狂犬病病毒可以抗强大的天然免疫

狂犬病病毒可以抗强大的天然免疫

Benjamin Mallory Davis and Matthias Johannes Schnell

摘要

与适应性免疫反应不同，天然免疫系统提供了一种非常快速的防御入侵病原体的机制，适应性免疫反应需要几天时间来使细胞扩增和分化，直到它们适合承担效应功能。通过病原体识别受体对病原体相关分子模式的识别的先天反应触发了对病原体的初始炎症反应。狂犬病病毒诱导天然免疫反应，包括细胞反应和产生抗病毒细胞因子，如Ⅰ型干扰素，从而减缓病毒的传播。反过来，狂犬病病毒已经进化来规避天然免疫反应。

介绍

狂犬病病毒（RABV）天然免疫的主要协调者是细胞因子的Ⅰ型干扰素家族。这些蛋白是响应在细胞质中检测到的病毒分子模式而上调的，以自分泌和旁分泌的方式起作用，刺激数百个干扰素刺激基因(ISGs)的表达，这些基因具有不同的且通常未知的抗病毒功能。从病毒检测到干扰素上调，到细胞检测到干扰素的信号通路，最后到ISG，上调在每一步都被不同的病毒破坏，包括RABV。对RABV对抗干扰素系统的最佳理解是磷蛋白(RABV-P)，它通过两种不同的机制抑制干扰素和ISG的上调。RABV还使用更通用的方法来避免检测，例如将新生颗粒隔离在相分离的包涵体中，并在核蛋白产生时将其潜在的免疫刺激性RNA基因组包裹在核蛋白中。

尽管干扰素起着核心作用，但RABV的天然免疫并不完全依赖于一个功能性的干扰素系统。IFN-α受体(IFNAR)是I型IFN的唯一细胞受体，因此是典型IFN反应的绝对要求，尽管死亡率较高，但缺乏IFN-α受体(IFNAR)的小鼠偶尔能在实验性RABV感染中存活。该综述探讨了RABV天然免疫的干扰素依赖性和非依赖性机制，以及RABV为破坏这些机制而采取的各种对策。强调了RABV天然免疫不同于相关病毒如水泡性口炎病毒(VSV)的那些方面。

病毒分子模式的检测和反应

同所有免疫信号通路一样，干扰素反应始于非自身分子模式的检测。RNA病毒最重要的模式识别受体是RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)、维甲酸诱导基因I(Retinoic-acid-inducible gene I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(melanomadifferentiationassociatedgene5,MDA5)和实验遗传和生理基因2(laboratoryofgeneticsandphysiology2,lgp2)。RLRs是死亡盒RNA解旋酶家族的成员，它影响许多其他细胞过程，包括RNA结合和RNA二级结构的改变。此外，RLRs是Dicer相关解旋酶(DRH-1)的同源物，负责线虫中的抗病毒RNA干扰。下游信号依赖于N末端半胱天冬酶激活和募集结构域(CARD)，以及一个中央三磷酸腺苷依赖性解旋酶结构域，其识别RNA配体。Lgp2中缺少CARD结构域，这使得Lgp2有可能作为干扰素激活的负调节因子。RIG-1是第一个卷入IFN回应的RLR。早期的研究表明，RIG-1能识别dsRNA，尽管精确的RNA配体在一段时间内仍然是反向的。RIG-1与RABV的联系是通过以下证据建立的:RABV相关的干扰素刺激可以通过RIG-1的过表达在体外得到增强，并通过显性-阴性RIG-1突变体的表达得到抑制。转染各种RABV相关的RNA——包括单链RABV基因组、RABV前导RNA(leRNA)和来自RABV感染细胞的大量RNA——在体外刺激干扰素的产生，但在酶去除5′-三磷酸后停止。这一证据表明，除了检测磷酸化的dsRNA，RIG-1还检测单链基因组或前导RNA，这一结果得到了其他研究的支持。通过对RIG-1进行更详细的结构检查，发现非自身RNA是基于5′-三磷酸和第一个核苷酸的2′-氧位缺乏甲基化而被检测到的核苷酸。这种对RIG-1配体的分歧源于这样一个事实，即当5′-三磷酸RNA首次由细胞和病毒产生时，它总是2′-氧未甲基化的。

MDA5被认为只识别末端钝的dsRNA，最初被认为主要与正链微RNA病毒感染有关。然而，体内实验表明，两种主要的病毒感应RLRs之间有更复杂的功能重叠。例如，在RIG-1和MDA5基因敲除小鼠中，ISGs由多种RNA病毒诱导。在感染RABV的RIG-1基因敲除小鼠骨髓间充质干细胞中，干扰素诱导被延迟，但没有完全消除。RLR抑制剂Lgp2起着不明确的作用:Lgp2的过度表达抑制了体外RABV感染后的干扰素表达，但矛盾的是降低了体内RABV的死亡率。此外，还不知道在特定的感染中检测到了哪些病毒来源的RNA。对于大多数的RNA病毒，包括RABV，在RNA生产的早期，病毒编码的RNA加帽活性消除了5′-磷酸和2′-氧未甲基化的RNA。基因组和抗基因组RABV RNA在5’没有被加帽或甲基化，但在核蛋白中很快被包裹，这可能保护它们免受RIG-1的检测。因此，RABV的生理性RLR配体似乎最有可能是前导或拖尾RNA，它们是无帽且未被包裹的，或者是异常的复制RNA，如缺陷干扰RNA。

在检测到RABV病毒RNA后，RIG-1通过一个特有的信号通路刺激干扰素的产生。RNA结合使环磷酸腺苷-1的环磷酸腺苷结构域与线粒体膜蛋白IPS-1的环磷酸腺苷接触(也称为线粒体抗病毒信号蛋白、病毒诱导信号衔接子或Cardif)，这是所有RLR的共同衔接子。IPS-1成为蛋白复合物的支架，该蛋白复合物募集并激活TANK结合激酶(TBK-1)和(在免疫细胞中)IKK-1。这些激酶磷酸化并激活转录因子IFN调节因子(IRF)-3和IRF-7，它们传递到细胞核与IFN生产的启动子结合。

该途径的一些元件，最显著的是IRF7和RLRs，它们本身是干扰素诱导的，产生正反馈环。非RLR RNA解旋酶如DEAD-box解旋酶3 (DDX3)可增强RLR活化的早期阶段，DEAD-box解旋酶3也结合IPS-1 。DDX3和其他辅助蛋白在RABV感染中的作用还没有被具体研究。对其他病毒的新兴研究表明，RLR途径的调节蛋白经常是病毒蛋白抑制的目标。

这种信号级联反应的产物，即Ⅰ型干扰素蛋白，通过一个独立的Janus激活激酶(JAK)-STAT依赖性途径发出信号。I型干扰素仅由干扰素受体检测，其在大多数哺乳动物细胞类型的表面表达。干扰素结合导致干扰素受体寡聚化，引发受体被酪氨酸激酶磷酸化。磷酸化受体成为信号转导和转录激活因子(STAT)-1和STAT2的对接位点，它们被JAK磷酸化。STAT1和STAT2之间随后的二聚化产生了一个新的核局部化信号，该信号结合转录因子IRF-9并转位到细胞核。该复合物与ISRE相互作用，后者是胰岛素样生长因子的启动子元件，完成第一型干扰素信号通路。

RABV-P依赖性的干扰素信号转导的颠覆

RABV磷酸化蛋白P最初被认为是RABV多聚酶的辅因子，现已成为一种多功能蛋白，在干扰素诱导和干扰素应答水平上抑制干扰素信号传导。蛋白P以全长蛋白和四种截短形式表达，由内部AUG起始密码子的核糖体起始产生。全长蛋白是最丰富的蛋白质产物，但截短的同种型在破坏抗病毒免疫中起关键作用。

当发现表达绿色荧光蛋白-β融合蛋白的重组RABV(RRBv)代替野生型P时，发现P对干扰素应答的影响仅在缺乏干扰素应答的细胞中复制。酵母双杂交筛选揭示了STAT1和P之间的直接相互作用。这种相互作用映射到P、Y689和Y701上的两个特定残基上，这两个残基分别负责STAT1/2二聚化和核易位。在同一研究中，外源性表达的磷蛋白足以阻止核STAT1/ 2对干扰素的反应。磷蛋白和STAT1/2共免疫沉淀在干扰素处理细胞的提取物中，而不是在干扰素未处理的细胞中，表明磷蛋白可以被认为是干扰素依赖性干扰素拮抗剂。核和细胞质形式的磷蛋白都参与了这一过程。这种活性需要在胞质上有一个核定位序列，尽管胞质截短的P亚型在细胞质中保留STAT1/2也在中起作用。

在一项独立的研究中，观察到被设计来表达降低的磷蛋白水平的rRABVs诱导了IRF3磷酸化、二聚化和核输入的水平的极大提高。丙氨酸氨基转移酶结合区的缺失并没有消除这种变化。丙氨酸氨基转移酶的扫描诱变揭示了一种单独的干扰素信号抑制机制，其中一个小的内部结构域(氨基酸176-186)驱动抑制IRF3激活。因此，可以说磷蛋白抑制了干扰素的产生和反应性。

磷蛋白抑制干扰素系统的能力在体内具有功能性后果。在嵌合的rRABV CE株(NiP)中，非致死性Ni-CE疫苗株的蛋白被攻击株 Nishigahara的蛋白所取代。这显著增加了肌肉内接种后小鼠的致病性，这可以通过对的STAT结合位点进行进一步突变而完全消除。在相应的N和G蛋白的替代物中发现了小得多的致病性升高，而在M和L蛋白中则完全没有，强调了磷蛋白在决定疾病结果中的影响。

后续研究已经阐明了截短的P亚型在体内的作用。在一个实验中，消除了Nishigahara 株P基因起始密码子，产生了一个仅表达全长P的的嵌合体。这些突变降低了肌内接种后的致病性，但没有降低颅内接种后的致病性，这表明磷蛋白在决定RABV神经侵袭性中具有特殊作用。对这一现象，一个的可能解释建立在现有证据的基础上，即P蛋白与动力蛋白微管网络（MT）要么直接要么间接的相互作用。RABV与 MT相互作用和神经侵袭的功能重要性是正在进行的研究的主题:在表达单个P亚型的rRABV中，一个突变足以抑制病毒MT相互作用和干扰素拮抗作用。

单个干扰素刺激基因(ISGs)的作用

1型干扰素诱导数百个基因表达。由于不同的病毒激活相同的IFN表达和反应途径，因此不能认为单个ISGs对单个病毒感染是重要的，然而，它们可能在感染后高度上调。在少数被充分研究的ISGs中，只有少数被证明是RABV感染过程中的限制因子。尽管2’-5’OAS和RNA酶L系统对许多病毒感染有显著影响，但它似乎不影响弹状病毒的复制。另一个ISG家族，粘液瘤病毒GTPases (Mx1和Mx2)，限制VSV，但是仅当在人细胞中表达为牛白蛋白而不是人白蛋白时，才抑制RABV的复制。蛋白激酶R (PKR)，也是VSV的一个限制因子，对RABV的正常干扰素反应来说是不可或缺的，如同在同一研究中的RNA酶L和Mx1一样。在那些被普遍研究的剩余免疫球蛋白重链抗体中，有令人信服的证据表明PML蛋白和Ifit家族的一个成员Ifit2具有抗RABV的限制性。

早幼粒细胞白血病蛋白（Promyelocytic leukemia，PML）主要在细胞细胞核表达，在那里它形成了PML核体的支架(PML-NBs)。干扰素反应是触发PML-NBs形成的其他几种细胞应激源之一，也包括DNA损伤和氧化应激。PML和RABV之间有一种直接的相互作用:在RABV感染后，PML结合全长P蛋白和含有核输入信号但缺少输出信号的P3亚型，在细胞核被隔离。在同一项研究中，来自PML基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)使RABV的滴度提高了20倍。一种特异性PML亚型PML IV的重建足以将RABV的生长抑制至接近野生型水平。PML IV介导的RABV限制性的确切机制尚不清楚，但PML生物学的某些方面可能会提供线索。例如，PML对Ⅰ型干扰素引发的凋亡途径至关重要。鉴于RABV毒株的相对毒力与细胞凋亡负相关，这本身可以被认为是抵抗RABV感染的一种机制。

干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白 2 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2，IFIT2)(或ISG54)是干扰素诱导的四肽重复序列(Ifit)蛋白家族的成员，以决定其结构的蛋白相互作用结构域命名。如果蛋白质位于细胞质中并且没有已知的酶功能。最具特征的Ifit蛋白是Ifit1(或ISG56)，它限制许多正链RNA病毒在体外的复制，但不是大多数负链病毒测试。而只有Ifit1有一个明确的RNA结合配偶体——5’-甲基鸟苷帽，但2’O-非甲基化RNA(“CAP0”)—Ifit2对体内RABV致病性有最大影响。这可能是由于在RABV感染过程中缺乏CAP0，因为RABV使用了一种不包括Ifit1配体作为中间体的RNA成熟途径。还发现了RNA和干扰素2之间的相互作用，尽管这些相互作用和病毒生命周期之间的关系还不清楚。尽管纯化的人干扰素α2不具有干扰素α1与CAP0-RNA的相互作用，但它减缓了短的(1216个核苷酸)多聚RNA的移动性，无论是否有5个磷酸。在同一研究中，Ifit2晶体结构所提示的特定氨基酸残基的突变可以消除迁移率偏移。然而，本研究中使用的RNA与病毒致病性之间的联系存在争议，因为尽管这些多聚RNA形成dsRNA双链体(这意味着Ifit2可能与dsRNA结合)，但它们的短长度(< 30 nt)使它们很可能无法与内源性siRNAs和microRNAs区分开来。Ifit相互作用的进一步复杂化验证是IFN触发的IFIT蛋白的同源和异源二聚化成结构域交换的复合物，其比单个单体更可能是RNA相互作用的功能单位。基于Ifit1 和Ifit2 与真核翻译起始因子复合物(eIF)相互作用并在体外阻断翻译的事实，Ifit蛋白的抗病毒机制被认为是病毒信使RNA翻译的空间位阻。

干扰素-对RABV的非依赖性天然免疫

尽管IFN系统显然是首要的，但天然免疫的其他几个方面对RABV感染有影响。IFNAR基因敲除小鼠，其细胞缺乏任何类型1干扰素敏感性，仍然从一些实验性RABV感染中恢复，尽管不太常见。尽管不可能将嗜中性粒细胞描述为真正的“干扰素非依赖性”，除非特异性地使用不具干扰素能力的细胞或动物模型(如干扰素受体敲除小鼠)，但对RABV和相关病毒的研究偶尔会描述不涉及任何干扰素途径或任何ISG的抗病毒机制。这些细胞防御——以及RABV破坏它们的过程——揭示了病毒和宿主之间的动态关系。

病毒成分与细胞质的物理分离可能在RABV免疫逃避中起作用。细胞质内含物被称为尼基尔体(NBs)，在组织学上是RABV的关键诊断，是病毒复制和粒子组装的位点。最近的一份报告表明，NBs与其他液体细胞器(如内体)有某些相同的性质:液相内部、融合形成更大的结构和球形。这一证据表明，除了促进装配外，内含物如NBs还阻止细胞质模式识别受体接近它们的病毒配体。一种可能的对策涉及细胞应激颗粒，在神经干细胞和积聚的病毒信使RNA附近观察到。在该报告中，对应激颗粒形成抑制增加病毒的体外复制和翻译，这是一种尚未探索的抗病毒机制。

此外，NBs可能招募干扰天然免疫信号的细胞蛋白。尽管只有核蛋白和磷蛋白的表达才能形成一个微小的类NB包涵体，但在感染过程中，NBs含有一系列非病毒衍生的产物。TLR3，dsRNA的一种内体受体，在神经干细胞中发现，并已被证明是形成神经干细胞所必需的。尽管传统上认为TLR3是免疫系统的一个组成部分，但TLR3基因敲除小鼠在感染狂犬病病毒后降低了致病性。细胞伴侣蛋白Hsp70也在NBs中积累，与RABV核蛋白相互作用并积极调节感染。此外，许多富含NBs的其他细胞蛋白质是多泛素化的。这被认为是对最初为DNA病毒提出的假说的支持，病毒劫持了通常将错误折叠的蛋白质隔离成伴侣蛋白和泛素化的富含蛋白质的聚集体的细胞过程。

在这个提出的模型中，在自噬过程中保护错误折叠蛋白的细胞支架被病毒所吸收，在装配过程中进行分隔和自我保护。自噬和病毒感染之间的相互关系是其他几种负链RNA病毒的活跃研究领域，尽管只有少数研究专门探索了弹状病毒。体外VSV感染后的自噬诱导被定位于病毒糖蛋白的特定区域，该工作已扩展至体内鱼类弹状病毒G蛋白。用自噬调节药物减轻实验性RABV感染的一次尝试已经显示出有希望的结果，尽管RABV生命周期的具体步骤受到影响，以及与NBs的关系(如果有的话)，仍有待阐明。

与NBs相反，宿主采用一种类似于相分离的方法来抵抗RABV:许可细胞和相邻非许可细胞之间的分离，以及内皮血脑屏障(BBB)的分离。在体内RABV感染期间，病毒生长和宿主防御的细胞定位起着关键作用。例如，有证据表明，在实验性颅内RABV感染期间，流产感染的星形胶质细胞可能是干扰素的来源，限制了病毒的增殖。这是一个有效的对抗干扰素抑制的方法，因为非许可的星形胶质细胞不太可能表达足够的磷蛋白来对抗ISG诱导和干扰素信号的放大。这样，在自然(相对于颅内)感染期间，RABV对神经元的排他性偏好可以被视为一种避免天然免疫反应的手段。在类似的意义上，血脑屏障作为一种生理屏障，可以用来对抗呼吸道合胞病毒。在呼吸道合胞病毒感染期间，血脑屏障通透性增加，使细胞因子和抗体等免疫效应物进入中枢神经系统。这一现象被认为部分解释了人类狂犬病患者在医学诱导的昏迷中的存活，并且此后被许多动物研究详细阐述，尽管其与该患者存活的整体相关性仍有争议。

最后，近年来人们考虑了RNA干扰(RNAi)在抗RNA病毒感染中的作用，尽管还没有直接研究过RNA病毒。普遍认为，哺乳动物和其他脊椎动物细胞的先天抗病毒防御与植物、真菌和无脊椎动物细胞的本质不同，后者缺乏干扰素系统。在这些生物体中，细胞通过将病毒RNA中间体加工成短的、约22 nt病毒衍生的小干扰RNA(vsiRNAs)来对病毒感染作出反应，这些小干扰RNA与病毒RNA杂交并激活RNA诱导的沉默复合物(RISC)。近年来，对IFN敏感的[哺乳动物]细胞保留抗病毒RNAi 的问题出现了争议。特别是，RIG-1和线虫抗病毒RNAi的协调者DLH-1之间的进化关系，使得这成为一个有趣的假设。

哺乳动物抗病毒RNAi的证据有好有坏。感染脑肌炎病毒(mESCs一种小RNA病毒)揭示了明显的vsiRNAs，其不存在于等基因Dicer敲除细胞系中。在相同的细胞中，一株野田村病毒(Nodamura virus，NoV一种蚊子传播的(+)ssRNA病毒)缺乏非天然的B2蛋白(一种以前已知的RNAi抑制剂)，也引发了vsiRNAs的产生，并且生长不良。RNAi途径的基因消融挽救了NoV的复制，强烈提示抗病毒RNAi。在单独的BHK细胞模型中，与B2或埃博拉病毒VP35的反式互补具有相同的效果，VP35在哺乳动物细胞中被认为是RNAi的抑制因子。最后，一项关于293T细胞IAV生长的研究最近发现了类似的结果。

然而，哺乳动物RNAi和病毒限制之间真正的干扰素非依赖性联系尚未建立。抗病毒RNA和干扰素系统的功能分离是困难的，因为已知的病毒RNA生产抑制剂(野田村病毒-B2，埃博拉病毒VP35和其他)也与干扰素途径相互作用。就观察到的程度而言，哺乳动物抗病毒RNAi必须通过抑制在感染过程中强烈抑制它的IFN系统元件(如Lgp2 或通过大规模抑制IFN信号传导来“揭示”。然而，尽管有这种限制，病毒靶向RNAi的潜在应用已经被提出，例如被感染细胞的miRNA靶向体定位，或向性和毒性的遗传操作。为此，使RABV成为跨神经元追踪的首选工具的那些特性——神经元的排他性感染、跨突触传播和持续的非溶解感染——可能使RABV成为研究RNAi的有希望的背景。

结束语

对RABV的天然免疫代表一个重叠的细胞通路网络，以IFN系统为中心，但不仅限于IFN系统。这一网络是古老竞赛的结果，它包括了所有RNA病毒共有的成分和RABV或RABV相关的狂犬病毒特有的成分。考虑到治疗病毒性脑部疾病所固有的挑战，设计一种疗法可能需要一点点的理解。甚至那些可以被认为已经解决的RABV免疫的方面，如典型干扰素途径，或干扰素。早在20年前，RABV-P的抑制作用几乎是未知的。这项研究有许多应用，特别是考虑到重组DNA技术和计算基因组学的平行成熟。直接表达免疫刺激分子或在免疫颠覆位点精确受损的RABV可能构成下一代RABV疫苗。通过更好地理解宿主对RABV的反应，特别是在跨神经元追踪领域，开发新的研究工具也成为可能。最后，这种不断增长的理解为狂犬病治疗干预的发展带来了新的希望。

致谢：

本章节：Rabies Little Virus Against Powerful Innate Immunity

作者：Benjamin Mallory Davis and Matthias Johannes Schnell

原书：ISBN 978-3-030-21083-0 ISBN 978-3-030-21084-7 （eBook） https：//doi.org/10.1007/978-3-030-21084-7