印度野生猫科动物中狂犬病毒的免疫病理与分子筛查：揭示从野外到城市的溢出效应

摘要

狂犬病对人类、家畜和野生动物构成致命威胁，其传播通常呈现类似波浪的形态，受宿主种群密度的影响。了解宿主动物的动态对阐明病毒的空间分布和传播途径至关重要。

2014年至2017年间，对印度各种野生猫科动物（包括老虎、狮子、豹和其他物种）的脑样本进行了狂犬病筛查。在检查的68份样本中，有一例丛林猫（73-P/15）和一例豹（01-CD/16）检测呈阳性，占总样本的2.94%。感染豹此前曾对家畜表现出攻击行为，导致13头牛和2头水牛因神经系统并发症死亡。为了评估野生动物向家畜传播的潜力，对一头母牛和一头公牛（这两头牛接触过感染豹）的大脑样本也进行了狂犬病检测。直接荧光抗体技术（dFAT）显示大脑印片涂抹样本中存在狂犬病抗原，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进一步确认。对PCR扩增的N基因片段进行测序显示，豹、母牛和公牛序列之间的核苷酸一致性达到100%，确认了从豹到家畜的直接传播。系统发育分析将这些序列归入类北极1a进化枝，与在印度流传的其他狂犬病病毒（RABV）毒株聚集在一起。这项研究强调了在野生动物、人类与家畜之间保持有效屏障的重要性，以防止狂犬病从野生种群向城市人口溢出。

关键词

狂犬病，dFAT，RT-PCR，野猫科动物，溢出传播

引言

印度丰富的野生动物遗产及其致力于保护的态度对于维持生态平衡至关重要。然而，这一遗产面临严重的威胁，如狩猎、偷猎、非法野生动物贸易以及人与野生动物冲突，这些特别影响全球野生猫科动物种群。根据1972年《野生动物保护法》和《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）实施的严格保护措施，将猫科动物列为易灭绝物种（国际自然保护联盟[IUCN]红色名录评估，2014年）。政府的努力——包括反偷猎法规、救援行动、栖息地保护和意识提升活动——有助于狮子、老虎和豹的种群恢复。然而，狂犬病和犬瘟热等传染病仍是重大关切问题，野生动物与家畜之间互动的增加加剧了这一问题。人类定居点的扩张进一步复杂化了疾病动态，这突显了持续监测和协调一致的野生动物保护策略的必要性，以有效保护印度的野生动物（Kadam等人，2022年）。

狂犬病是由一种名为狂犬病毒的负义RNA病毒引起的，该病毒有多种毒株，包括野型和实验室固定变异型，全球普遍存在（Badrane等人，2001年；Nadin-Davis等人，2003年）。感染也可能通过抓伤或与感染动物的唾液接触开放性伤口而发生。病毒传播至中枢神经系统，几乎总是导致致命的症状，如水恐症和攻击性增加（“狂暴”型）或软瘫（“哑巴”型）（Greene和Rupprecht，2013年；Baer，2017年；Dietzschold等人，2005年；Sardana等人，2022年）。

食肉目（例如狗、猫、狐狸、狼、浣熊、豺、臭鼬、郊狼和獴）和翼手目（包括吸血蝠、食虫蝠和果食蝠）的温血动物作为宿主。在印度，流浪狗是主要的宿主，将病毒传播给人类以及野生和家畜（Reddy等人，2011年）。系统发育研究揭示了狂犬病毒在蝙蝠宿主内的进化进程，偶尔会发生溢出事件和宿主转换至食肉动物，从而扩大了病毒的宿主范围（Hayman等人，2016年；Dundarova等人，2023年）。蝙蝠被认为是狂犬病毒传播给人类、家畜和野生动物的主要来源，反映了狂犬病传播动态中的复杂相互作用（Kuzmin和Rupprecht，2007年）。这些宿主支持宿主适应性病毒株的种内传播，而溢出宿主可能在不会导致进一步传播的情况下被感染。溢出宿主通常是死胡同宿主，很少参与后续传播。尽管狂犬病具有全球分布，但野生动物中的狂犬病流行病学仍被低估，这突显了需要全面的监测和控制措施。

几项研究记录了不同物种对狂犬病毒的暴露但未导致死亡的情况，挑战了长期以来认为狂犬病感染总是致命的假设。涉及狮子、小豹、美洲豹、人类和其他动物的研究在无临床症状的情况下检测到了针对狂犬病毒的特异性抗体，这暗示了从野生环境向城市环境溢出的潜在风险。然而，血清学测试方法和解释的差异阻碍了关于非致命暴露的普遍性和重要性的明确结论。此外，血清阳性并不一定意味着在狂犬病的自然传播周期中有作用。使用标准化方法的未来研究对于提高我们对狂犬病流行病学的理解至关重要（Berentsen等人，2013年；Deem等人，2004年；Furtado，2013年；Gold等人，2020年）。因此，定期监测对于加深我们对狂犬病传播动态的理解、为疾病控制策略提供信息以及减轻狂犬病对人类和动物群体的影响至关重要。

本研究的目的是调查老虎、狮子、美洲豹和其他猫科动物中狂犬病病毒（RABV）的存在，并评估从一只美洲豹、家牛和水牛分离出的RABV序列的遗传一致性。这旨在提供对城市环境中传播动态和潜在感染源的洞察。

材料与方法

在研究期间（2014-2017年），共分析了来自印度不同地区收集或接收的68份各种野生动物物种的大脑样本（表SM I）以检测狂犬病。其中包括16只老虎（23.52%）、13头狮子（19.12%）、36只美洲豹（52.94%）和3种其他猫科动物（4.41%）。为了收集大脑样本，在前额的眶上突后方做一个横向切口，连接两侧的切口到枕骨大孔，并向眼睛延伸。将颅腔顶部分离，并从大脑背侧和大脑与小脑之间的空间移除脑膜。在翻转头部之后，夹住颅神经和延髓，以便小心移除大脑。在死后检查期间收集的大脑和脾脏样本被储存在冰上用于分子分析，并被保存在中性缓冲福尔马林（NBF）中用于组织病理学检查。

在36份雪豹样本中，从一只在古吉拉特邦索奇里鸟类保护区桑克河附近被发现的死亡雪豹身上采集的大脑和脾脏标本被送往印度兽医研究所（IVRI）野生动物保护、管理和疾病监测中心进行病毒学检查。在死亡前，这只雪豹曾对村民和家畜表现出攻击性行为。在雪豹死亡后10至20天内，附近的一群牲畜中有13头牛和2只水牛出现神经系统症状并死亡。从一头牛和一头公牛身上采集的代表性样本进行了狂犬病检测，以调查从野生动物到家畜之间可能的传播情况。此外，还对死亡雪豹、牛和公牛的脑和脾脏样本进行了猫泛白细胞减少症病毒（FPLV）、犬瘟热病毒（CDV）和犬腺病毒1型（CAV-1）的筛查。

$\text{Seller’s染色}$

迅速制备脑样本的压印涂片，并用针对狂犬病病毒（RABV）核衣壳抗原的抗体进行塞勒氏（Seller’s）染色。然后将载玻片在自来水下快速冲洗，风干，再暴露在紫外（UV）光下30分钟。用浸油物镜检查染色后的载玻片，观察是否存在品红色的内基小体（扬和塞勒，1927年）。

直接荧光抗体试验用于检测狂犬病

脑组织印片，特别是来自脑干的印片，在冰冷的无水分子级丙酮中固定2小时。然后将印片圈起，浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）中5分钟。接着用抗狂犬病荧光素异硫氰酸酯（FITC）共轭物（富士瑞必诊断公司，美国）处理载玻片上标记的区域，并在37°C的湿润箱中孵育30分钟。孵育后，用滑动玻璃槽彻底清洗载玻片三次，使用磁力搅拌器产生搅动。清洗后，用含水封片液（Vecrolab）封片，并在400倍放大倍率下的荧光显微镜（尼康ECLIPSE Ni复合显微镜，日本）下进行检查。存在粉尘状苹果绿荧光视为阳性结果。在整个过程中，阳性对照（狂犬病狗脑）和阴性对照（无狂犬病的豹脑）切片与测试样本一起处理，以确保准确性（图1）。

反转录聚合酶链反应（RT-PCR）

使用TRIzol（美国英杰华公司）按照标准协议从脑组织样本中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）测量RNA浓度，并根据A260/280和A260/230比率评估纯度。根据制造商说明，使用RevertAid逆转录酶试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）从500 ng总RNA合成互补DNA（cDNA）。

聚合酶链反应（PCR）被用来扩增狂犬病毒N基因的一个部分区域，使用的引物是已发表的，列在引物表中（Cherian等人，2015年）。简而言之，准备了一个50微升的反应混合物，包含DreamTaq Green（2倍浓度）PCR主混合液（美国赛默飞世尔科技公司）、每个引物10皮摩尔以及cDNA模板。PCR条件包括一个初始的95°C变性5分钟，接着是35个循环的95°C变性30秒、50°C退火20秒和72°C延伸30秒，最后在72°C延伸7分钟。

扩增产物通过含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶进行潜艇式凝胶电泳，旁边放置了美国赛默飞世尔科技公司的GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder（美国赛默飞世尔科技公司），并在紫外（UV）照射下观察。

测序和系统发育分析

PCR扩增产物使用位于印度班加罗尔的Eurofins进行的Sanger双脱氧测序方法进行测序。获得的序列使用Lasergene版本6（美国DNASTAR公司）中的”EditSeq”以及国家生物技术信息中心（NCBI）的基本局部比对搜索工具（BLAST）进行分析。随后将序列提交到NCBI GenBank数据库。

使用PhyML 3.0在线软件进行系统发育分析，采用最大似然替代模型和1000的bootstrap值。使用MEGA X进一步精细化树拓扑结构，分类群按基因、地点、宿主、分离株、年份和登录号标记。

对样本进行CDV、FPLV和CAV-1筛查

从豹子身上获取的脑和脾样本也进行了犬瘟热病毒（CDV）、猫泛白细胞减少症病毒（FPLV）和犬腺病毒1型（CAV-1）的筛查。使用RevertAid逆转录酶试剂盒（美国赛默飞世尔科技）从豹子脑和脾样本中提取的RNA合成互补DNA（cDNA）。随后，按照Kadam等人（2022年）描述的协议，使用针对N和H基因的基因特异性引物进行PCR，以检测CDV。使用DNA提取试剂盒（赛默飞世尔科技公司）从样本中提取DNA，并进行针对VP2基因的PCR，以排除FPLV（Parthiban等人，2014年）。此外，使用已发表的引物进行PCR，以检测CAV-1（Chouinard等人，1998年）。针对CDV N和H基因、FPLV和CAV-1的特异性引物列在引物表（表SM II）中。

结果

筛查的老虎、狮子、豹子和其他猫科动物的脑样本的狂犬病检测结果列在表SM I中。在68份样本中，一只丛林猫（73-P/15）和一只豹子（01-CD/16）的狂犬病检测呈阳性，占总样本的2.94%。丛林猫的尸体消瘦，内部器官高度自溶，死后变色；脑质地明显软。使用卖家染色法和直接荧光抗体测试（dFAT）对丛林猫（73-P/15）和豹子（01-CD/16）的脑印片进行了染色。两个涂片都检测到Negri小体和狂犬病病毒（RABV）抗原，这通过明亮的苹果绿荧光信号显示出来（图1A、1B、1G、1H）。

狂犬病阳性的豹子（01-CD/16）攻击了13头牛和2头水牛。一头牛和一头水牛的脑样本也通过卖家染色和dFAT确认为狂犬病阳性（图1C、1D、1I、1J）。阳性对照（狂犬病狗脑）显示出Negri小体（图1E）和苹果绿荧光（图1K），而在阴性对照中这些则缺失（图1F和1L），确认了测试的有效性。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和PCR扩增狂犬病病毒（RABV）部分N基因得到了预期的约205个碱基对的扩增子（见图2）。来自豹、母牛和小公牛样本的扩增子已经测序，并在NCBI GenBank数据库中分别提交，登录号为MH151953、MH151954和MH151955。N基因的序列分析显示，豹、母牛和小公牛的序列在核苷酸水平上是相同的，这表明它们有共同的起源。

部分N基因序列的系统发育分析表明，这三个序列形成了一个独特的簇，并且与美国狗的RABV序列以及印度拉贾斯坦邦狗和人类的RABV序列具有100%的一致性。这些序列与其他印度RABV序列共享94-99%的一致性，并属于类北极1a进化枝，与其他印度分离株聚集在一起（见图3）。对豹的脑和脾脏样本进行CDV、FPLV和CAV-1检测，结果呈阴性。

讨论

狂犬病是一种几乎总是致命的人畜共患病，病死率接近100%，并且是全球分布的（Baxter，2012年；Fooks等人，2014年；Sardana等人，2022年）。该病毒影响多种温血动物，蝙蝠和食肉动物是关键的宿主。在印度，流浪狗是主要的传播媒介，将病毒传播给人类和野生动物。狂犬病主要通过咬伤传播，尤其是来自食肉目和翼手目的物种（Kasemimolporn等人，1991年）。本研究旨在调查狂犬病病毒在野生和家养动物中的存在及其遗传特性，以更好地理解传播动态和潜在感染源。

共收集了70份脑样本——包括来自母牛和公牛的代表性样本——从印度各地采集并进行了狂犬病筛查。通过卖家染色、直接荧光抗体测试（dFAT）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）确诊。在受检的动物中，一只36只中的美洲豹（01-CD/16）、一只73只中的丛林猫（73-P/15）、一头母牛和一头公牛检测出狂犬病阳性，表明病毒存在于不同物种中。这只狂犬病阳性的美洲豹此前曾咬过13头牛和2头水牛。其中，一头母牛和一头水牛被证实感染了相同的狂犬病病毒（RABV）株，这表明在这些接触中发生了传播。值得注意的是，对美洲豹的脑和脾样本进行检测，未发现犬瘟热病毒（CDV）、猫泛白细胞减少症病毒（FPLV）和犬腺病毒1型（CAV-1）。对美洲豹、母牛和公牛的脑样本进行了深入分析，以研究狂犬病的传播模式。

由于狂犬病动物的脑涂片可能并不总是显示出内基小体，因此采用了世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）推荐的RT-PCR和dFAT测试来检测狂犬病。丛林猫、美洲豹、母牛和公牛的所有样本检测结果均为阳性。本研究针对核蛋白（N）基因进行了RT-PCR和测序。这个基因是狂犬病病毒（RABV）基因组的一部分，与P、M、G和L基因以及基因间区域一同高度保守且广泛表达，使其成为基因分型和群体研究的关键标记（Vagheshwari等人，2017年）。

部分N基因的序列分析显示，来自豹、牛和公牛的序列完全一致，确认了从感染豹到家畜的直接溢出传播。系统发育分析进一步表明，这些序列形成了一个独特的簇，并与来自美国的犬衍生RABV序列以及印度拉贾斯坦邦的人源和犬源序列共享100%的同源性。这些序列属于类北极1a进化枝，并与其他印度RABV株聚类。

先前的研究已经表明，印度RABV株属于类北极1a进化枝（Nadin-Davis等人，2007年；Reddy等人，2011年；Reddy等人，2014年），通常显示出地理聚类模式。这些发现与基于G基因的早期系统发育分析一致（Bourhy等人，1999年；Yang等人，2011年；Saito等人，2013年）。在印度，野生动物和家畜中传播的RABV株之间密切的遗传相似性表明频繁发生跨物种溢出事件（Hayman等人，2016年；Dundarova等人，2023年）。

这些发现与Martinez-Burnes等人（1997年）的早期工作一致，他们报告了通过dFAT和卖家染色法诊断的从吸血蝙蝠到牛的狂犬病传播。在印度，众多家畜狂犬病爆发事件均指向流浪狗作为主要源头（Singh等人）。（资料来源：1995年；Jindal和Narang，1998年）。全球范围内，狂犬病宿主因地区而异：美洲的蝙蝠（Rupprecht等人，2002年）、非洲和亚洲的流浪狗（Fooks等人，2014年；Yang等人，2013年）以及欧洲的赤狐（Cliquet和Picard-Meyer，2004年）。像美洲豹、丛林猫和狮子这样的野生猫科动物被认为是偶然宿主，通常通过流浪狗或猎物物种感染。在印度，牛和水牛的狂犬病常常与感染的野生动物或流浪狗有关。

有效的狂犬病控制策略包括对家畜进行疫苗接种和对野生动物进行口服诱饵疫苗接种活动。实现70%的疫苗接种覆盖率通常足以中断传播并限制溢出效应（Cliquet和Picard-Meyer，2004年）。

这项研究强调了在野生动物中进行全面的狂犬病监测的迫切需求，以防止向家畜和人类溢出。鉴于监测野生动物的挑战，额外的措施——如对家畜进行疫苗接种、公众意识倡议、栖息地管理以及规范野生动物互动的规定——至关重要。建立快速反应小组来处理狂犬病爆发事件也可以在最小化风险和改善控制措施中发挥至关重要的作用。

在一只丛林猫和一只美洲豹中检测到狂犬病，并且随后传染给家畜，这突显了野生动物与家畜之间复杂的传播动态。豹、牛和公牛中相同的遗传序列证实了直接传播，这强调了野生动物宿主在狂犬病流行病学中的重要性。观察到感染豹在死亡前对人和家畜表现出攻击性行为，进一步强调了野生动物溢出可能带来的公共卫生风险。

总之，这项研究加强了维持野生动物、家畜与人类之间有效屏障的必要性，加强野生动物健康监测系统，并扩大疫苗接种和意识提升项目，以保护动物和人类健康免受狂犬病的侵害。

伦理声明

所有关于动物的实验程序都是根据印度农业研究委员会-印度兽医研究所的建议和批准进行的。

数据可用性声明

数据将根据请求提供。

致谢

本项工作得到了印度农业研究委员会-印度兽医研究所（位于伊扎特纳加尔）和中央动物园管理局（位于印度）资助的国家野生动物医疗保健项目支持。我们衷心感谢印度农业研究委员会-印度兽医研究所伊扎特纳加尔的主任，他提供了必要的设施和资源支持，以便进行此项研究。

利益冲突声明

作者没有相关的财务或非财务利益冲突。

参考文献

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