通过 RABV-G 结构域筛选和异源初免-加强免疫优化狂犬病 mRNA 疫苗功效

编码不同结构域的 RABV-G mRNA 被有效地封装到 LNP 中

编码 RABV-G 全长 （RABV-Full）、胞外域跨膜 （RABV-TE） 结构域、胞外结构域 （RABV-E） 或 RABV-R333Q 的 mRNA 抗原的长度（图 D）.1A） 的合成和表征。如图 1 所示。1B 中，所有 mRNA 均位于 1500 bp–2000 bp 处，长度按大小顺序为 RABV-Full=RABV-R333Q > RABV-TE > RABV-E。mRNA 琼脂糖凝胶的原始扫描显示在补充图 1 中。1. 所有 mRNA 的蛋白质表达如图 1 所示。1C，这表明 RABV-Full 和 RABV-R333Q 的蛋白条带高于 RABV-TE 和 RABV-E（图 D）。Western blot 的原始扫描结果显示在补充的图 1 中。2. 然后使用微流体方法将这些 mRNA 分别封装到 LNP 中。封装 RABV-Full、RABV-TE、RABV-E 和 RABV-R333Q 的 LNP 尺寸分别为 115.57 ± 3.79 nm、113.77 ± 4.53 nm、117.17 ± 1.89 nm 和 117.7 ± 1.61 nm（图 1）。所有代表粒径均匀性的多分散指数 （PDI） 均低于 0.3（RABV-Full 为 0.242，RABV-TE 为 0.188，RABV-E 为 0.251，RABV-R333Q 为 0.256）（图 D）。所有 mRNA 的包封效率均高于 80%（图 1E）。1F）。

狂犬病 mRNA 疫苗诱导的结合和中和抗体水平

为了评估不同结构域对疫苗免疫原性的影响，用 5 μg 剂量的 RABV-Full 、 RABV-TE 、 RABV-E 和 RABV-R333Q 对小鼠进行肌肉免疫。动物研究的实验程序如图 1 所示。2. 使用酶联免疫吸附测定 （ELISA） 检测结合抗体。如图 1 所示。3A 、 RABV-Full 和 RABV-R333Q 组在初次接种后 2 周诱导的 IgG 水平低于 IRV 组。截短的 mRNA 疫苗，包括 RABV-TE 和 RABV-E，诱导的水平显着低于其他疫苗。加强后，所有组均显示抗原特异性抗体水平升高（图 D）。RABV-Full 和 RABV-R333Q 组的抗体水平与 IRV 组相当，其次是 RABV-TE 和 RABV-E 组。通过快速荧光灶抑制试验 （RFFIT） 测定的病毒中和滴度 （VNT） 是评估疫苗诱导的狂犬病病毒保护作用的金标准。抗原特异性抗体水平和中和抗体水平之间也发现了类似的趋势，除了 IRV 组在加强注射后 2 周和 6 周显示出低于 RABV-Full 和 RABV-R333Q 组的中和抗体水平（图 D）。3C-E）。值得注意的是，RABV-R333Q 诱导的 VNT 高于 RABV-Full，尽管没有显着差异 （P > 0.05）。RABV-TE 的 VNTs 显著低于 RABV-Full 和 RABV-R333Q （P < 0.05），而 RABV-E 组仅接种细胞外结构域的 mRNA，几乎没有中和抗体。

狂犬病 mRNA 疫苗诱导的细胞免疫反应

尽管细胞免疫反应不能阻止细胞的初始病毒感染，但动物实验表明它对小鼠狂犬病病毒的清除很重要⁴⁴。此外，在接种疫苗的个体中也检测到狂犬病特异性 T 细胞克隆⁴⁵。因此，我们比较了不同狂犬病 mRNA 疫苗诱导的细胞免疫反应。加强免疫 2 周后，使用 ELISpot 测定评估细胞免疫反应。在不同序列设计的狂犬病 mRNA 疫苗中，RABV-Full 和 RABV-R333Q 产生的 IFN γ 最多的脾细胞（RABV-Full 每 10 个 6 个脾细胞 48.6 个斑点，RABV-R333Q 每 10 ⁶ 个脾细胞 48.6 个斑点），其次是 RABV-TE（23 个斑点）和 RABV-E（4.8 个斑点）（图 D）。4A， B）。使用流式细胞术测量抗原特异性 IFN-γ 、 TNFα 或 IL-2 阳性 CD4 + 和 CD8 + T 细胞的频率。结果如图 2 所示。4C、D 提示 RABV-Full 和 RABV-TE 诱导的 IFN-γ 阳性 CD4+ 和 CD8 + T 细胞水平相当，超过了 RABV-E 组诱导的水平，但低于 RABV-R333Q 组。此外，与 RABV-R333Q 组相比，RABV-E γ 阳性 CD4 + 和 CD8 + T 细胞显著减少。然而，TNFα 阳性 T 细胞和 IL-2 阳性 CD4 + T 细胞的频率在所有组间没有表现出明显差异（图 D）。4E-H）。除了 IL-2 阳性 CD8 + T 细胞外，RABV-R333Q 组表现出明显高于其他三种 mRNA 疫苗的频率（图 D）。4H）。

总之，这些结果表明 RABV-R333Q 和 RABV-Full 诱导了相当的细胞免疫反应，高于两种截短的 mRNA 疫苗 （RABV-TE 和 RABV-E）。由于组内变异性高，它们之间未发现统计学上的显著差异。

不同结构域或 R333Q 突变狂犬病 mRNA 疫苗诱导的保护效能比较

为了评价疫苗保护小鼠免受病毒感染的有效性，将小鼠随机分为 6 组，每组由 10 只小鼠组成。接种疫苗后，他们接受 CVS 脑内注射 （20LD50/0.03 ml） 激发，并观察 2 周。所有小鼠在攻击后的前 4 天存活下来。如图 1 所示。5A、B、RABV-R333Q 和 RABV-Full 提供了针对狂犬病病毒的最佳保护。两组小鼠的存活率均为 100% （10/10），体重在 2 周内没有减轻。RABV-TE 组的存活率为 70% （7/10），体重在实验过程中也表现出显著损失，这表明 RABV-TE 对狂犬病病毒的保护作用低于 RABV-R333Q 和 RABV-Full 组。IRV 疫苗的最终存活率为 80% （8/10）。最后，仅具有细胞外结构域的狂犬病 mRNA 疫苗无法为狂犬病病毒感染提供有效保护，最终存活率为 40% （4/10）。

总之，RABV-R333Q 和 RABV-Full 赋予小鼠对狂犬病病毒的完全保护，这比截短的 mRNA 疫苗（RABV-TE 和 RABV-E）更好。

RABV-Full 和 IRV 异源初免-加强免疫的免疫评价

在狂犬病 mRNA 疫苗的免疫评价中，我们注意到虽然 mRNA 疫苗在第二次免疫后产生了高水平的 VNTs，但第一次免疫时的早期抗体水平低于 1/20 人剂量的 IRV。因此，我们想知道 RABV-Full 和 IRV 的联合免疫是否可以提高狂犬病疫苗的早期和持久中和抗体水平。免疫程序如图 1 所示。6A、B.我们发现，与 mRNA 疫苗相比，IRV （1/20 人剂量） 诱导的免疫反应太低。因此，将 IRV 的免疫剂量调整为人剂量的 1/10。如图 6C 所示，2 × IRV、IRV > RABV-Full 和 RABV-Full+IRV 诱导了相当的结合抗体水平，在初免免疫后两周显著高于 RABV-Full>IRV 和 2 × RABV-Full mRNA 疫苗。加强免疫后，所有组均表现出抗原特异性抗体水平升高。有趣的是，RABV-Full+IRV 在所有组中引起了最高的结合抗体滴度（图 D）。6D）。

至于中和抗体，2 × IRV、IRV > RABV-Full 和 RABV-Full+IRV 诱导了相当的 VNT，在初免免疫后 2 周，其显著高于 RABV-Full>IRV 和 2 × RABV-Full（图 D）。然而，加强免疫后 2 周，mRNA 引发的免疫方案（2 × RABV-Full 和 RABV-Full>IRV）诱导的 VNT 高于 IRV 引发方案（IRV > RABV-Full 和 2 × IRV）或混合制剂（RABV-Full+IRV，图 5）。6F）。在加强接种后 6 周和 23 周仍存在类似现象（图 D）。6G， H）。值得注意的是，加强免疫后 25 周，RABV-Full 或 RABV-Full+IRV 组> IRV 组的 VNT 保持高于 IRV 组 2 × VNT（图 D）。IRV > RABV-Full（或 RABV-Full+IRV）和 2 × IRV 之间的差异也可能受到 RABV-Full 或 IRV 剂量的影响，这需要进一步调查。

ELISpot 结果显示，IRV > RABV-Full 组 IFN-γ+ 脾细胞频率显著低于 RABV-Full> 2 × RABV-Full 和 2 × IRV 组。值得注意的是，RABV-Full+IRV 组显示出与 2 × IRV 组相当的 IFN-γ+ 脾细胞频率（图 D）。7A， B）。对每组 （n = 10） 使用脑内病毒激发试验评估不同免疫方案的保护效果。所有小鼠在攻击后的前 4 天存活下来。如图 1 所示。7C、D、2 × RABV-Full 和 IRV > RABV-Full 为病毒感染的小鼠提供 100% （10/10） 的保护。RABV-Full>IRV 、 RABV-Full+IRV 和 2 × IRV 的生存率分别为 90% （9/10） 、 80% （8/10） 和 80% （8/10）。结果表明，IRV > RABV-Full 为 RABV-Full>IRV 或 RABV-Full+IRV 提供了更好的保护。

总之，我们的结果表明，RABV-Full 或混合制剂> IRV 触发了较高的短期抗体水平（初次接种后第 2 周），而 mRNA 引发方案（2×RABV-Full 和 RABV-Full>IRV）在加强疫苗接种后具有较高的中和抗体水平。IRV > RABV-Full 的保护效率高于 RABV-Full>IRV。

狂犬病 mRNA 疫苗和 IRV 的转录组学分析

疫苗诱导的免疫反应的速度和强度与各种免疫相关信号通路的上调或下调有关。为了更好地评估 mRNA 疫苗和 IRV 对小鼠免疫微环境的影响，我们对免疫后 24 小时收集的淋巴结进行了转录组分析。如图 1 所示。8A、B、KEGG 分析显示，IRV 组差异表达基因 （DEGs） 主要富集于病毒感染和先天免疫反应通路，如 RIG-1 受体信号通路、NOD-1 受体信号通路和胞质 DNA 感应通路。相比之下，响应 mRNA 疫苗的 DEGs 不仅在病毒感染和先天免疫反应 （RIG-1、NOD-1） 中富集，而且在细胞粘附、抗原加工和呈递、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF 信号通路和 IL-17 信号通路中富集。这些结果表明，与 IRV 相比，狂犬病 mRNA 疫苗可以更强烈地激活淋巴结部位的免疫相关信号通路。进一步的分析集中在参与抗原呈递和 B/T 细胞活化的基因的表达上，这与疫苗诱导的细胞和体液免疫反应有关。值得注意的是，如图 1 所示。8C-F 中，IRV 主要通过经典的 MHCII 通路和 B 细胞激活激活体液免疫。H2-Ab1、H2-Eb1、H2-DMa、Ciita 和 Apoe 等关键基因上调，增强抗原呈递并促进 B 细胞增殖和抗体分泌。相比之下，mRNA 狂犬病疫苗不仅激活 Ctss、Traf6 和 Trem2 等 MHCII 相关基因，还诱导参与抗原加工和免疫调节的基因 （Fcer1g、Pycard）。此外，mRNA 疫苗增强了 B 细胞（Pck2、Jak2）的代谢适应性，从而实现更强大、更高效的抗体反应。IRV 侧重于持续的经典体液反应，而 mRNA 疫苗会触发更广泛的免疫网络。mRNA 狂犬病疫苗通过激活 MHC I 通路和促进 T 细胞活化来强烈刺激细胞免疫。Tap1、Tap2、H2-K1 和 Calr 等基因上调，增强细胞内抗原加工和向细胞毒性 T 细胞的呈递。此外，T 细胞活化相关基因（包括 Tnfrsf4、Notch1 和 Jak3）高度表达，导致更强的效应细胞和记忆 T 细胞反应。相比之下，IRV 显示细胞免疫的激活有限，仅表达少数调节基因 （Foxp1、Ankrd28），主要与 T 细胞分化有关。这表明 mRNA 疫苗提供了更全面的细胞免疫反应，对于消除受感染的细胞和建立长期免疫至关重要。

mRNA 合成和体外表达

RABV-G 的 mRNA 序列如之前的研究⁵⁹ 中所述。一系列 pET-28a （+） 质粒，其携带编码全长 RABV-G 蛋白 （523 aa）、无 CD 的蛋白 （1-480 aa）、胞外结构域 （1-460 aa） 或 R333Q 突变体的 DNA 序列，分别用 5’、3′ 非翻译区和 80-nt poly （A） 尾合成（南京金斯瑞生物科技有限公司，中国）。对于 mRNA 合成，将 DNA 载体线性化，并使用 T7-FlashScribe™ 转录试剂盒（货号.No. C-ASF3507， Cellscript， USA）。UTP（尿苷 5′-三磷酸盐）被 N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（货号.No. N-1081-5， Trilink， San Diego， CA） 用于 mRNA 修饰。用 DNase I 消化 DNA 模板后，使用 Invitrogen 的 MEGAclear 转录纯化试剂盒纯化目标 mRNA。使用 ScriptCap™ Cap 1 加帽系统（货号.No. C-SCCS1710， Cellscript， USA）。使用变性琼脂糖凝胶电泳表征具有不同结构域的 RABV-G mRNA 的长度。

使用 western blot 检测不同 mRNAs 的蛋白表达。简而言之，将HEK293T细胞以每孔 2 × 10⁵ 个细胞的密度种植到 12 孔板中。培养 24 小时后，根据制造商的说明，使用 Lipofectamine 3000 试剂（L3000150，Invitrogen，USA）将 2 μg mRNA 转染到每个孔中的细胞中。转染 48 小时后，收集细胞，裂解细胞，并用 RABV-G 多克隆抗体 （PA5-117507， Invitrogen， USA） 进行蛋白质印迹分析。

mRNA 疫苗的制备

使用先前研究中报道的改良方法将所得 mRNA 封装到 LNP 载体中^60,61。简而言之，将不同长度的 RABV-G mRNA 和 R333Q 突变分别溶解到 100 mM 柠檬酸盐缓冲液 （pH 4.0） 中。将 mRNA 浓度调节至 0.17 μg/μl。制备含有 SM-102、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2000 的混合脂质乙醇溶液，摩尔比为 50：10：38.5：1.5，总脂质浓度为 12.5 mM。SM-102 购自 AVT Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.（中国上海）。DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2000 购自 Avanti Polar Lipids（阿拉巴马州阿拉巴斯特）。使用微流体混合器（Precision Nanosystems，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大）制造加载 mRNA 的 LNP。将 mRNA 溶液和脂质混合物的体积设置为 3：1 的比例。用 PBS 透析并用 Amicon 超离心过滤器 （EMD Millipore， Billerica， MA， USA） 浓缩后，将所得的 mRNA 疫苗储存在 4 °C 直至使用。使用 Zetasizer Nano ZS （Malvern Panalytical， Malvern， UK） 检测 mRNA-LNP 的大小和 zeta 电位。使用 Quant-iTTM RiboGreenR RNA 试剂盒 （Thermo Fisher， Eugene， OR， USA） 分析封装的 mRNA。

动物研究

30 只雌性 BALB/c 小鼠 （6-8 周龄，15-18 g） 购自辽宁昌盛生物科技有限公司（中国辽宁）。将小鼠随机分为 6 组 （n = 5），包括 PBS 组、5 μg 全长 RABV-G mRNA （RABV-Full）、5 μg 具有细胞质和跨膜结构域的 RABV-G mRNA （RABV-TE）、5 μg 具有胞外结构域的 RABV-G mRNA （RABV-E）、5 μg 具有 R333Q 突变的 RABV-G mRNA （RABV-R333Q） 和1/20 人剂量的灭活狂犬病疫苗 （IRV）。IRV 由长春 BCHT 生物科技有限公司（中国长春）提供。疫苗的效力高于 2.5 IU/ml。这些动物被饲养在特定的无病原体条件下，可以自由获得食物和水。通过肌肉注射 （im） 注射 mRNA-LNP 疫苗 （5 μg） 或体积为 100 μl 的灭活狂犬病疫苗进行免疫。初免免疫和加强免疫每隔 2 周进行一次。在初免免疫后 2 、 4 和 8 周从免疫小鼠中采集血样。

对于异源初免-加强免疫，将 30 只雌性 BALB/c 小鼠（6-8 周龄，15-18 g）随机分为六组 （n = 5）：1） PBS;2） 两剂 RNA-Full （2 × RNA-Full）;3） RABV-Full Prime 和 IRV boost （RNA-Full>IRV）;4） IRV prime 和 RABV-Full 升压 （IRV > RABV-Full）;5） RABV-全 + IRV （1：1）;6） 两剂 IRV（2 × IRV）。RABV-Full 的剂量为 5 μg，IRV 为人剂量的 1/10。对于 RABV-Full+IRV （1：1） 组，将 RABV-Full （2.5 μg） 和 IRV （1/20 人剂量） 混合进行免疫。免疫接种每两周进行两次。在初免免疫后 2 、 4 、 8 和 25 周从免疫小鼠中采集血样。动物研究按照《实验动物护理和使用指南》（国家研究委员会）进行，所有动物程序均由吉林大学动物福利与研究伦理委员会审查和批准（伦理批准号 2022YNPZSY1007）。

抗体滴度 ELISA

ELISA 的实验程序如既往研究^62,63 所述，浓缩的 IRV 溶液是从 Vero 细胞培养物中生长的狂犬病病毒的 aG 菌株⁶⁴ 中获得的。采集的病毒滴度为 10⁸TCID50/ml。病毒超滤浓缩，β-丙内酯灭活，柱层析纯化。将浓缩的 IRV 溶液在 Na₂CO 3-NaHCO₃ 缓冲液中以 1：100 稀释，然后加入体积为 100 μl/孔的 96 孔板中。然后，将 96 孔板在 4 °C 下孵育 12-16 小时，然后用 0.05% （v/v） 聚山梨酯 20 的 PBS （PBST） 溶液洗涤 3 次。用 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 封闭 1 小时后，将板与一系列稀释的血清样品在 37 °C 下孵育 1 小时，并用 PBST 洗涤 3 次。然后将 HR P 标记的山羊抗小鼠 IgG 、 IgG1 和 IgG2c 添加到 96 孔板中并孵育 1 小时。再洗涤 3 次后，以 50 μl/孔的体积加入 TMB 底物（Solarbio，中国北京）并孵育 25 分钟。通过 ELISA 读板器测量 450 nm 处的 OD 值（Gene Company，中国北京）。稀释因子和 OD 值采用线性回归分析进行。每个样品的抗体滴度定义为最高血清稀释度的 log10，产生阴性对照的 2.1 倍 OD 值。

快速荧光灶抑制试验

使用 RFFIT 法测定小鼠血清的狂犬病病毒中和抗体水平。简而言之，BSR 细胞在补充有 10% 胎牛血清（FCS，Thermo Fisher，Eugene，OR，USA）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，Sigma，St. Louis，MO，USA）和 1% 青霉素-链霉素（Thermo Fisher）中培养。将供试小鼠血清在 56 °C 下加热 30 分钟，并在 96 孔板中用含有 10% FCS （v/v） 的 DMEM 连续稀释 3 倍。RABV 毒株 CVS-11（攻击病毒标准品 11）由长春 BCHT 生物科技有限公司提供。然后用 DMEM 培养基将攻击病毒标准品 （CVS） 稀释至 4*10⁷ FFU/ml，然后以 100 μl/孔的体积加入稀释血清中。然后将血清 – 病毒混合物在 37 °C 下孵育 60 分钟。消化 BSR 细胞并以每孔 5 × 10⁴ 的密度加入 96 孔板中。培养 24 小时后，用 PBS 洗涤 BSR 细胞 3 次，并用 80% 丙酮溶液固定。用 PBS 再洗涤 3 次后，将 BSR 细胞与 FITC 偶联的抗核蛋白抗体 （1：200） 在黑暗中孵育 60 分钟。在显微镜下观察到的荧光病灶代表残留的狂犬病病毒。计算荧光病灶与整个孔面积的比率。狂犬病中和抗体的滴度通过 Reed 和 Muench 方法计算，并以国际单位每毫升 （IU/ml） 表示^62,65。

脾细胞的酶联免疫斑点测定 （ELISpot）

在加强免疫后 2 周收集免疫小鼠的脾脏。然后将脾脏在 70 μm 细胞过滤器 （BD， USA） 上研磨以制备单分散脾细胞溶液。将细胞溶液与氯化铵-钾 （ACK） 裂解缓冲液一起孵育 5 分钟以去除红细胞。以 300 g 离心 10 分钟后，将脾细胞重悬于含有 10% FCS （v/v） 和 1% 青霉素-链霉素（Thermo Fisher，美国）的 Roswell Park Memorial Institute （RPMI） 1640 培养基中。使用细胞计数器测定脾细胞的细胞密度，并调节至 1 × 10⁷ 个细胞/ml。然后将 100 μl 脾细胞加入 ELISpot 检测试剂盒（货号No. 3321-4HPW-10， Mabtech， Cincinnati， OH， USA）并与灭活狂犬病疫苗（1：100 稀释）孵育。在 37 °C 下培养 24 小时后，按照 ELISpot 测定试剂盒的方案处理细胞，并在 ImmunoSpot S6 通用阅读器 CTL 中观察和计数 IFNγ 斑点。

细胞内细胞因子染色

使用细胞内细胞因子染色和流式细胞术检测脾脏中活化的 T 细胞。简而言之，用灭活狂犬病疫苗（1：100 稀释）在 37 °C 下刺激 100 μl RPMI 1640（10% FCS）中的 1 ×⁶ 个脾细胞 2 小时，然后与蛋白质转运抑制剂混合物（500X，货号）孵育。编号 00-4980-93，Thermo Fisher）在 37 °C 下 6 小时以阻断细胞因子释放。然后将细胞与 Fc 受体阻断抗体在 4 °C 下孵育 10 分钟，并在 4 °C 下用抗 CD3-eFluor™ 506、抗 CD4-APC-eFluor™780 和抗 CD8-FITC 染色 30 分钟。 对于细胞内细胞因子染色，使用细胞内固定和透化缓冲液（Thermo Fisher）固定和透化脾细胞。然后，在室温下用 eFluor 450-TNF、PE-IL-2 和 APC-IFN-gamma 染色细胞 30 分钟，并用透化洗涤缓冲液洗涤。在 CytoFLEX 流式细胞仪（贝克曼，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）上使用流式细胞术分析活化 T 细胞的比例。

激发感染

为了对狂犬病 mRNA 疫苗进行序列筛选，将雌性 BALB/c 小鼠 （6-8 周龄，15-18 g） 随机分为 6 组 （n = 10）。用 100 μl 对照缓冲液或疫苗对小鼠进行免疫，包括 PBS、5 μg RABV-Full、5 μg RABV-E、5 μg RABV-TE、5 μg RABV-R333Q 和 IRV，人剂量为 1/10。免疫接种进行两次，间隔两周。加强免疫后 2 周，小鼠脑内注射 25 倍 50% 致死剂量 （LD50） 的 CVS-11。在接下来的 14 天内观察动物存活率和体重。排除在第 1-4 天死亡的小鼠。异源初免-加强免疫将雌性BALB/c小鼠（6-8周龄，15-18 g）随机分为6组（n=10），包括PBS、2×RABV-Full（5 μg + 5 μg）、RABV-Full>IRV（5 μg + 1/10人剂量）、IRV>RABV-Full（1/10人剂量+5 μg）、RABV-Full+IRV（2.5 μg/1/20人剂量+2.5 μg/1/20人剂量）和2 × IRV（1/10人剂量+1/10人剂量）。免疫接种进行两次，内部免疫接种两周。激发试验与上述相同。

淋巴细胞分离、RNA 提取和转录组测序

PBS 、 RABV-Full 和 IRV 组的 C57BL/6 小鼠 （每组 n = 3） 在免疫后 24 h 通过颈椎脱位实施安乐死。仔细解剖双侧腹股沟引流淋巴结 （dLNs） 并浸入 PBS 中。对每只小鼠的 dLN 进行单独处理以进行 RNA 测序。为了释放淋巴细胞，使用无菌技术轻轻挤压淋巴结，并过滤细胞悬液以去除碎片和组织碎片。然后通过离心收集淋巴细胞，重悬于 TRIzol 试剂中以稳定 RNA，并计数以确保至少 1 × 10⁶ 个细胞用于 RNA 提取。在此之后，根据制造商的方案从 TRIzol 重悬的细胞沉淀中提取 RNA，并使用片段分析仪进行定性和定量分析。经过质量检查的 RNA 随后使用 BGI（中国深圳）的 DNBSEQ 平台提交进行 RNA 测序 （RNA-Seq），包括文库制备、测序和原始数据生成。

转录组学分析

从原始测序数据中删除低质量的标签或序列，以保证后续分析的准确性和可靠性。然后将清理后的标签定位到 Mus musculus 的参考基因组 （NCBI： GCF_000001635.26_GRCm38.p6）。对映射数据进行主成分分析，以可视化并确保测序数据的质量和可重复性。使用 DESeq2 分析 DEGs，|log2 （倍数变化）|>1，P调整值为 < 0.05。进行 KEGG 分析以研究 mRNA 疫苗和 IRV 的生物过程。这些基因的表达水平（以每百万个映射片段中每千碱基的外显子模型片段数测量）使用 z 分数转换进行标准化，以生成热图图，直观地表示所选基因在不同样本中的表达模式。

统计学

数据以平均值±标准差表示。使用 GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，然后进行 Tukey 检验。p 值 <0.05 被认为具有统计学意义。