此外，在整个研究中未观察到明显的体重减轻。总的来说，这些结果表明，所有 LNP 制剂都介导有效的 mRNA 递送和表达，并表现出优异的耐受性和安全性。STAR-002 制剂表现出卓越的肌肉靶向效率，被选中进行进一步开发。

3.3. RV-G mRNA-LNP 在小鼠中诱导强烈的体液反应

我们已经证明，优化的 LNP 制剂可有效介导 mRNA 递送和表达，以及良好的耐受性和安全性。此外，通过严格的 UTR 对筛选，我们已经确定了已确认的 RV-G mRNA 序列。在这里，我们将确认的 RV-G mRNA 封装在四种优质制剂中，以获得最佳的 RV-G mRNA-LNP。在第 0 天用这些 RV-G mRNA-LNPs 免疫 BALB/c 小鼠，并在第 7 天和第 14 天通过眼眶静脉丛采集血样进行血清学研究。进行中和试验，显示与 PBS 组相比，四种 LNP 制剂在注射后第 7 天和第 14 天诱导的病毒中和抗体滴度（VNT）显着升高（图 3A）。值得注意的是，STAR-002 制剂以更高的 VNT 和较小的组间变异性脱颖而出。因此，我们选择了这种制剂进行进一步研究。

图 3.小鼠的抗原特异性抗体反应：（A）在 4 种优质制剂中通过 ELISA 检测到接种疫苗的小鼠血清（50 μg）中的病毒中和抗体滴度；（B）分析第 14 天收集的血清中 5 μg 剂量的小鼠的抗原特异性抗体反应；（C）第 14 天收集的血清中 5 μg 剂量的血清中的病毒中和抗体滴度；（D）在第 7 天和第 14 天收集的三剂小鼠血清中的病毒中和抗体滴度（****，第 7 天与 Ctrl 组相比< 0.001；####，p < 0.001 与 Ctrl 组相比第 14 天）。

随后，我们评估了所选 RV-G mRNA-LNP 的体内免疫反应。在第 0 天用 0.5 、 5 和 50 μg 剂量的 RV-G mRNA-LNP 免疫 BALB/c 小鼠。使用注射后第 7 天和第 14 天通过眼眶静脉丛采集的血样进行血清学研究。ELISA 检测病毒 IgG 结合滴度，进行中和试验。结果显示，在第 14 天，5 μg RV-G mRNA-LNP 组中的小鼠表现出比对照组更高的病毒中和抗体滴度（VNT）和病毒-IgG 结合滴度（1：128,000）（图 3B、C）。第 7 天的 VNT 滴度范围从 0.5 μg 剂量组的 4.5 IU/mL 到 50 μg 剂量组的 26 IU/mL。到第 14 天，这些滴度增加到从 0.5 μg 剂量组的 22.4 IU/mL 到 50 μg 剂量组的 71.9 IU/mL，证明了积极的剂量-反应关系（图 3D）。这些发现表明，用 RV-G mRNA 封装的 mRNA-LNP 可以引发更高水平的针对 RV-G 蛋白的病毒-IgG 结合滴度和病毒中和抗体滴度（VNT）。

3.4. RV-G mRNA-LNP 的暴露前保护及其在小鼠中与许可疫苗竞争的能力

为了评估 RV-G mRNA-LNP 在体内的预防能力，我们使用 6-8 周龄的 Balb/C 小鼠（n = 10，雄性和雌性数量相等）进行了一项实验。小鼠在接受单次 5 μg 免疫后 14 d 脑内感染 100 倍 LD50 CVS-24 毒株。获得许可的疫苗作为阳性对照。

结果令人震惊：RV-G mRNA-LNP 组的所有小鼠都存活了下来，而阳性对照组的 10 只小鼠中有 6 只死亡。这表明 RV-G mRNA-LNP 组的保护率为 100%，而阳性对照组的保护率为 40%（图 4A、B）。此外，我们观察到各组之间的体重变化不同。RV-G mRNA-LNP 组表现出最小的体重波动，其次是阳性对照组，感染后体重减轻 10 天后逐渐恢复。相比之下，对照组继续减肥直到死亡（图 4C）。

图 4.RV-G mRNA 疫苗对小鼠的暴露前保护：（A） Kaplan-Meier 存活曲线；（二）防护率统计图；（C）小鼠体重变化；（D）血清中的病毒中和抗体滴度；（E）血清中的病毒-IgG 结合滴度（****，与 PC 组相比，p < 0.001）。

我们还将 RV-G mRNA-LNP 的免疫原性与许可疫苗的免疫原性进行了比较。单次 5 μg 剂量的 RV-G mRNA-LNP 诱导的病毒中和抗体滴度（VNT）为 31 IU/mL，显著高于许可疫苗诱导的 9 IU/mL。同样，对于病毒 IgG 结合滴度，RV-G mRNA-LNP 组的滴度为 1：1,024,000，而许可疫苗的滴度为 1：64,000（图 4D，E）。

这些发现表明，到第 14 天，单次 5 μg 剂量的 RV-G mRNA-LNP 导致病毒中和抗体滴度（VNT）几乎是 WHO 标准 0.5 IU/mL 的六倍。该水平足以诱导保护性抗体滴度。

3.5. RV-G mRNA-LNP 的暴露后保护

上述结果清楚地表明，RV-G mRNA-LNP 可以保护小鼠在暴露前免疫后免受 CVS-24 感染。基于这些发现，我们试图确定 RV-G mRNA-LNP 是否也提供暴露后保护。为此，我们使用了 6-8 周龄的 Balb/C 小鼠（n = 10，雄性和雌性数量相等）并在施用单次 5 μg 免疫剂量前 6 小时用 50 倍 LD50 CVS-24 肌肉注射感染它们。制剂 SM-102 用作阳性对照。

感染后，所有组在前 5 天内均出现体重减轻；然而，用 RV-G mRNA 免疫的小鼠开始逐渐恢复体重，STAR-002 组表现出更快的恢复（图 5A）。各组间的存活率差异很大。STAR-002 组损失了 4 只小鼠，存活率为 60%，而 SM-102 组损失了 6 只小鼠，存活率为 40%。相比之下，对照组中的所有小鼠在感染后 14 天内都死于狂犬病（图 5B）。此外，单剂量的 STAR-002 和 SM-102 均封装了 RV-G mRNA，在给药后 5 天诱导了高水平的病毒中和抗体滴度（VNT），显着高于 0.5 IU/mL 的 WHO 标准（图 5C）。这些结果突出表明，STAR-002 制剂的性能优于 SM-102，在体内对病毒感染提供了卓越的保护。

图 5.RV-G mRNA 疫苗对小鼠的暴露后保护：（A）小鼠体重变化；（B） Kaplan-Meier 生存曲线；（C）血清中的病毒中和抗体滴度（****，与 SM102 组相比，p < 0.001）。

4. 讨论

mRNA 代表了一种非常有前途的多功能疫苗接种方法，并彻底改变了疫苗格局，它在抗击 COVID-19 大流行中的关键作用凸显了这一点。两种基于 mRNA 的 SARS-CoV-2 疫苗 mRNA-1273 （Moderna）和 BNT162b2 （Pfizer-BioNTech）被迅速开发出来，显示出高安全性和有效性，成本相对较低 [17,18]。这一成功促进了将 mRNA 技术应用于其他传染病的研究，包括呼吸道合胞病毒（RSV）、水痘带状疱疹病毒（VZV）和狂犬病病毒。

灭活狂犬病疫苗在全球范围内普遍存在，在预防和控制狂犬病传播方面发挥着至关重要的作用。然而，大多数灭活狂犬病疫苗需要多剂才能达到高中和抗体滴度，这会产生大量成本，并且在患者依从性方面也构成了挑战。因此，开发像 mRNA 疫苗这样的创新疫苗有助于减轻狂犬病的负担是可取的。

在这项研究中，我们设计了一种专注于狂犬病病毒糖蛋白的 RV-G mRNA 疫苗，这是唯一经过认证的中和抗体结合表位。一开始，通过优化 RV-G mRNA 的 UTR，我们提高了 mRNA 的稳定性和效率，因为 UTR 对表达和半衰期都至关重要（图 1B）。然后，我们优化了不同长度的 polyA 尾巴，并在尾巴中间插入了序列。polyA 尾对 mRNA 的稳定性和翻译效率也至关重要。我们的新 polyA 尾巴有效地规避了传统专利，并表现出相似的稳定性和表达效率（图 1C）。之后，我们推出了一种新的肌肉靶向 LNP 配方，该配方具有我们专有的新型阳离子脂质，它避免了传统肝脏靶向 LNP 的泄漏问题（图 2A、B）。这些不同 LNP 配方的安全性特征非常相似（图 2C、D）。此外，与传统的肝脏靶向脂质 SM-102 （STAR-001）相比，我们的新型阳离子脂质（STAR-002）可以产生更强的体液免疫反应，尤其是在中和抗体水平方面（图 3A）。在图 3B-D 中，当 RV-G mRNA 用 STAR-002 LNP 封装时，以剂量依赖性方式诱导高病毒中和抗体滴度（VNT）和 IgG 滴度。值得注意的是，STAR-002 制剂在小鼠的暴露前攻击试验中提供了 100% 的保护，明显优于许可疫苗的 40% 保护（图 4）。在暴露后激发试验中，单剂量诱导 60% 的保护，超过了提供 40% 保护的经典制剂 SM102。此外，单次 5 μg 剂量的这种疫苗产生的中和抗体滴度几乎是 WHO 标准 0.5 IU/mL 的 200 倍（图 5）。与之前报道的 CureVac 和 Liverna 开发的 mRNA-LNP 狂犬病疫苗相比，我们研究中的疫苗具有两个独特特征。除了 mRNA 骨架的差异外，与传统的肝脏靶向 LNP 相比，这里使用的肌肉靶向 LNP 可以产生更强的体液免疫。后者可能在肝脏中具有脱靶毒副作用。

LNP 配制的 mRNA 可以作为一种多功能的平台技术 [19]，可以通过标准化工艺高效生产。LNP 配制的 mRNA 方法的简单性和可扩展性，以及易于批量控制，显著降低了疫苗生产成本。总之，将 RV-G mRNA 作为抗原包埋在基于 LNP 的纳米颗粒中，不仅可以引发病毒中和抗体滴度（VNT），而且只需一次注射即可获得显着的免疫效果。这些特性使 mRNA 疫苗成为一种潜在安全且具有成本效益的狂犬病疫苗接种候选疫苗。

5. 结论

本研究首先通过优化 UTRs 和 polyA 尾部构建了 mRNA 疫苗的新型骨架。该框架适用于各种预防性 mRNA 疫苗的开发。随后，通过一个小规模的筛选过程，我们获得了一种针对肌肉的 LNP 配方。与传统的肝脏靶向 LNP 相比，这种新的递送系统在产生更高水平的中和抗体和 IgG 抗体方面表现出更强的效力。最后，我们将该骨架与封装在肌肉靶向 LNP 系统中的 RV-G 抗原序列相结合，开发了狂犬病病毒 mRNA 疫苗。该候选药物在小鼠中表现出很强的保护作用，具有广阔的未来发展前景。

补充材料

以下支持信息可在 https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines13030217/s1 下载，图 S1：WB 的原始图像；表 S1：用于 UTR 对筛选的 UTR 序列；表 S2：RV-G RNA 的序列。

作者贡献

R.H.、X.Y. 和 Q.L. （Qiang Li）构思了这个项目，设计了实验，并撰写了手稿。R.H. 和 X.Y. 监督了该项目。H.B. 和 Q.L. （Qin Li）进行并参与了所有的分子实验。所有作者均已阅读并同意手稿的已发表版本。

资金

这项研究得到了 Starna Therapeutics （STR-V002）、江苏省科技项目（SBK2023070025）、苏州市科技项目（ZXL2023267）和 NCTIB 细胞和基因治疗“公开竞赛（NCTIB2023XB02001）的部分支持。

狂犬病疫苗

摘要