狂犬病病毒深层突变扫描

为了测量狂犬病病毒G基因突变的影响，我们使用了之前描述的假病毒深度突变扫描平台^36，37。该平台能够创建基因型-表型关联的慢病毒颗粒文库，每种颗粒在其表面展示独特的G突变体，并在其基因组中编码识别性核苷酸条形码(图S1A，B)。这些慢病毒颗粒(或“假病毒”)仅编码一种病毒基因(狂犬病病毒G)，因此只能经历一个细胞感染周期，从而能够研究G突变体而不需要产生复制型致病病毒。汇集的假病毒文库可用于在各种实验条件下感染细胞，并且每种G突变体在每种条件下使细胞感染的能力可通过对感染细胞的条形码进行测序来定量(图1A)。这种方法使得在一次实验中测量成千上万个不同突变对G的影响成为可能。

我们使用狂犬病病毒巴斯德株(一种疫苗株)的G蛋白进行了深度突变扫描¹⁵最近用低温电子显微镜测定了它的融合前G值^12，25。我们设计的突变体库包含G中433个位点的所有单个氨基酸突变，从胞外域N端的两个残基(在信号肽的末端)开始，一直到整个结构解析^12，25胞外域的区域并进入其C-末端区域(图1B)。因此，文库靶向433 × 19 = 8，227个不同的氨基酸突变。我们还设计了20个位点的终止密码子突变作为细胞进入的阴性对照。在整篇论文中，我们利用编号方案，其中一个被分配给胞外结构域中的第一个位点，与过去狂犬病G研究的编号惯例一致^12，25，26。

我们使用先前描述的方法(图S1B)^36，37。每个文库包含约80，000个G的条形码变体，每个文库覆盖了8227个预期胞外域氨基酸突变的> 99%图S1C)。大多数条形码变体仅包含一个G氨基酸突变(~64%)，尽管一些变体不包含突变(~12%)或包含多个突变(~24%)(图S1D)。

突变对G-介导的细胞进入的影响

我们首先测量了所有G突变如何影响蛋白质介导假病毒进入293T细胞的能力。我们通过用表达狂犬病G突变体的条形码假病毒颗粒的集合文库感染293T细胞，并将感染的293T细胞中每个条形码的频率与感染了显示未突变VSV-G的条形码假病毒的对照组细胞进行比较(图1A， S1B， S2A)。为了使显示狂犬病g病毒的假病毒滴度最大化，我们在补充了4 μg/mL凝聚胺的培养基中用g病毒进行感染³⁸并调节至pH值为7.1³⁹ (图S2B)。当用VSV-G进行假型时，所有假病毒都能够进入293T细胞，而不管狂犬病G功能如何，从而为文库中的每个条形码提供基线频率。然后将这些基线频率与假病毒依赖其狂犬病G突变体感染细胞的条件下每个条形码的频率进行比较。我们将每种G变体感染细胞的能力量化为其条形码计数相对于狂犬病-G和VSV-G介导的感染条件之间的未突变G的条形码计数的对数(图S2A)。大于零的细胞进入分数表明相对于亲代G蛋白的感染改善，而小于零的值表明进入受损。由于一小部分条形码变异包含多个突变，我们采用了一个全局上位模型去卷积单个突变的影响⁴⁰。突变如何影响细胞进入的测量在不同天用相同文库进行的重复之间以及在两个独立的G突变体文库(图S2C–D)。

G突变对细胞进入的影响见图1C；查看互动显示https://dms-vep。org/RABV_Pasteur_G_DMS/cell_entry。html来最好地检查数据。正如所料，终止密码子的突变对细胞进入都是有害的。氨基酸突变的影响在不同位点有很大差异，在某些情况下，在同一位点的不同突变之间也有差异。例如，融合结构域中的160-168位点、第三接头中的181-189位点、pleckstrin同源结构域中的201-206和244-250位点都耐受大多数氨基酸突变。但其他位点受到高度限制:例如，几乎所有的突变在两个融合环中都是有害的，这两个融合环跨越位点73-79和117-125²⁶。在下一小节中，我们将在G的结构中更详细地讨论这些约束模式。

为了验证突变对细胞进入影响的深度突变扫描测量，我们克隆了15个被测量具有一系列影响的单个G突变，并测定了编码这些突变的单个假病毒的滴度。来自深度突变扫描的突变对细胞进入的影响与在这些验证试验中测量的单个假病毒滴度高度相关(r = 0.91; 图1D)。深度突变扫描也与先前的实验一致，这些实验描述了G的单个突变对其融合活性的影响^12，26 (图S2E)。

G的结构和功能背景下的突变约束

突变对G细胞进入功能的影响在整个蛋白质中变化很大，在中心结构域、pleckstrin同源结构域和融合结构域(图1C， 2A)。这种限制的一部分可以相对简单地用G正确折叠才能发挥作用的要求来解释。例如，G表面上最受限制的区域之一涉及连接位点C189和C228的二硫键，其中任一位置的任何非半胱氨酸氨基酸的突变对细胞进入都是高度有害的(图2A)。在G的融合前结构中隐藏的位点，非疏水性氨基酸的突变往往是有害的，可能是因为它们破坏了蛋白质疏水核心的折叠(图S3)。

其他的限制位点为G的功能提供了更细微的见解。融合环对G的细胞进入机制至关重要，并被认为稳定狂犬病G的三聚体融合前构象²⁵。融合环在G的可用三维结构中仅被部分解析，但是我们的结果显示环和侧翼β链中的许多位点都被高度限制(图2B–C)。先前的工作已经测试了融合环中F74、Y77、Y119和W121位点的丙氨酸突变对三聚体G稳定性的影响，并且发现只有Y119A没有强烈的副作用²⁵。与先前的工作一致，我们的深度突变扫描显示，在Y119突变为丙氨酸对细胞进入是合理耐受的，但在F74、Y77或W121(图2C)。然而，除了W121之外，所有这些位点都耐受一些氨基酸的突变，这些突变保持疏水性或芳香性(例如，F74L和Y77F被合理耐受) (图2C)。融合环附近的脯氨酸残基(位点89、106、115和117)很大程度上不能耐受突变(图1C， 2B)，可能是因为这些脯氨酸对于确保正确的融合环方向很重要。

深度突变扫描也有助于描绘可能在触发细胞进入所必需的G构象变化中起重要作用的位点。推测在一个接头和融合结构域之间的界面上的位点86、173和397的一簇组氨酸有助于控制狂犬病病毒G^12，41 (图2D)。与这种假设一致，即这些组氨酸作为“pH传感器”对G的细胞进入功能至关重要，我们的深度突变扫描显示，将这三个位点中的任何一个突变为任何非组氨酸氨基酸都会损害细胞进入(图1C， 2D)。我们的深度突变扫描还显示结构上邻近组氨酸(T60、T62、T171和T176)的苏氨酸残基仅容许丝氨酸突变(图1C， 2D)，表明这些残基的羟基部分可能对G功能很重要。这一发现与这些残基与组氨酸簇相互作用的可能性相一致，正如对相关VSV-G融合蛋白中组氨酸簇附近的丝氨酸所作的假设⁴¹。

我们的深度突变扫描确定了一些位点，突变限制似乎是由于延伸的中间构象的相互作用，它与融合前三聚体处于平衡状态^24，27，31 (图2E)。包括E45、D211、R213、H261、D266和E269的位点簇在延伸的中间体中形成极性和范德华相互作用¹² (图2F)，我们的深层突变扫描显示，这些位点的几乎所有突变都对细胞进入有害(图1C， 2F)。另一组位点(L46、P144、Y145、I191、F192、L227、W240和V258)在延伸的中间体(图2E，F)，我们的深度突变扫描显示，在这些位点只容许疏水性突变(或者在Y145的情况下，没有突变)图1C， 2F)。在融合前构象三聚体中，这些位点中的一些(例如Y145和V258)远离其他位点，并且大量暴露于溶剂(图2E)，表明突变限制源于延伸中间体的相互作用，而不是融合前的构象。这些稳定延伸中间体但可能耐受融合前构象突变的位点代表了稳定突变的额外候选位点，这些突变可能使狂犬病G的构象平衡向融合前状态转变。

先前的工作已经通过引入脯氨酸(H270P)突变稳定了融合前构象中的狂犬病G，该突变在融合前构象中是容许的，但在延伸的中间构象中是不利的^12，13。类似的基于脯氨酸的稳定策略已被用于稳定I类融合蛋白(例如冠状病毒刺突)的疫苗免疫原^42，43)和VSV-G⁴⁴。与狂犬病病毒G中270位点的脯氨酸独特地阻断融合前三聚体向延伸中间体的转化的想法一致，我们的深度突变扫描显示H270P强烈损害细胞进入，但该位点的大多数其他氨基酸突变被很好地耐受(图S4)。我们使用我们的深度突变扫描来识别发生大构象变化的区域中脯氨酸特别不受欢迎的额外位点(例如，K47、Q256、N259、L260和S265)(图S4)。这些位点代表融合前稳定脯氨酸突变的额外潜在候选位点。

深度突变扫描全面描绘抗体逃逸突变

为了实验测量所有狂犬病G突变如何影响抗体中和，我们将假病毒文库与不同浓度的抗体一起孵育，并使用深度测序来量化每个G变体在每个抗体浓度下感染293T细胞的能力(图3A)。为了将深度测序计数转换为中和值，我们将它们标准化为“未中和标准”的计数，该“未中和标准”由未被抗狂犬病抗体中和的VSV-G假病毒组成³⁶ (图3A)。我们使用之前描述的生物物理模型分析了这些数据⁴⁵以获得与IC50的对数倍数变化成比例的每个突变的逃逸值。

我们首先将这种方法应用于单克隆抗体17C7，它是Rabishield暴露后预防剂的活性成分^16，33，46并通过冷冻电镜确定了其与G的复合结构¹²。我们的深层突变扫描显示，逃避17C7中和的突变主要发生在位点334、336–338、340–342和346(图3B，C和交互式可视化https://dms-vep。org/RABV_Pasteur_G_DMS/escape。html)。就G细胞进入功能而言，这些逃逸突变中的许多都具有良好的耐受性(如中字母的颜色所示)图3C)。逃逸突变都发生在17C7和G的结合界面附近(图3D)。一个逃逸突变，I338T，不直接接触抗体，但在N336上产生一个N-连接的糖基化基序，已知它影响G的抗原性^47，48。I338S不像I338T那样表现为逃逸突变，因为它对巴斯德毒株G(图1C)。

为了验证抗体逃逸的深度突变扫描测量，我们创建了编码9种不同突变的单个假病毒，这些假病毒在深度突变扫描中对抗体17C7的中和有一系列影响。在用这些假病毒进行的传统中和试验中测量的这些突变的效果与在深度突变扫描中测量的逃逸值高度相关(r = 0。97; 图3E， S5A)，验证了该方法的准确性。

八种单克隆抗体的综合逃逸图

我们使用深度突变扫描对八种靶向G(表1)。这些抗体与G上的不同抗原区域结合:两个靶抗原区域I(抗体CR57^48，49和RVC20^34，50)，四个目标区域III (17C7¹⁶，CR4098⁴⁹，RVA122^25，34、和RVC58^17，34)，两个结合在先前描述的抗原区域之外(CTB012¹⁸和RVC68³⁴)。自2017年以来，抗体17C7已在印度进行临床部署^19，51和CTB012¹⁸是SYN023鸡尾酒的两种活性成分之一^52，53最近结束了三期临床试验⁵⁴。所有八种抗体中和具有未突变狂犬病G的假病毒，尽管具有不同的效力(表1， 图S5B)。

深度突变扫描显示，每种抗体通过在G(图4和交互式可视化https://dms-vep。org/RABV_Pasteur_G_DMS/escape。html)。对于已经通过实验确定其结构与G复合的四种抗体，主要的逃逸突变都发生在抗体结合界面附近的G位点(图5A，B)。然而，只有一小部分接触位点的突变强烈逃避抗体中和(图5A，B)，这一结果与先前对其它病毒的抗体逃逸的研究一致^55–58。在某些情况下，某些接触位点没有逃逸突变，仅仅是因为所有突变对G细胞进入功能都太有害(例如，抗体RVC20的C228位点)图5B)，但在其他情况下，接触位点容许许多突变，但没有一个引起明显的中和逃逸(例如，抗体RVA122的E33位点)图5A，B)。

靶向G的相同抗原区域的抗体可以在它们的逃逸突变上有很大不同。例如，17C7、CR4098、RVA122和RVC58都与G³⁴。然而，尽管17C7和CR4098通过非常相似的位点组的突变而逃逸，但是RVA122和RVC58的逃逸突变的位点更加不同(图4)。即使抗体共享逃逸位点，个体突变的影响也可能不同。例如，N336S³⁵和R346K^59，60逃避17C7但不逃避CR4098，尽管在位点336和346的一些其它突变逃避两种抗体(图4)。同样，RVC20和CR57都与抗原区I结合³⁴在那里它们被认为阻断α7烟碱乙酰胆碱受体的结合位点^22，61，62并防止pH驱动构象变化^50，61。尽管它们的表位相似，但这两种抗体的逃逸突变仅部分重叠(图4， 5A，B)。例如，两种抗体都受到K226和G229突变的影响，但V230和A242的突变仅强烈逃避CR57。

逃逸图还提供了为什么一些抗体比其他抗体具有更大的抗狂犬病病毒的广度的见解。例如，在靶向抗原区域III的抗体中，17C7和CR4098仅中和狂犬病，而RVA122和RVC58也广泛中和非狂犬病的狂犬病病毒(例如，Duvenhage狂犬病病毒、欧洲蝙蝠1型狂犬病病毒和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒)³⁴。与窄谱抗体(17C7和CR4098)不同，广谱抗体(RVA122和RVC58)通过在较少位点或具有较低突变耐受性的位点突变而逃脱。具体来说，RVA122主要是通过仅一个位点的突变而逃脱的:R333(图4， 5A，B)，这是疫苗株中常见的突变位点^63–65但是突变通常会削弱致病性^66，67。RVC58通过几个位点的突变得以逃脱，但这些突变中的许多，如L38和V210位点的突变，对G的细胞进入功能有害(图4请参见徽标图中字母的颜色)。

两种抗体(CTB102和RVC68)缺乏与G复合的结构，并且不结合先前确定的抗原区域，尽管CTB102的表位已经通过丙氨酸诱变和逃逸研究得到部分确定¹⁸。我们的深度突变扫描显示，CTB102与融合前狂犬病病毒G上空间聚集的G顶点上的位点结合，主要在涉及V29-E33和I268-L275的环中(图4， 5C)。这些环在G的延伸中间构象中经历了实质性的重排^24，27，31这意味着CTB102的表位仅在G(图5C)。RVC68对狂犬病病毒具有非常广泛的中和活性³⁴，但对狂犬病G的中和效力相对较差(表1)。我们的深度突变扫描显示，RVC68靶向狂犬病G融合结构域的碱基(图4)。这种抗体对不同的狂犬病病毒的广泛活性可能源于先前测试的病毒中靶位点的保守性³⁴。

抗体逃逸突变存在于自然发生的狂犬病毒株中

G蛋白在天然狂犬病毒株中各不相同，并且已经鉴定出一些毒株对特定抗体具有抗性，包括临床相关抗体^{33，34，48，59}。我们的深度突变扫描能够系统地识别抗体耐药毒株。我们首先检查了自然发生的G序列中每个氨基酸突变的频率与我们的深度突变扫描中测量的抗体逃逸(图6A和交互式绘图https://dms-vep。org/RABV_Pasteur_G_DMS/natural_seqs。html)。在所有抗体的天然G序列中，至少会引起一些逃逸的突变都存在，但是这些突变的频率和它们引起的逃逸的程度在抗体之间有明显的不同。例如，许多来自抗体17C7的强逃逸突变在天然序列中出现频率可观(图6A)。相比之下，抗体如RVC20在天然序列中仅具有几个频率可观的中等效应逃逸突变(图6A)。

我们预测了每种狂犬病毒株对每种抗体的逃逸，方法是将其所有组成G突变相对于巴斯德毒株的实验测量效果相加。我们通过Nextstrain可视化了这些预测⁶⁸系统发育树，其中序列可以通过它们的预测逃逸来着色(https://nextstrain。org/groups/jbloomlab/dms/rabies-G)。作为一个例子，所有7，122个公开可得的G序列的树的静态视图显示于图6B。尽管大多数毒株缺乏来自17C7的逃逸突变(白色在图6B)，有一些毒株预计会强烈逃避这种抗体(蓝色在图6B)。这些毒株中的大多数在位点336或346处含有突变(图S6A)，两者都是在深度突变扫描中测量到突变强烈逃逸17C7的位点(图4， 6A，C)。注意，许多被预测最强逃脱17C7的测序毒株来源于被感染的蝙蝠或野生动物，而不是狗(图6B)，这是人类感染的最常见来源⁶⁹。

作为验证，我们确定了两个预测强烈逃避抗体17C7的天然毒株，NY-2011–1202 o和A12_2718(图6C)。这两个毒株的G蛋白都与巴斯德毒株G有至少35个氨基酸突变。我们从这些毒株中的每一个产生了表达G的假病毒，并通过17C7以及另一种预测不会被每个毒株逃脱的抗体(图6C，D)。如深度突变扫描所预测的，两种毒株都强烈逃避了17C7的中和作用，但保留了与巴斯德毒株相似水平的对照抗体的中和作用(图6D)。

为了测试深度突变扫描中确定的顶端逃逸突变在多大程度上解释了逃逸，我们从A12_2718毒株G中去除了两个顶端逃逸突变(I338T或R346S )，或者将它们引入巴斯德毒株G中。与深度突变扫描一致，从A12_2718 G中去除顶端逃逸突变I338T部分恢复了17C7的中和作用，同时将这一单个突变添加到巴斯德毒株G中，使其完全抵抗17C7的中和作用(图S6B)。将较弱的逃逸突变R346S引入巴斯德毒株减少但没有消除17C7的中和作用，这也与深度突变扫描一致(图S6B)。虽然这些测量验证了深度突变扫描预测此处测试的抗体的基本上不同的毒株的逃逸的能力，但是当将深度突变扫描外推至序列不同的毒株时，应该始终小心谨慎。在某些情况下，上位性可能导致在其他病毒蛋白中观察到的突变效应的改变^70–72。