巴西东南部一只黑鼠耳蝠（黑鼠耳蝠属物种Myotis nigricans）感染狂犬病病毒、科勒巴尔通体菌以及婴儿利什曼原虫的混合感染情况  

• PMID: 40227349

摘要

本研究的目的是调查巴西城市蝙蝠中重要人畜共患病原体的存在，并评估被诊断出狂犬病的蝙蝠中是否存在共同感染。2021年，使用来自巴西东南部城市地区52只蝙蝠的器官样本，诊断该地区的狂犬病和其他人畜共患病。阳性样本进行测序、表征，并录入GenBank。在圣曼努埃尔市一户人家收集到的一只黑色蝙蝠中发现了涉及狂犬病病毒、贝氏巴尔通体和利什曼原虫的共同感染，该市是内脏利什曼病的疫区。系统发育分析显示获得的RABV序列与人类和野生犬科动物的参考序列相似，并确认了检测到的巴尔通体和利什曼物种的身份。据我们所知，这是首次报告一只蝙蝠同时感染狂犬病病毒、贝氏巴尔通体和利什曼原虫。三种重要病原体在黑色蝙蝠中的共同感染强调了新热带蝙蝠作为人畜共患病原体宿主的多元作用。这一前所未有的发现加强了这些动物在病毒、细菌和原虫病原体传播动态中的潜在作用，以及在蝙蝠中进行分子监测的重要性。

关键词 RABV·巴通氏菌病·利什曼病·翼手目·宿主·分子监测

引言

人畜共患病对全球公共卫生构成重大挑战，特别是在生物多样性丰富和热带地区（Allen等人，2017年）。人类与野生动物之间日益增长的互动，受城市化、森林砍伐和环境失衡的驱动，是导致人畜共患病出现和传播的主要因素之一（Jones等人，2008年）。蝙蝠因其广泛的遗传和生态多样性，作为各种病原体的宿主发挥着至关重要的作用，包括病毒、细菌和原虫（Alexander等人，2018年；Franca等人，2024年）。

狂犬病、巴通氏菌病和内脏利什曼病是在巴西发生的人畜共患病。狂犬病在某些地区是地方性的，尤其是在农村和森林地区，目前已被认为是主要的感染源，将病毒传播给人类和其他动物（Mayen 2003年）。根据巴西卫生部的数据，从2010年到2024年，巴西报告了大约48例人狂犬病病例。其中，24例是由蝙蝠引起的（占所有病例的一半），9例由狗咬伤引起，6例由非人灵长类动物引起，2例由狐狸引起，4例由猫引起，1例由牛引起。在2例中，无法确定引发攻击的动物（Brasil 2024年）。巴托洛米病是一种在该国诊断不足的动物园诊断疾病，主要与宠物身上的跳蚤有关，在最近的流行病学研究中显示出高发病率（池田等人，2017年；冈瓦雷斯-奥利维拉等人，2020年；雷蒙多等人，2022年；法奇尼-马丁内斯等人，2023年；弗兰卡等人，2025a年）。在2011年至2017年间，37.94%（480/1265）的疑似病例得到确诊，城市人口比农村人口受影响更严重（席尔瓦等人，2019年）。内脏利什曼病在该国的几个地区是地方性的，巴西占全球病例的93%（德朱斯，2004年）。每年发生超过50万例（德朱斯，2004年）。它通过经常与人类、家畜和野生动物互动的白蛉传播（戈麦斯-埃尔南德斯等人，2017年；卡斯特罗等人，2020年；里瓦等人，2021年；弗兰卡等人，2025b年）。

蝙蝠被认为是众多人畜共患病原体的重要宿主（韩等人，2015年；古普塔等人，2021年）。尽管蝙蝠被认为是多种病原体的宿主，但关于这些动物中共感染的发生情况了解甚少，特别是与人畜共患疾病重要性有关的病原体。了解蝙蝠中人畜共患病原体的共同循环可能为溢出事件的潜在风险提供洞见（布鲁克和多布森，2015年）。本研究的目的是调查巴西城市蝙蝠中重要的人畜共患病原体的存在，并评估被诊断出狂犬病的蝙蝠中是否存在共感染。

材料与方法

2021年，从城市地区提交了52只蝙蝠样本进行狂犬病监测，随后调查了该地区发生的其他被忽视的人畜共患病原体（巴尔通菌属和利什曼原虫）。根据巴西卫生部的建议，对蝙蝠进行狂犬病的被动监测是国家环境和流行病学监测服务的关键组成部分，由地方卫生当局负责执行（巴西2022年）。表现出异常行为的蝙蝠，如攻击性或在白天飞行，或者在家中被发现的，会被市动物传染病服务部门收集并进行狂犬病诊断。当居民在家中发现蝙蝠时，被告知要联系这些部门。蝙蝠种类的鉴定基于形态特征，如体型大小、翅膀形状和颅骨结构，按照Reis等人（2013年）描述的标准进行。收集到的蝙蝠种类有：大菊头蝠（18只）、灰鼻蝠（15只）、北美蝙蝠（9只）、大棕蝠（3只）、南蝠（2只）、大菊头蝠（1只）、红蝙蝠（2只）、巴西蝙蝠（1只）和布氏黄鼠狼（1只）。

动物通过在封闭室内暴露于5%异氟醚浓度下安乐死，随后持续暴露直至心肺骤停。之后，在无菌环境下对动物进行尸检。最初打开颅骨取出大脑，然后取出脾脏和肝脏。在尸检过程中，对蝙蝠进行了彻底检查，以识别可能存在的异常或与动物源病原体感染相关的迹象。检查重点关注宏观病理学迹象，这些迹象表明可能患有动物源感染，包括器官变色、坏死、肉芽肿或非典型液体积聚。所有受检组织均在正常参数范围内。脑组织完全用于狂犬病的即时诊断，而其他组织则储存在无菌试管中，并在-80°C下冷冻保存，以供后续分析其他动物源病原体。

为了检测狂犬病毒，使用脑组织碎片进行直接荧光抗体试验（DFAT）和鼠接种试验（MIT）。DFAT涉及将荧光标记的抗体应用于脑组织印片上，通过荧光显微镜直接检测脑组织中的RABV抗原（Rupprecht等人，2018年）。MIT涉及将捣碎的脑组织注入健康小鼠体内，并监测它们七天内的临床症状，以确认RABV的存在（Rupprecht等人，2018年）。使用制造商提供的方案，按照InviSorb® Spin Universal Kit（Invitek Molecular公司，柏林，德国）说明书，从脑组织碎片中提取病毒RNA。提取的RNA作为通过逆转录合成cDNA的模板，使用的引物为21 g（5′-ATG TAA CAC CTC TAC AAT G-3’）（Menozzi等人，2020年）。如在其他地方所述（Menozzi等人，2020年），使用引物21g和304（5′-TTG ACG AAG ATC TTG CTC AT- 3’）扩增cDNA，目标是N基因的1,478个碱基对的片段。

为了检测巴通体，使用与RNA提取相同的试剂盒从脾脏样本中提取DNA。实时PCR作为筛选方法进行，目标是编码柠檬酸合成酶的338个碱基对的基因片段（gltA），如在其他地方所述（Buss等人，2012年）。使用的正向引物为BartGltAF（5′-TGC AGG WTC ATC RGG WGC TAA T- 3’），反向引物为BartGltAR（5′-TGA GCT GGT CCC CAA AGG- 3’）和BartGltAR2（5′-TGG CTC CAC CAT GTG CGG-3’，按1:1比例混合）。为了增强反应并提高对巴通体物种的特异性，使用了Bartpr探针（5′-FAM-CAT TTG CAT GTA TTG CAG CAG GTG TTG C-BQHI-3’）。作为阳性对照，使用了由米纳斯吉拉斯州公共卫生实验室的立克次体病和汉坦病毒服务提供的汉赛巴通体分离株的DNA。确认阳性后，使用引物BhCS.781p（5′-GGG GAC CAG CTC ATG GTG G- 3’）和BhCS.1137n（5′-AAT GCA AAAAGA ACA GTA AAC A- 3’）通过常规PCR扩增样本，目标是编码750个碱基对柠檬酸合成酶的基因，如在其他地方所述（Norman等人，1995年）。

为了检测利什曼原虫，使用了从脾脏样本中提取的DNA。实时PCR作为筛选方法进行，目标是潜在的腐胺合成酶1基因的204个碱基对的片段，如在其他地方所述（Wu等人，2022年）。正向引物CL-SPDF（5′-AGA TCA TTG CGT ACT TGA C- 3’）和反向引物CL-SPDR（5′-TCA TCG ACA CAA CAG ACC- 3’）被使用。使用了由圣保罗州立大学寄生虫学实验室提供的利什曼原虫MHOM/BR/IOC/L2906菌株的DNA作为阳性对照。确认阳性后，使用引物Leish_18S/ITS1（5′ CTG GAT CAT TTT CCG ATG ATT A 3’）和Leish_18S/ITS1（5’AAC ACA AAC ACA CGC CTC CT 3’）通过常规PCR扩增样本，这两个引物针对的是18S基因的530个碱基对片段以及ITS1核糖体RNA基因的开始部分，如参考方法（Franca等人，2025b年）所述。

然后将10微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

阳性PCR产物使用Wizard®基因组DNA纯化试剂盒（Promega公司，美国威斯康星州麦迪逊市）按照制造商指南进行纯化，并送往进行桑格测序。阳性样本的序列与GenBank数据库中先前提交的序列使用BLASTn工具（Altschul等人，1990年）进行比较。序列质量使用BioEdit序列比对编辑器第7.2版（Ibis Therapeutics公司，美国加州卡尔斯巴德市）进行检查。

系统发育分析使用MEGA12版本12.0.7（Tamura等人，2021年）中的最大似然法进行。应用了带伽马分布的Tamura三参数模型（T92+G），并通过1000次自助法复制评估推断出的树拓扑结构（Tamura 1993年）。从狂犬病病毒分离株获得的序列与一个包含20个巴西N基因序列的数据集进行了比对，这些序列代表不同的宿主，包括狗、猫、马、牛、野生犬科动物、人类、非人灵长类动物和不同种类的蝙蝠。从巴尔通体属和利什曼原虫获得的序列与全球参考序列进行了比较。选择了外群来作为树的根：来自欧洲蝙蝠的狂犬病病毒、用于巴尔通体分析的不孕棒状杆菌以及用于利什曼原虫分析的锥虫。

结果

在分析的蝙蝠中，1.9%（1/52）对狂犬病病毒呈阳性，3.9%（2/52）对巴尔通体属细菌呈阳性，5.8%（3/52）对利什曼原虫呈阳性。在一只黑鼠耳蝠个体中观察到狂犬病病毒、巴尔通体和利什曼原虫的共同感染。这只蝙蝠是一只成年雌性。

实时PCR检测到的阳性样本的循环阈值（Ct）范围在30到32之间，表明微生物负荷适中。阳性样本的熔解温度（Tm）值与阳性对照一致，最大变化为1°C。

所有样本都通过常规PCR成功扩增，产生了足够的DNA进行测序。测序样本的查询覆盖率超过80%，且与其他GenBank中可用的序列相似性超过97%。共同感染的黑鼠耳蝠的序列登录号分别为PQ812415、PQ812416和PP939070，分别显示出与狂犬病病毒、科勒巴尔通体和小利什曼原虫的高度相似性。

如图1所示的系统发育分析揭示，从蝙蝠黑面鼯鼠（PQ812415）获得的狂犬病毒（RABV）的N基因序列与人类（Homo sapiens）和野生犬科动物（Lycalopex vetulus）的进化枝关系较近。图2展示了该基因的遗传信息。

使用三参数模型和1000个自助法复制样本以评估分支支持度。使用来自欧洲蝙蝠的狂犬病病毒序列作为外群。

我们的序列（PQ812416）与B. koehlerae参考序列（MT095046）之间的相似性，确认了检测到的巴氏杆菌的身份。图3显示了我们的序列（PP939070）与利什曼病参考序列（PP976612）之间的遗传相似性，确认了检测到的利什曼原虫的身份。

讨论

在一群蝙蝠中检测到的狂犬病病毒、B. koehlerae和利什曼原虫的共感染代表了一个前所未有的发现。这一结果强调了这些动物同时携带多种具有重大公共卫生意义的人畜共患病原体的能力。本研究中阳性的蝙蝠属于圣马利亚市（西经48°27’4.91英寸，南纬22°55’41.45英寸），位于巴西南部圣保罗州内陆。该地区被巴西大西洋森林覆盖，这是一个重要的生态热点，以生物多样性高和城市化的强烈共存为特征（奥利维拉 2007年）。这种蝙蝠通常被称为黑叶鼻蝠，是一种广泛分布于拉丁美洲的食虫蝙蝠，能在从森林区域到城市环境的各种栖息地中找到，以其小巧的体型和深色的毛皮为特征（威尔逊 1971年）。

2017年，对一个包含超过2800种哺乳动物病毒感染的数据库进行了分析，发现蝙蝠是此类感染受影响最严重的物种（奥利瓦尔等人 2017年）。据报道，狂犬病毒已在41种巴西蝙蝠中发现，它们现在被认为是城市地区狂犬病发生的主要传播媒介（Menozzi等人，2020年）。黑蝙蝠能够长途迁徙寻找食物，并栖息于各种庇护所，通常与人类和家畜近距离接触。这种行为增加了接触和传播人畜共患病原体的可能性（Wilson 1971年；Ferreira等人，2018年）。这种动物不仅被狂犬病毒（RABV）感染，还被其他病原体感染，这突显了其存活感染的能力，并强调其作为其他重大疾病潜在宿主的角色。鉴于黑蝙蝠常在人类活动区域栖息，这种共同感染引发了对重叠传播途径（例如，媒介传播与直接接触）的担忧，并强调了在人类、家畜和蝙蝠交汇的分散栖息地需要进行综合监测的必要性（Ferreira等人，2018年）。

巴西大西洋森林是一个热带雨林区域，特点是高湿度和高温，这些条件不仅有利于丰富多样的动物物种生存，还有利于吸血蠓的繁殖（Pinto等人，2010年）。这些昆虫在自然和人造庇护所中与蝙蝠互动，以它们的血液为食，并充当病原体传播的媒介（Lampo等人，2000年）。在巴西，这些昆虫传播利什曼原虫属（Leishmania）的物种。

在MEGA12软件中使用似然法，采用Tamura 3参数模型和1000次自助法复制来评估分支支持。使用布氏杆菌作为外群。

最近的研究表明，巴特氏菌属（Bartonella）物种也能通过它们传播（李等人，2024年）。此外，美国的一项研究评估了食虫蝙蝠对库蚊的捕食情况，这暗示了向蝙蝠传播的另一种可能途径（休斯等人，2022年）。这些发现表明，白蛉可能有助于蝙蝠的共同感染。

收集蝙蝠的城市是内脏利什曼病的疫源地。此前已在巴西疫源地的蝙蝠体内检测到利什曼菌属物种；然而，尚未报告与其他病原体的共同感染（拉茨劳夫等人，2023年）。尽管该市尚未报告巴尔通体病病例，但该疾病在巴西仍被严重低估，尽管已有记录显示其发生。东南部最近的研究表明，在庇护猫、无家可归者和献血者中巴尔通体感染率很高（皮塔西等人，2015年；雷蒙多等人，2022年；法奇尼-马丁内斯等人，2023年）。家猫作为潜在的传播者，通常在受到跳蚤媒介感染后通过抓挠传播细菌。尽管猫的临床症状通常较轻，但在人类中，该感染可能导致严重疾病，如心内膜炎（阿维多尔等人，2004年）。此前已在巴西新热带蝙蝠体内报告过巴特氏菌的存在；然而，尚未报告与其他病原体的共同感染（池田等人，2017年）。

除了与采血蝇和跳蚤的互动外，蝙蝠与其他外寄生虫的关联可能解释这种多病原体感染。在巴西，巴尔通体已在19.8%（40/202）的虻科苍蝇中被检测到（Amaral等人，2018年）。

使用MEGA12软件，采用Tamura 3参数模型和1000次自助法复制来评估分支支持。以锥虫作为外群。

我们的狂犬病病毒序列在系统发育树上的位置突显了蝙蝠在狂犬病病毒传播链中的重要性，特别是在不同哺乳动物物种共享栖息地的地方。蝙蝠狂犬病病毒序列与人类和野生犬科动物序列之间的系统发育接近性表明可能存在流行病学联系，加强了狂犬病病毒潜在宿主和宿主的多样性。

本研究的一个重要局限性是只有一只蝙蝠显示出共感染，这可能限制了结果的普遍性。同时，这一发现是相关的，因为它突显了蝙蝠中病原体之间相互作用的复杂性及其作为多个宿主的潜在能力。此外，将这一发现在巴西监测系统中进行情境化是很重要的，该系统优先考虑收集和分析发现的坠落或处于异常情况的蝙蝠，例如在室内。尽管这个系统在检测狂犬病例方面很有效，但可能低估了其他人畜共患病的情况，因为对其他病原体在蝙蝠中的主动监测仍然有限。

结论

本研究报告首次在南美洲东南部的一只黑蝙蝠体内发现了狂犬病毒、贝氏巴尔通体和李氏利什曼原虫的共感染。研究结果强调了这些动物作为具有不同传播周期的多种人畜共患病原体的潜在多重宿主的潜力，加强了对人类、家畜和野生动物共存区域的综合性监测需求。在单一宿主体内检测到这些病原体，突显了在人工化环境中病原体与宿主相互作用的复杂性，以及进一步研究评估这些共感染对生态和流行病学影响的重要性。

作者贡献 所有作者均参与研究的构思与设计。材料准备和数据收集由Danilo Alves de Franca、Benedito D. Menozzi和Helio Langoni完成。方法和结果分析由Danilo Alves de Franca和Bruna L. D. Ribeiro进行。稿件初稿由Danilo Alves de Franca撰写。所有作者阅读了稿件，提供了写作意见并批准了最终稿件。

资助 本项工作得到了圣保罗州研究基金会（授权编号2022/07124-6和2022/10976-4）的支持。

数据可用性 在当前研究期间没有生成或分析任何数据集。

声明

伦理审批 动物使用伦理委员会（编号0259/2022），巴西圣卡塔琳娜州立大学兽医学院及动物技术系。环境许可（编号85973-1）。

利益冲突 作者没有需要声明利益冲突的内容。

Hits: 1