肯尼亚蝙蝠携带的Duvenhage病毒导致人类狂犬病死亡:昏迷诱导、氯胺酮和抗病毒药物治疗无效

介绍

狂犬病，由狂犬病病毒引起的脑炎，被认为是普遍致命的，直到一名年轻的，未接种疫苗的蝙蝠狂犬病患者在新的治疗方法后存活[1]。该患者的长期良好结果表明，成功的干预是可能的[2]。然而，11名患者，随后以类似的方式治疗，没有存活(由Wilde等人审查。[3]).其中六名患者的信息已经公布[4]–[8]；其他五个在评论中提到[3].

我们报道了一例肯尼亚蝙蝠携带的杜文哈格病毒引起的狂犬病患者。在中报告了对该病例的非常简短的描述，没有临床细节，也没有病毒学和病理学研究的结果欧洲监控 [7]。该报告被收录在Wilde等人的综述中。[3]。我们现在更详细地介绍这位患者，并提供病毒学和病理学研究的结果。我们从患者的丈夫那里收到了发表该病例报告的书面同意书。

个案报告

在肯尼亚西察沃国家公园的露营地，一只蝙蝠飞向一名34岁的荷兰女医生的脸。她把动物推开，注意到它鼻子右侧有两个小的表面出血伤口。用水和肥皂清洗伤口，并用酒精棉签清洗。公园管理员和附近医疗机构的工作人员向她保证，当地的狂犬病只知道是由狗和猫传播的。她没有被推荐进行暴露后预防。

在她回到荷兰的14天后，也就是蝙蝠事件发生的23天后，她抱怨身体不适、头晕、肌肉疼痛和头痛。她没有发烧。两天后，她出现了说话和吞咽困难。两边脸颊都有知觉缺失，她感到不稳定。她吐过一次。第二天，也就是抱怨的第四天，她被隔离了。她过去的病史并不明显，她没有服用药物。

检查时，她很焦虑，但很警觉，方向也很明确。她的体温和其他重要参数都正常。没有唾液分泌过多、恐水症或恐气症，也没有吞咽困难。鼻子上的伤口解决了；没有痒和痛。她有轻微的构音障碍，说话断断续续。除了双颊感觉迟钝，进一步的神经病学检查并不明显。深层腱反射正常。根据国家传染病协调中心(NCCID)的建议，她接受了人抗狂犬病免疫球蛋白(HRIG)，20 IU/kg肌肉注射，分在两侧股四头肌，以及人二倍体狂犬病疫苗(Mérieux)肌肉注射(入院第1、4、8和15天)。其他感染，如裂谷热、西尼罗热、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、黄热病、肠道病毒71型和李斯特氏菌通过适当的试验(免疫荧光或酶联免疫吸附试验、血液和脑脊液(CSF)培养、血玻片和CSF显微镜检查、肠道病毒(包括肠道病毒71型)PCR)考虑并排除了感染、疟疾和锥虫病。神经方面的考虑包括嗜神经病毒感染、急性播散性脑脊髓炎，以及最初的焦虑症。入院第2天，她的体温为38.5°C，构音障碍加重，并抱怨吞咽困难。她很激动，双手有高频率的姿势性震颤。

血清、CSF 和颈项活检被送至鹿特丹伊拉斯谟医学中心病毒学系狂犬病参考实验室。CSF 显示 12 个白细胞（淋巴细胞）/3 mm³ (n<5），无红细胞，蛋白质水平为 0.23 g/L （n<0.5），葡萄糖水平为 3.0 mmol/L（血糖 4.9 mmol/L）。在接下来的几天里，她的构音障碍加重了。她抱怨胳膊和腿无力和复视。她出现了流涎过多，并对噪音产生了过度反应。她的体温波动不定，伴有发热，最高可达 39.2°C。 入院第 6 天，病情急剧恶化;她癫痫发作并误吸，由于呼吸功能不全，氧合下降。她管并入住重症监护病房 （ICU）。CSF 现在显示 64 个白细胞（未进行分类计数）和 25 个红细胞/3 mm³，蛋白质水平为 0.72 g/l，IgM 指数升高为 0.35。MRI 显示延髓和脑桥后部 T2 加权图像上的信号强度区域增加（图1）。第二天，她昏昏欲睡，颈项僵硬。她回应声音睁开眼睛，她用左手挤压，并按照命令移动她的双腿。她有水平和向下凝视麻痹。手臂的深部腱反射不存在，而腿部反射正常。

图1入院第六天做核磁共振成像。

住院后第6天，因杜文哈格病毒感染而患狂犬病的患者的轴向T2加权图像；延髓后部的高信号(箭头)。

狂犬病似乎是脑炎的可能原因，但也考虑了格林-巴利综合征(GBS)的咽-颈-臂变异型。在接种疫苗前收集的血清或入院第2天的血清或脑脊液中未检测到狂犬病特异性抗体，以及狂犬病病毒-特异性RT-PCR在那些标本中是阴性的。在入院第2天获得的颈部活检，在巢式RT-PCR中，仅在一式四份样品中的一份样品中，在琼脂糖凝胶上显示出正确大小的弱带，因此需要通过克隆和测序来证实[9] (方框1).对于GBS，开始用静脉注射免疫球蛋白0.4 g/kg/d治疗5天，对于单纯疱疹性脑炎，开始用阿昔洛韦10 mg/kg治疗5天，每天3次(血清和CSF中单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒的PCR证实为阴性)。在确诊狂犬病之前，用于幸存狂犬病患者的治疗方案[1]在向其丈夫和家人提供信息并征得其同意后，于入院第7天开始。治疗包括用戊巴比妥4毫克/千克/小时、咪达唑仑5毫克/小时和氯胺酮100毫克/小时诱导昏迷；连续监测EEG，并滴定戊巴比妥和咪达唑仑以抑制爆发，即每分钟最多4次爆发。第二天(入院第8天)开始通过鼻胃管给予抗病毒金刚烷胺100 mg，每天两次，从第12天开始加入利巴韦林iv，每天4次，每次1 g。从第15天开始给予四氢生物蝶呤和辅酶Q10。用头孢噻肟1 g静脉注射治疗并发肺炎，每天4次，共5天。常规ICU程序，预防性施用低分子量肝素，通过连续施用5%葡萄糖和胰岛素调节血糖水平，并选择性清除消化道污染(SDD)[10]被应用。SDD包括每日四次向口腔施用0.5 g含2%多粘菌素E、2%妥布霉素和2%两性霉素B的口腔糊剂，以及每日一次通过鼻胃管施用100 mg多粘菌素E、80 mg妥布霉素和500 mg两性霉素B。

在入院第11天，从入院第2天开始的颈部皮肤活检标本中证实存在Duvenhage病毒。这可能看起来是一个很长的延迟，但PCR测试的两个琼脂糖凝胶中只有一个显示出微弱的条带，重复测试两次都是阴性。由于直接测序不成功，必须克隆扩增子。病毒学研究的详细信息见方框1.

血压、心律、肾功能和利尿由液体和低剂量去甲肾上腺素调节；伴随而来的肺部感染金黄色葡萄球菌用1克氟氯西林iv治疗，每天4次，持续7天。入住ICU时，体温升至40.1°C，但服用对乙酰氨基酚栓剂(1，000 mg，每天4次，共服用3天)后，24小时后体温正常，此后保持正常，无需进一步测量。尿崩症最初出现在入院的第12天，ICU的第7天，在第13、16和17天加入去氨加压素进行静脉输液控制。当在EEG上看不到爆发时，在5天后停止戊巴比妥，并且在给药7天后停止咪达唑仑。24小时后，即停用戊巴比妥后3天，虽然在血清中没有检测到戊巴比妥，但EEG显示非常低的电压背景模式。

延髓的MRI异常已经增加并且现在延伸到中脑和小脑的两个齿状核(图2).此外，两个半球都有弥漫性肿胀。磁共振血管造影没有发现血管异常。停用氯胺酮后，对疼痛或声音刺激没有反应。脑干反射和深层腱反射缺失。引入清洁气道的导管没有导致咳嗽反应，也没有自主呼吸。根据家属的意愿，决定停止呼吸机支持。她在入院的第20天死亡，也就是蝙蝠事件发生后的第45天。

图2.入院第16天(死亡前4天)核磁共振脑。

在入院后第17天，由于Duvenhage病毒感染而患有狂犬病的患者的轴向T-2加权图像显示延髓后部(箭头)和基底神经节(箭头)的信号增加。

在尸检中，除了肺炎，没有发现明显的异常。大脑肿胀，重1，360克。大脑皮层的组织病理学(图3A和3B)表现出广泛的神经毡空泡化、神经元细胞丧失、星形胶质细胞增生和由巨噬细胞、活化的小胶质细胞和淋巴细胞浸润组成的广泛炎症变化。在海马、中脑、脑桥、延髓和小脑中观察到严重的神经元细胞损失。使用多克隆兔抗狂犬病核蛋白抗体的免疫组织化学显示在额叶和颞叶皮层以及海马和内嗅皮层中的狂犬病病毒抗原(图3C和3D)。在大脑的其他区域，也没有在肾上腺、唾液腺、胰腺、甲状腺、心脏或胃肠道中检测到狂犬病病毒抗原。

图3.杜文哈格病毒所致狂犬病脑炎的组织病理学。

狂犬病脑炎(狂犬病病毒；基因型4)脑病理学:大脑皮层和抗RNP免疫组织化学。(A) (HE染色):额叶皮质:广泛的神经毡空泡化和神经元细胞丧失。(B)少量残留的皮质神经元(箭头)。(C) (HE染色):血管周围淋巴细胞炎性浸润(箭头)。(D和E)额叶皮质内的抗RNP免疫反应性。一些神经元细胞显示出免疫阳性(箭头和[E]中的插图),在神经元细胞质以及树突和轴突中存在多种抗原物质。比例尺:(A，B)100m；(丙、丁)60米；40米；插入(E): 12米。

材料和方法

细胞培养

通过接种鼠成神经细胞瘤细胞和在24孔微量滴定板中增殖的BHK-21细胞进行各种临床样品的细胞培养。CSF不经处理进行测试，唾液用病毒转运介质补足至2 mL体积。其他标本用体积达5 mL的病毒转运培养基研磨。离心后，向每个孔中加入200 L的体积。使用抗狂犬病核衣壳结合物(Bio-Rad)进行的免疫荧光试验显示免疫阳性，如所示图4.

图4.抗狂犬病核衣壳结合物免疫荧光试验。

使用抗狂犬病核衣壳结合物(Bio-Rad)的鼠神经母细胞瘤细胞的免疫荧光。箭头指向绿色免疫荧光阳性的细胞。右图是左图的放大图，带有比例尺。

半巢式PCR和序列分析

如前所述进行狂犬病特异性诊断RT-PCR[9]。简而言之，使用MAgNA Pure LC (Roche Diagnostics，Penzberg，Germany)和总核酸分离试剂盒提取核酸。用来自核蛋白编码区的引物进行巢式RT-PCR，在琼脂糖凝胶上读出。使用Qiagen Quick Gel Extraction Kit(Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的说明从琼脂糖凝胶中分离出阳性条带。从凝胶中提取的RT-PCR扩增子用ABI BigDye终止子3.1版循环测序试剂盒(Applied Biosystems，nieuwerk a/d IJssel，荷兰)在ABI 3100上测序。用Lasergene第7版软件包(DNASTAR，Madison，美国)产生序列，并用nr数据库中的blastnn算法在NCBI数据库中进行blast。

对核蛋白区的367个碱基对片段进行测序，并使用Mega 3.1进行系统发育分析(邻居连接，Kimura 2参数，1000个引导值)[11] (图5).

图5.嵌入狂犬病病例的Lyssa病毒进化树。

当前狂犬病病例的系统发生树(序列箭头所示)和代表性狂犬病病毒基因组。基于核蛋白区中367个碱基对片段的Mega 3.1树(邻居连接，Kimura 2参数，1000个自举值)。指示高于75%的引导百分比。基因型1 =狂犬病毒(RV)；基因型2 =拉格斯蝙蝠病毒(LBV)；基因型3 =莫科拉病毒(MV)；基因型4 =杜文哈格病毒(DV)；基因型5 =欧洲蝙蝠病毒(EBLV) 1a和1b；基因型6 =欧洲蝙蝠病毒2a和2b；基因型7 =澳大利亚蝙蝠病毒(ABLV)。存在基因型4的病毒分离物:DV E2007011420(箭头所示)。

应该注意的是，Duvenhage毒株在我们的实验室中并不存在。

讨论

狂犬病发生在除南极洲以外的所有大陆。致病病毒属于弹状病毒科，属狂犬病病毒 [13]。该属包括狂犬病病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒1和2、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒和杜文哈格病毒。后三种连同狂犬病病毒在非洲发现。已经从蝙蝠中分离出另外四种狂犬病病毒(见[14],[15])。据估计，每年有55，000人死于狂犬病，亚洲有31，000人，非洲有24，000人[16]。在绝大多数情况下，人类感染是由于被受感染的哺乳动物咬伤，大多数是狗。咬伤，尤其是蝙蝠的咬伤，可能不会被注意到[17],[18]。空气传播是可能的，但极其罕见[19]。已经发生了通过角膜、器官和来自未被识别的狂犬病供体的血管段的移植的传播[20],[21]。除了这些移植病例外，没有记录到实验室确认的人与人之间的狂犬病传播[22]。已经提出了两例埃塞俄比亚人与人之间通过唾液接触传播的病例，特别是咬伤和接吻，但两者都缺乏对死亡原因的实验室确认[23].

狂犬病的诊断取决于各种标本(血清、唾液、脑脊液、颈部毛囊皮肤活检、角膜印模涂片和脑活检)中病毒或病毒抗体的证明。有几种方法可用:RT-PCR、免疫荧光试验、病毒中和试验和细胞培养或动物中的病毒分离。在疾病的早期阶段，结果可能是阴性，可能需要进行多次测试。一旦出现神经症状，死亡(几乎)是普遍不可避免的。只有一名没有接受暴露前或暴露后预防的患者存活了下来[1]。这名15岁的患者被诊断患有脑炎。她没有接受狂犬病免疫球蛋白或狂犬病疫苗。症状开始后第6天的血清和CSF含有狂犬病毒的抗体，但是没有分离出病毒，没有检测到病毒抗原，并且扩增病毒核酸的尝试没有成功。她接受了苯二氮卓类和巴比妥类药物、氯胺酮(一种在动物模型中显示出抗狂犬病特异活性的物质)诱导昏迷的治疗[24]以及抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺。接触蝙蝠27个月后，她出现了构音障碍和步态困难的后遗症，但她已经高中毕业[2]。有人认为，由减毒变异蝙蝠狂犬病病毒感染或血清和CSF中狂犬病抗体的早期存在可能有助于成功[1],[25],[26].

我们采用了与Willoughby等人报道的相同的方法，即使用苯二氮卓类和苯巴比妥诱导昏迷，并持续监测脑电图上的爆发，同时使用氯胺酮、利巴韦林和金刚烷胺。[1]。不像幸存的病人[1]，我们的患者在入院时根据NCCID的建议接受了狂犬病疫苗和HRIG，因为在入院时狂犬病的诊断并不明显，尽管有可能，但必须考虑鉴别诊断。有人建议，但没有明确证明，一旦狂犬病的临床表现出现，接种疫苗和免疫球蛋白可能是有害的[26]。在接受昏迷诱导、氯胺酮和抗病毒药物治疗且未存活的11名狂犬病患者中[3]其中三人没有接种疫苗或免疫球蛋白[4],[5]其中两人同时接种了疫苗和HRIG[6],[7]，只有一个HRIG，没有疫苗[8]；王尔德等人提到的五种。[3]找不到任何详细信息。2003年，专家建议考虑使用狂犬病疫苗、免疫球蛋白、利巴韦林、干扰素α和氯胺酮，最好是联合使用[27]，在后来的出版物中没有被反驳的建议[25],[28]。最近，一名巴西狂犬病幸存者在ProMED-mail([29]；请参见[30]用于问答)。这个病人在几个方面不同于我们和其他非存活病人。这个15岁的男孩被蝙蝠袭击了。他在出现症状前接受了四剂不含免疫球蛋白的狂犬病疫苗。第一剂是在蝙蝠咬伤后4天注射的。中和抗体出现在血清和脑脊液中，可能是在疾病早期，但确切的时间没有给出。脑脊液中未检测到病毒RNA。他接受了咪达唑仑、氯胺酮和金刚烷胺的治疗并存活了下来。如上所述，该患者与非存活患者不同，因为早期注射疫苗和存在抗体。正在等待详细情况和后续结果。

狂犬病实际上仍然是一种致命的疾病。对于早期脑脊液中有中和抗体的症状性狂犬病患者，尝试包括呼吸和心血管支持在内的强化治疗可能是成功的。否则，由于没有来自体外和动物研究的新数据，也没有专家关于联合治疗的建议，目前可能提供的是最好的医疗和护理，减轻症状，对患者进行舒适护理，并得到家庭的支持[3]。迫切需要在动物模型中进行治疗研究。

这是第三例由杜文哈格病毒感染引起的人类狂犬病病例。这种病毒于1970年首次从南非的一名病人身上分离出来[31]。Paweska等人在2006年报道了第二例南非患者，并参考了从南非和津巴布韦的蝙蝠中分离病毒的文献[32]。目前还不知道它出现在肯尼亚，那里的狂犬病已知发生在狗和各种动物身上[33]–[35]，但直到最近才在蝙蝠中出现。2006年和2007年在肯尼亚进行的首次蝙蝠对狂犬病病毒的调查结果于2008年公布；拉各斯蝙蝠狂犬病病毒被发现[36]。我们的病人被感染的地区的营地看守和卫生人员并不知道蝙蝠狂犬病的风险。

这一悲剧事件再次提醒人们，即使是轻微的动物相关伤害，也应该彻底清洗伤口，并进行暴露后预防。如果接触后预防措施有限，建议旅行者进行接触前预防接种，特别是在带孩子旅行较长时间的情况下。人二倍体细胞疫苗可预防典型的狂犬病病毒株和Duvenhage病毒，但不能预防Mokola病毒和拉各斯蝙蝠病毒；Duvenhage病毒被RIG中和，但Mokola和Lagos bat病毒不能[37],[38].

感谢

我们感谢国家传染病协调中心的快速建议和反应。感谢Mary J. Warrell、David A. Warrell、David R. Shlim、Tom Solomon、Rodney E. Willoughby和Louis Nel的建议和支持。