巴西巴伊亚州狂犬病爆发的流行病学与分子分析

Epidemiological and molecular analysis of a rabies outbreak in the state of bahia, Brazil.
Acta Trop.2025V265N:107617(P40246220)

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《热带病志》

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Aroldo J.Borges Carneiro a,b ，José Eduardo Ungar de Sa c ，Jan Felix Drexler d ，Andreas Stcker e ，Flavia dos Santos a,f, Rafaela de Sousa Gonçalves a, Dinah R.Dantas Becerra a,

Rogerio de Magalhaes Cunhaa,Evandro Moraes-Silva, Paulo Santana

Caio Graco Zeppelini h,i,* ，Ricardo Lustosa a,f,h ，Carlos Roberto Franke a b

a 巴西巴伊亚联邦大学，兽医与动物繁殖学院，萨尔瓦多，巴伊亚，巴西

b 巴西卫生部，卫生与环境监督秘书处，公共卫生紧急情况司，巴西利亚，巴西联邦区

c 巴西公共卫生中央实验室（LACEN/BA），萨尔瓦多，巴伊亚，巴西

d 德国波恩大学病毒学研究所，波恩，德国

e 巴伊亚联邦大学埃德加尔·桑托斯教授医院感染病研究中心（HUPES/UFBA），萨尔瓦多，巴伊亚，巴西

f 巴伊亚州西部联邦大学，巴伊亚州巴腊多学科中心，兽医院，地理信息系统与One Health实验室，巴腊，巴伊亚，巴西

g 巴伊亚州农业保护机构（ADAB），萨尔瓦多，巴伊亚，巴西

h 巴西巴伊亚联邦大学，集体健康研究所，萨尔瓦多，巴伊亚，巴西

瑞典农业大学的动物福利、渔业与农业学院，于默奥，瑞典

文章信息

关键词：

地理处理

狂犬病病毒

分子生物学

系统发育学

人畜共患病

狂犬病

摘要

本研究旨在对2007-2009年间在巴伊亚州爆发期间，从55只实验室确诊的狂犬病阳性动物生物样本中检测到的狂犬病病毒株进行基因特征分析。提交进行狂犬病诊断的样本包括一头驴子、一只小刺鼻蝠（叶鼻蝠属）、两只食蟹狐（犬浣熊属）、八只普通吸血蝠（吸血蝠属）和43头牛。所有样本在直接免疫荧光试验（DAFT）、小鼠接种试验（MIT）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）中均呈阳性，随后进行核苷酸测序和系统发育分析。系统发育学展示了两个病毒进化枝，一个是特定于蝙蝠的，另一个是特定于食肉动物的，存在九个与吸血蝠属相关的亚簇，以及食肉动物特定病毒株感染牛的情况。系统发育分析揭示了一个复杂的流行病学情况，需要进一步阐明以改进狂犬病控制措施。

1. 引言

狂犬病是一种急性病毒性脑炎，可以影响所有哺乳动物物种，在人类中的致死率接近100%。全球估计每年有5.9万人死于由狗传播的狂犬病，总体经济成本约为86亿美元（世界卫生组织，2018年）。狂犬病是由一种单株、不分节、负极性RNA病毒引起的，属于弹状病毒科，狂犬病病毒属，该属包含14个物种（库津等人）。2011年；Marston等人，2012年）。狂犬病病毒物种，即经典的狂犬病病毒，是唯一具有全球分布的物种，也是在美洲检测到的唯一物种。该物种呈现多种毒株，主要通过食肉动物和蝙蝠传播（Rupprecht等人，2022年）。

在巴西，至少有七个与食肉动物、蝙蝠和非人灵长类动物相关的毒株记录（Caraballo等人，2024年；Rupprecht等人，2022年）。分子研究表明，在巴西野生犬科物种中出现了新的病毒株（Carnieli等人，2008年）。证据还表明，在蟋蟀食性蝙蝠中，从Myotis、Eptesicus、Nyctinomops、Molos sus、Tadarida、Histiotus和Lasiurus属中存在属特异性的谱系（Oliveira等人，2010年）。

巴西狂犬病病毒的遗传多样性（小林、井上等人，2007年，2007年）以及世界范围内的（Pinero等人，2012年），表明病毒适应其宿主的能力，并强调了诊断和病毒株的系统发育鉴定对于支持适当的流行病学推断的必要性，这一成就现在可以通过现代分子技术的发展来实现（Silva等人，2013年）。

本研究的目的是对2007年至2009年间发生疫情期间的巴伊亚州动物宿主体内的狂犬病病毒进行遗传特征分析，以及分析检测到的毒株的遗传地理分布，并描述分子数据。

2. 材料与方法

2.1. 样本

在这项研究中分析了55份脑组织样本：驴（Equus asinus）1份；小刺鼻蝠（Phyllostomus elongatus）1份；野生食蟹狐（Cerdocyon thous）2份；普通吸血蝠（Desmodus rotundus）8份，以及牛43份。样本来自巴伊亚州不同市的区域（表1）。普通吸血蝠的样本是在之前的研究中获得的（Carneiro等人，2010年），并储存在巴西巴伊亚州立大学兽医学与动物技术学院兽医传染病实验室（LIVE/UFBA）。其他物种的样本由公共卫生教授Gonzalo Moniz的中央实验室（LACEN/BA）获得。所有样本在研究中都通过直接免疫荧光法（DAFT）和鼠接种试验（MIT）检测出狂犬病毒阳性，并储存在-80°C下。

使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN®）进行RNA提取，使用30毫克脑组织置于Lysis tube P（Analytik-Jena®）中，在垂直涡旋Speedmill（Analytik-Jena®）中进行组织裂解。操作遵循制造商的建议。提取物储存在-80°C下。

2.2. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

按照Heaton等人（1997年）描述的方法，应用了半套式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）协议，针对核蛋白基因（N），并进行了一些修改。使用OneStep RT-PCR kit（QIAGEN®）进行cDNA合成和首次扩增，在23.5微升的混合物中进行，首次扩增引物的最终浓度为1.5微升提取的RNA。在单个步骤中，热循环仪被编程为55°C持续30分钟、95°C持续15分钟，接着进行25个循环，每个循环包括94°C持续20秒、53°C持续30秒和72°C持续30秒。第二个步骤使用Platinum Tag试剂盒（Invitrogen®）进行，取第一步的产物2μL和混合物23μL，引物的最终浓度为0.6μM。反应从95°C开始，持续2分钟，然后进行30个循环，每个循环包括94°C持续20秒、54°C持续30秒和72°C持续30秒。所用引物列表及其相应序列列于表2中。

半巢式RT-PCR的产物在2%的琼脂糖凝胶上可视化，用SYBR Safe DNA凝胶染料染色，并使用带有蓝光的Transilluminator Save Imager（Invitrogen®）观察。

2.3. 核苷酸测序

通过半巢式RT-PCR获得的扩增子使用Ampure试剂盒（Agencourt®）进行纯化。按照制造商的说明，使用Big Dye Terminator 3.1试剂盒（Applied Biosystems®）标记纯化后的产物。使用Cleanseq试剂盒（Agencourt®）进行第二次纯化后，使用System 3100（Applied Biosystems®）确定核酸序列。

获得的序列与GenBank中的其他序列（表3）进行比对，使用MEGA 5.2中的ClustalW算法。采用最大复合似然法并执行1000次自助法迭代，进行邻接系统发育分析。包含不确定碱基缺失的对齐位置被删除（完全删除选项）。系统发育树在MEGA 5.2中构建。

2.4. 地理分析

D. rotundus栖息地的GPS坐标和农村物业。

表1 本研究中进行测序的狂犬病阳性组织样本列表。

表2 用于半巢式逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测狂犬病病毒N基因的引物列表。

括号中的字母表示与引物相对应的基因型。DPL：DUVV、PV（狂犬病病毒）和LBV；E：EBL 1和2；M：MOKV；DLE2：DUVV、LBV和EBL2；ME1：MOKV和EBL1；P：PV（狂犬病病毒）。

b M：信使；G：基因组。

c 核苷酸的位置根据PV序列进行编号。改编自Heaton等人（1997年）。

采集样本的地点由国家农业防御机构（ADAB）提供。这些坐标使用QGIS 2.18进行空间分析。通过核密度分析评估狂犬病病例的浓度，从而识别高风险区域。基于估计的D. rotundus夜间觅食半径（约12公里）（农业部，2009年），使用缓冲区分析划定集群。

用于制作地图的其他空间数据，包括道路、水系、环境特征、铁路以及官方行政边界，均从巴西地理统计局（IBGE）提供的官方制图数据库获取，网址为https://www.ibge.gov.br/geociencias/organizacao-do-territorio/malhas-territoriais.html。

3. 结果

研究中使用的55份样本的DAFT和MIT阳性结果通过半巢式RT-PCR得到确认。系统发育分析表明，所有序列都属于狂犬病病毒裂谷病毒基因型1，并形成两个主要分支：一个由蝙蝠菌株组成，另一个由犬菌株组成（图1）。

样本的地理分布及其相应的遗传分类显示在图2中。图1和图2中以绿色标记的亚支系由来自巴伊亚州五个市的牛样本中的20个病毒序列组成：圣冈萨尔科斯杜坎普斯（n=1）、坎德亚斯（n=2）、费拉德桑塔（n=2）、圣弗朗西斯科杜孔（n=3）和圣阿马罗（n=12）。该亚支系中的序列与分析中包含的、已存入基因库的序列没有相似性。

图1和图2中以橙色标记的亚支系包括来自圣阿马罗（4头牛，1只蝙蝠）、孔塔热尤斯杜卡普斯（1头牛，2只蝙蝠）、坦基尼奥（1头牛，1只蝙蝠）、里查乌杜杜卡普斯（1头牛，1只蝙蝠）和圣冈萨尔科斯杜坎普斯（1只蝙蝠）市的7个牛序列和6个来自巴西蝠的序列。该亚支系还包括来自基因库的三个序列：两个来自巴伊亚州帕拉塔市的牛序列和一个来自伯南布哥州一头牛的序列（图1）（望月等人，2012年）。

我们的55个样本中有43个是牛，其中28个来自一个地区，包括圣阿马罗、索布拉尔、卡瓜伊尔、圣弗朗西斯科杜孔、孔塔热尤斯杜卡普斯、圣冈萨尔科斯杜坎普斯和圣方济各德圣塔市（图3）。在该地区，农业防御服务处在2008年至2009年间诊断出58头牛患有狂犬病，占同期巴伊亚州发现的牛狂犬病例的36.7%（58/158）。可以观察到病毒在该地区的三个亚支系的主导地位。（图3），其中两个（绿色和橙色）在发生范围上有部分重叠。第三亚属（紫罗兰色），由六个来自牛科的序列组成，限定在圣冈萨尔科斯杜斯坎普斯市（n=1）、索布拉尔市（n=1）、圣阿马罗市（n=2）和卡瓜伊尔市（n=2）的行政区划内，与其他亚属没有空间重叠。

序列RabV/BR/81/Phy elo/2008（图1中的粉红色菱形），在一个非食血蝙蝠（小矛鼻蝠Phyllostomus elongatus）中检测到，来自大都会萨尔瓦多地区市区，与来自圣保罗的序列聚集在一起，这些序列来自其他食果蝠，如Artibeus lituratus和A. planirostris（Shoji等人，2004年），然而仍在包含有在圣保罗鉴定的D. rotundus序列的亚属内（Heinemann等人，2002年）。

来自巴伊亚州南部三个市的牛科动物的四条序列，来自伊库伊市（n=2）、伊塔布纳市（n=1）和伊塔马拉朱市（n=1），用红色标记，未与该州检测到的其他变异相关联，聚集在来自戈亚斯州的D. rotundus序列的同一亚属内（Kobayashi、Sato等人，2007年）。来自巴伊亚州南部伊列乌斯的牛的一条序列也没有与巴伊亚州的其他序列聚集在一起，与来自里约热内卢州和圣保罗州的D. rotundus序列处于同一亚属（Ito等人，2003年；Vieira等人，2010年）。观察到的聚类模式可能表明病毒存在长距离传播，超出了州界，这暗示了需要在国家级别上进行协调行动，以监测野生动物狂犬病。

从野生犬科动物中分离出的病毒变种没有显示出显著的遗传差异，与GenBank中四个其他序列聚类在一起，其中三个来自巴伊亚州，一个来自皮奥夫州（Carnieli等人，2008年）。然而，它们与经典的犬狂犬病病毒（PV-M13215）无关，这表明在巴伊亚州传播的Cerdocyon thous的狂犬病病毒已经适应了这个野生宿主，并与犬类变种有所不同。在牛中检测到的两个序列（RabV/BR/o06/Bos tau/2008和……）

（狂犬病毒/巴西/o09/博茨瓦纳/2008）与C.thous（狂犬病毒/巴西/o01/塞尔斯托/2007和狂犬病毒/巴西/o02/塞尔斯托/2007）的序列聚类在同一亚分支中，这表明在巴伊亚州可能存在狐狸到牛的狂犬病传播，这在食草动物的典型狂犬病流行病学中是不常见的，通常与D. rotundus相关。

4. 讨论

对巴伊亚州样本的系统发育分析证实了翼手目和食肉目在维持和传播狂犬病病毒中的重要性，与其他巴西州的发现一致（Kanitz等人，2014年；Mochizuki等人，2012年；Schaefer等人，2005年）。蝙蝠相关序列分为九个亚分支（图1），突显了巴伊亚州内流通的狂犬病病毒的遗传多样性。

热点分布（图3）提供了牛群狂犬病阳性与D. rotundus存在以及提供蝙蝠栖息地环境之间的关系证据。这些环境包括有裂缝和小洞穴的山丘地形，以及有井盖和人行道下通道的道路和铁路轨道。这样的地形和基础设施特征常用作蝙蝠栖息地（小林等人，2008年；加西亚等人，2014年）并有助于牛群狂犬病病例的聚集。在之前的ADAB调查期间，在巴伊亚州识别出了D. rotundus（黑点）群落，其分布与岩洞、铁路轨道和道路的位置一致。

这些信息对于降低狂犬病传播风险和有效指导控制穿山甲种群的活动非常重要。更有针对性的方法可以帮助减少时间和成本，同时降低影响非目标物种的风险。此外，负责维护和监控道路及铁路的公司可以作为有关地下通道分布的宝贵信息来源，帮助识别不同狂犬病疫区内的潜在管理关注区域。

靠近水体的集群可能表明牛群活动集中在它们的边缘，牲畜在那里获取饮用水。该地区的特点是水体岸边有纤毛森林，这些森林通常作为吸血蝙蝠的栖息地。由于这些地区对狂犬病的主要野生媒介——普通吸血蝠——具有高度的环境适应性，农业防御部门应优先考虑对这些区域进行流行病学监测（农业部，2009年）。

### 5. 结论

系统发育分析表明，巴伊亚州野生和家畜中狂犬病的流行病学涉及至少10种狂犬病病毒株，其中9种与蝙蝠相关，1种与野生犬科动物相关，后者存在于牛群中。我们的发现突显了狂犬病复杂的流行病学网络，有助于理解狂犬病的生态流行病学模式，并为设计并实施人畜共患病控制计划提供信息。

贡献者声明

Aroldo J.Borges Carneiro：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。Jose Eduardo Ungar de Sa：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，形式分析，数据整理。Jan Felix Drexler：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，调查，形式分析，数据整理。Andreas Stocker：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，方法论。Flavia dos Santos：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，验证，概念化。Rafaela de Sousa Gonçalves：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，验证，数据整理。Dinah R. Dantas Becerra：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，形式分析，数据整理。Rogerio de Magalhães Cunha：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，形式分析，数据整理。Evandro Moraes-Silva：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，验证，概念化。保罗·桑塔纳：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，验证，监督。卡伊欧·格拉科·泽佩利尼：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，软件，调查。里卡多·卢斯托沙：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，验证，监督，概念化。卡洛斯·罗伯托·弗兰克：撰写-审核与编辑，撰写-初稿，验证，形式分析，概念化。

### 作者利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响到本文报告工作的财务利益或个人关系。

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