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1 摘要

This entry is part 118 of 118 in the series 狂犬病疫苗

摘要

背景

狂犬病是一种致命但可以通过疫苗预防的疾病。推荐用于估计抗狂犬病疫苗免疫反应的常规“金标准”是快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。在这里，我们描述了一种基于假病毒的中和试验（PVNT）作为检测中和抗体反应的替代方法。

方法/主要发现

我们在转染狂犬病 G 糖蛋白的 HEK293 细胞中使用基于重组水泡性口炎病毒（rVSV）的假型系统来生产高滴度假病毒。这些是通过用抗 G 单克隆抗体和参考血清中和以及基于免疫荧光的假病毒感染检测来证实的。包括分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因，以使测定具有高通量适应性，可以使用常规 ELISA 读数仪进行读数。开发了一种动态范围为 OD 的 PVNT₄₀₅从 0.10 到 2.00，用于测试一组经 RFFIT 验证的 71 份人血清样品。PVNT 和 RFFIT 结果显示与 Pearson 相关值 0.8555 显著一致。在具有临界线 RFFIT 正值的样品中（RFFIT 滴度在 0.5-1.8 IU/mL 范围内），一致性较低，PVNT 结果趋于阴性。与 RFFIT 相比，PVNT 测定的特异性为 100%。该测定还具有 100% 的阳性预测值，表明其可用于评估针对近 100% 致命疾病（如狂犬病）的中和抗体的存在。

结论/意义

我们的结果表明，PVNT 是一种可重复、敏感和特异性的测定方法，具有客观和可记录的读数。该检测速度更快，周转时间不到 24 小时，并且可以自动进行大规模筛选。重要的是，它可以在处理活狂犬病病毒时不受限制地进行。PVNT 为监测疫苗功效和免疫状态提供了 RFFIT 的可靠替代方案，使其成为狂犬病控制计划的宝贵工具。

作者总结

狂犬病每年导致全球约 59000 人死亡。它也是根据联合国 2030 年可持续发展目标（SDG）实现“零 by 30”的被忽视的热带病之一。狂犬病是一种可通过暴露前和暴露后接种疫苗来预防的疾病。成功接种疫苗的关键要求之一是诱导针对糖蛋白 G 的强大中和抗体反应，糖蛋白 G 是促进病毒感染的关键病毒蛋白。针对该蛋白质的抗体水平被认为是预防狂犬病的替代标志物。世界卫生组织（WHO）建议中和抗体的最低血清水平为 0.5 IU/mL，以认为一个人在接种疫苗后具有足够的血清转换。在动物驯养员、森林官员、宠物主人和兽医等高危人群中，确保预防性疫苗接种后抗狂犬病抗体的保护水平至关重要。此外，作为高风险社区狂犬病控制计划的一部分，在人群水平上筛查保护性抗体反应可能是必不可少的。然而，由于多种原因，WHO 目前推荐的金标准检测（例如 RFFIT）执行起来很麻烦。本研究试图解决这些问题，并报告了一种可以克服这些困难的新型检测方法。这项工作旨在扩大公共卫生对抗犬病抗体检测的可及性，以确保狂犬病免疫接种的有效性，从而促进全球狂犬病的控制和消除。

介绍

狂犬病病毒是弹状病毒科的一种负链RNA病毒，是一种典型的人畜共患病毒，也是一种单一健康的病原体[1,2]。狂犬病病毒在世界许多地方继续构成重大威胁，特别是在亚洲和非洲[3,4]，而此时新出现的病毒已成为全球公共卫生的重大关注。狂犬病的致死率接近100%，主要通过动物咬伤传播。在高危暴露中，迅速开始暴露后预防，包括伤口处理、狂犬病疫苗接种和免疫球蛋白给药，对于预防疾病发展和死亡极为重要[4,5]。

狂犬病病毒有一个 12 kb 的单链 RNA 基因组，编码五种蛋白质，即核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和一种 RNA 定向的 RNA 聚合酶（L），其中蛋白 G 是与细胞受体结合并介导病毒进入的主要表面糖蛋白 [6]。它引发中和抗体反应，在暴露前和暴露后免疫中提供保护 [7]。足够水平的预先存在的抗 G 中和抗体可以防止病毒进入神经元和中枢神经系统。WHO 建议接种疫苗的人和动物血清中的抗 G 中和抗体水平为 0.5 IU/mL，作为接种疫苗后充分血清转换的证据 [4,5]。确保人类和动物接种疫苗后病毒中和抗体的保护水平对于实现狂犬病控制作为一项公共卫生措施非常重要。

采用多种方法来估计抗狂犬病疫苗接种后的抗 G 抗体水平 [8]。用于此目的的早期检测之一是 1935 年开发的小鼠中和试验（MNT） [9]。随后开发了其他动物模型来评估新的狂犬病候选疫苗的疗效 [10,11]。RFFIT（快速荧光病灶抑制试验）和 FAVN（荧光抗体病毒中和）试验被认为是“金标准”，用于检查抗狂犬病免疫球蛋白的中和效力和狂犬病疫苗的免疫原性 [12,13]。酶联免疫吸附测定（ELISA）在一些实验室中被用作筛查试验，作为 RFFIT 的替代品 [14,15]。虽然灭活狂犬病病毒或重组抗原可以用作 ELISA 中的包被抗原，并且该检测有助于识别结合抗体的存在，但它不能用于评估中和抗体反应的水平 [16]。为了克服传统基于 ELISA 的系统的这一限制，已经提出了竞争性和阻断性 ELISA，然而，它们尚未用于真实世界样本的大规模分析 [8]。

假病毒在 BSL-2 设施中成功用于研究高致病性病毒，如埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒和中东呼吸综合征（MERS）病毒 [17–20]。在这些系统中，假病毒粒子核心属于异源 RNA 病毒，如人类免疫缺陷病毒（HIV）或水泡性口炎病毒（VSV），而包膜蛋白属于目标病毒，它介导靶细胞中的感染过程。尽管已经产生基于 HIV 的狂犬病病毒假病毒粒子并用于中和试验，但系统中产生的低病毒滴度是一个限制 [21]。后来，针对狂犬病开发了高滴度、基于慢病毒的假病毒病毒体系统;然而，该系统缺乏高通量适应性，阻碍了其广泛应用[22]。基于重组VSV（rVSV）的假病毒系统被设计为去除编码病毒表面糖蛋白G基因（ΔG）。一旦在表达异源病毒表面糖蛋白的细胞中转导，它就可以掺入这种蛋白质并产生感染性假病毒。随后，在用于感染测定的靶细胞中，这些假病毒可以进行一轮感染和编码基因的表达，但不能产生任何感染性后代病毒粒子，因为没有病毒表面糖蛋白被表达。这提高了这种系统的安全水平[23]。

在本研究中，我们使用该系统开发了一种高通量适应性中和测定法，用于估计狂犬病病毒抗 G 糖蛋白抗体。我们研究中使用的 rVSV 在基因上编码在感染靶细胞中表达的绿色荧光蛋白（GFP）或分泌型碱性磷酸酶（SEAP）;反过来，这反过来又支持感染水平的定性和定量估计。我们进一步评估了 RFFIT 阳性和阴性人血清样品中和产生的狂犬病假病毒粒子的感染性的能力。

材料和方法

道德声明

人类血清样本最初由班加罗尔国家心理健康和神经科学研究所（NIMHANS）神经病毒学部门根据已发布的方案 [26] 与从英国国家生物标准和控制研究所（NIBSC）获得的 WHO 参考血清（30IU/mL）进行抗狂犬病抗体水平测试。RFFIT 后储存的剩余样本用于验证 R-PV-SEAP 假病毒粒子中和试验（PVNT）;并且是完全匿名的。因此，没有获得使用样本进行研究的个人同意。该研究获得了班加罗尔 NIMHANS 和特里凡得琅高级病毒学研究所（IAV）机构人类伦理委员会的批准（批准号。IHEC/IAV/2023/05）用于该研究。

样品包括从接受狂犬病疫苗接种的人类受试者获得的血清（n = 61）和从过去任何时间未接种狂犬病疫苗接种的人类受试者获得的阴性血清样品（n = 10）。血清样品在 56 °C 下热灭活 30 分钟，并在 -20 °C 下储存。

用于假病毒生成的试剂和质粒

编码 GFP 和 SEAP 报告基因（分别为 G*VSV -∆G-GFP 和 G*VSV-∆G-SEAP）用于产生假型狂犬病病毒的重组 VSV 假病毒（rVSV）购自马萨诸塞州波士顿的 Kerafast Inc.。编码全长狂犬病 G 糖蛋白（pHMC122）的质粒是美国拉霍亚免疫学研究所的 Erica Ollman Saphire 博士的一份礼物。

细胞系和抗体

最初从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的细胞系 HEK293 （ATCC， CRL1573）、HEK293T （ATCC， CRL3216）和 Vero 细胞（ATCC， CCL81）在 37 °C 下在 5% CO 下在 10% Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中繁殖₂。培养基补充有 10% FBS（#A525671;Invitrogen）和 1X 抗生素混合物（#A5955;Sigma-Aldrich）。抗狂犬病人单克隆抗体 17C7（Rabishield-100;40IU/ml）购自印度血清研究所 Pvt Ltd;用作阴性对照抗体的黄病毒组特异性抗原（4G2）抗体购自美国 MyBiosource（货号 MBS488169）。WHO 参比血清购自英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）。

HEK293 细胞瞬时转染和狂犬病 G 蛋白免疫染色

用表达全长狂犬病 G 蛋白的 pHMC122 质粒瞬时转染 HEK293 细胞。当细胞在 8 孔室盖玻片（#155411;Nunc Lab-tek 的 Nik 实验室）。将 1 μg 质粒和 PEI（2.5 μg/μl;#408727 Sigma-Aldrich）以 1：3 的比例混合在 Opti-MEM 中，然后在室温下孵育 30 分钟，并在 37 °C 下在 5% CO 下与 HEK293 细胞一起孵育₂.孵育 6 小时后，使用 10% DMEM 更换培养基，将细胞再孵育 12 小时，并使用冰冷的甲醇-丙酮（1：1）在 4 °C 下固定 10 分钟。使用 PBST 中的 3% BSA 封闭细胞 1 小时，然后根据制造商的说明，使用 Alexafluor 488 微量蛋白标记试剂盒（#A30006）与偶联的狂犬病 G 单克隆抗体（17C7）（1：2000）与 Alexa 488 孵育过夜。在室温下用 DAPI（1μg/ml;#9542 Sigma-Aldrich）对细胞染色 10 分钟，并在配备 40 倍物镜（3 倍变焦）的 Leica Stellaris 5 共聚焦显微镜下成像。

狂犬病假病毒 R-PV-GFP 和 R-PV-SEAP 的产生

如上所述，狂犬病假病毒由瞬时转染 pHMC122 质粒的 HEK293 细胞产生。转染后 18 小时，去除培养基，用（G*ΔG-GFP）或（G*ΔG-SEAP） rVSV 假病毒感染细胞，MOI 为 3–5，持续 2 小时。用含有 10% FBS 的 DMEM 替换培养基。第二天，收获分别含有狂犬病假病毒粒子 R-PV-GFP 和 R-PV-SEAP 的上清液，以 3000 rpm 澄清 10 分钟，并使用注射器过滤器（0.45 μm 孔径）过滤，并在 -80 °C 下分装储存直至使用。

为了确定适合中和测定的靶细胞，使用 R-PV-GFP 病毒原液感染 HEK293T 和 Vero 细胞，并在感染 12 小时后记录 GFP 荧光。

R-PV-SEAP 假病毒储备液的滴定

在用于中和测定之前，50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定产生的每批 R-PV-SEAP 假病毒粒子。为避免重复冻融可能导致的不一致，病毒样品以一次性等分试样的形式储存。TCID 的₅₀使用 Reed-Muench 方法计算 [24]。在含有 DMEM 的 2% FBS 中制备原液病毒的连续两倍稀释液，并用于感染 96 孔培养板中的 HEK293T 细胞，每次稀释一式八份孔。假病毒粒子孵育 2 小时后更换培养基，并将感染细胞在 37 °C 下孵育过夜。第二天，收获上清液，在 65 °C 下热灭活，并通过将 30 μl 上清液与 100 μl pNPP 底物（Sigma，货号：P7998）混合来分析 SEAP 活性。10 分钟后使用 50μl 3N NaOH 溶液终止反应，并使用 Promega GloMax Discover 酶标仪测量 405 nm 处的吸光度。正如之前定义阳性临界值的研究 [25] 中所述，OD₄₀₅值大于 OD 的 3SD（标准差）₄₀₅细胞对照的值被认为对假病毒感染呈阳性;并用于计算 TCID₅₀.

靶细胞感染后 R-PV-SEAP 假病毒粒子的免疫染色

接种在盖玻片上的 HEK 293 T 细胞感染狂犬病 G*（∆G- SEAP） rVSV 或 VSV G*（∆G- SEAP） rVSV 假病毒体（2500 TCID₅₀）在室温下放置 30 分钟，然后在丙酮-甲醇中固定 5 分钟。将细胞在 PBST 中的 5% BSA 中封闭 1 小时，然后在 4 °C 下与一抗（17C7-1：1000）一起摇动孵育过夜。此外，将细胞与抗人 Alexa Fluor 488 二抗孵育 1 小时。使用 DAPI 作为细胞核染色剂。在室温下用 DAPI （1μg/ml）对细胞染色 10 分钟，并在 Leica stellaris5 共聚焦显微镜下成像。

基于 R-PV-GFP 和 R-PV-SEAP 假病毒粒子的 PVNT

对于 PVNT 测定，测试人血清样品，阳性对照单克隆抗体 17C7 （2IU/mL）（根据 WHO 参比血清滴定）和阴性对照抗体 4G2 分别在含有 DMEM 的 2% FBS 中稀释两倍。将 R-PV-GFP 或 R-PV-SEAP 假病毒粒子与连续稀释的抗体或血清在 37 °C 下孵育 1 小时。使用含有转导的生产者 HEK293 细胞培养上清液的 R-PV-GFP 假病毒粒子进行未稀释的中和测定。使用 R-PV-SEAP 假病毒粒子，浓度为 100TCID_50.HEK293T 个靶细胞（2 × 10 个⁴细胞/孔）接种在 96 孔板中;孵育 24 小时后，除去培养基，用假病毒体-抗体混合物感染单层细胞 2 小时。使用 10% DMEM 更换培养基，并将细胞孵育过夜。对于 R-PV-GFP 感染的细胞，使用配备 AXIOCAM 305 彩色相机的 Zeiss AXIO Vert.A1 倒置荧光显微镜使用 FITC 激发发射滤光片设置捕获 10 倍放大图像。

收获含有来自 R-PV-SEAP 感染细胞的分泌碱性磷酸酶（SEAP）酶的上清液，通过在 65 °C 下加热 10 分钟灭活内源性磷酸酶活性，并如上所述测量 SEAP 活性。使用以下公式计算中和百分比：

为了确定用于计算 PVNT 滴度的 50% 终点稀释度，将 71 份测试血清样品和 WHO 参考血清从 1：64–1：8192 稀释 2 倍，如下进行 RFFIT 滴度评估 [26] 并进行 PVNT;确定 50% 终点 Reed-Muench 法 [24]。每个血清样品的 PVNT 滴度使用以下公式分配：

PVNT 测定的灵敏度、特异性、相关性分析和受试者作员特征（ROC）分析

比较人血清样本的 PVNT 和 RFFIT 检测结果，以计算真阳性（TP）、真阴性（TN）、假阳性（FP）和假阴性（FN）的数量。此外，计算 PVNT 测定的特异性 [即 TN/（FP+TN）]、敏感性 [即 TP/（TP+FN）]、阳性预测值（PPV） [即 TP/（TP+FP）] 和阴性预测值（NPV） [即 TN/（TN+FN）]。

统计分析

PVNT 和 RFFIT 滴度的 Pearson 相关性分析;以及使用 GraphPad Prism 版本 6 绘制测定的接收者作员特征（ROC）作为灵敏度与（1-特异性）的关系。

结果

假病毒粒子 R-PV-GFP 的产生和感染性评估

表达狂犬病的 GFP 假病毒粒子（R-PV-GFP）按照图 1A 所示的方案生成。生产者包装细胞系 HEK293 的膜上狂犬病 G 蛋白的高水平表达是 rVSV 高效假分型所必需的。通过使用与 Alexa Fluor 488 偶联的抗狂犬病 G 17C7 抗体进行免疫染色来证实这一点。如图 1B 所示，在共聚焦显微镜下，转染后 12 小时，在 pHMC122 质粒转染的细胞上清晰可见 G 蛋白的高水平膜表达。

图1重组绿色荧光蛋白的产生及其感染性鉴定。

A.显示使用rVSV(G *δG-GFP)和全长狂犬病病毒G蛋白表达质粒pHMC122(使用Biorender产生；https://www.biorender.com/). B.用于产生假病毒体的HEK293生产细胞中狂犬病病毒G蛋白表达的免疫荧光分析。用全长G蛋白表达质粒转染的细胞用与Alexafluor 488偶联的17C7单克隆抗体免疫染色，转染后24小时。细胞核用DAPI反染，细胞在配有40倍物镜(3倍变焦)的徕卡Stellaris 5共聚焦显微镜下成像。C.含有从HEK293生产细胞产生的假病毒体的上清液(100 μl)用狂犬病G编码质粒(pHMC122) (2 × 10⁴FFU R-PV-GFP假病毒颗粒)或模拟质粒(pCDNA3.1)用于感染靶细胞。生长在96孔板中的单层Vero和HEK293T细胞被用作靶细胞，以发现在MOI为1时对R-PV-GFP感染的容许性。细胞在感染后24小时成像。

通过观察感染 HEK293T 和 Vero 细胞作为靶细胞时的 GFP 信号来测试 R-PV-GFP 的感染性。这些细胞用从 pHMC122 或空载质粒转染的 HEK293 生产细胞的 rVSV 转导 12 小时后收集的澄清上清液感染。如图 1C 所示，来自 pHMC122 转染细胞的上清液含有 R-PV-GFP 的感染性假病毒粒子，由靶细胞中显着大量的荧光病灶指示。正如预期的那样，用来自空载质粒转染细胞的上清液感染的细胞中存在非常少量的荧光点。这些表明在用于初始转导的 G*ΔG-GFP rVSV 中存在表达 VSVG 的病毒。用 R-PV-GFP 感染靶细胞在感染后 4-6 小时内产生可检测的细胞质荧光。感染后 12-18 小时，成像完成后，荧光强度变得非常明亮。据观察，Vero 和 HEK293T 细胞都允许 R-PV-GFP 感染;然而，HEK293T细胞显示出更好的假病毒粒子感染，并使用这些细胞进行了进一步的实验。

R-PV-GFP 对特异性抗体中和的敏感性

使用抗狂犬病 G 单克隆抗体 17C7 以及来自接种疫苗个体的免疫血清评估特异性抗体中和 R-PV-GFP 的能力。如图 2 和图 3 所示，来自接种疫苗个体的 17C7 抗体和免疫血清以浓度依赖性方式中和 R-PV-GFP，在较低稀释度下完全中和。阴性对照抗体 4G2 以及来自未接种狂犬病疫苗的个体的血清无法中和 R-PV-GFP，表明具有特异性。

图2 R-PV-GFP对抗狂犬病G单克隆抗体中和作用的敏感性。

表明抗狂犬病单克隆抗体17C7的2倍稀释液与R-PV-GFP假病毒体(2 × 10⁴FFU)在37℃下放置1小时；并用于感染HEK293T靶细胞。对照抗体(4G2)的类似稀释液用作阴性对照。感染后12小时，使用装有FITC激发-发射滤光器组的蔡司倒置荧光显微镜对活细胞成像。

图4 R-PV-SEAP的产生和评价。

A.显示使用G *δG-SEAP rVSV和全长狂犬病病毒G蛋白表达质粒pHMC122(使用Biorender产生；https://www.biorender.com/). B.HEK 293T细胞上SEAP病毒感染的免疫荧光分析。该图显示了2500 TCID对靶细胞的感染₅₀狂犬病G *(G-SEAP)rVSV假病毒颗粒(上图)和VSV G *(G-SEAP)rVSV假病毒颗粒(下图)。用17C7单克隆抗体(第一抗体)固定感染的细胞，然后用抗人Alexa fluor 488第二抗体进行免疫荧光。用DAPI将细胞表面和细胞内的假病毒染成绿色，将细胞核染成蓝色。比例尺，20 μMC.感染后24小时，用渐增浓度的R-PV-SEAP假病毒颗粒感染HEK293T靶细胞，培养上清液中的SEAP活性。每个值是来自两个独立实验(N = 2)的吸光度的平均SD。D.抗狂犬病病毒G单克隆抗体(17C7)和阴性对照抗体(4G2)在1∶64稀释度下对不同浓度的R-PV-SEAP假病毒体的中和效率。抗体与R-PV-SEAP假病毒体在37℃预孵育1小时；并用于感染HEK293T靶细胞。在感染后24小时收集细胞培养上清液并进行SEAP分析。每个值是来自两个独立实验(N = 2)的吸光度的平均SD。

R-PV-SEAP 的生成和评估

表达 SEAP 的狂犬病假病毒粒子（R-PV-SEAP）按照图 4A 所示的方案生成。18 小时后收集来自生产者 HEK293 细胞的培养上清液，转染 pHMC122 并转导 G*ΔG-SEAP rVSV。它进行了 TCID₅₀评估，如方法部分所述。产生的 R-PV-SEAP 病毒原种具有 TCID₅₀范围从 5.1 到 6.3 × 10⁴TCID ₅₀/ML。

图4 R-PV-SEAP的产生和评价。

A.显示使用G *δG-SEAP rVSV和全长狂犬病病毒G蛋白表达质粒pHMC122(使用Biorender产生；https://www.biorender.com/). B.HEK 293T细胞上SEAP病毒感染的免疫荧光分析。该图显示了2500 TCID50对靶细胞的感染狂犬病G *(G-SEAP)rVSV假病毒颗粒(上图)和VSV G *(G-SEAP)rVSV假病毒颗粒(下图)。用17C7单克隆抗体(第一抗体)固定感染的细胞，然后用抗人Alexa fluor 488第二抗体进行免疫荧光。用DAPI将细胞表面和细胞内的假病毒染成绿色，将细胞核染成蓝色。比例尺，20 μM C.感染后24小时，用渐增浓度的R-PV-SEAP假病毒颗粒感染HEK293T靶细胞，培养上清液中的SEAP活性。每个值是来自两个独立实验(N = 2)的吸光度的平均SD。D.抗狂犬病病毒G单克隆抗体(17C7)和阴性对照抗体(4G2)在1∶64稀释度下对不同浓度的R-PV-SEAP假病毒体的中和效率。抗体与R-PV-SEAP假病毒体在37℃预孵育1小时；并用于感染HEK293T靶细胞。在感染后24小时收集细胞培养上清液并进行SEAP分析。每个值是来自两个独立实验(N = 2)的吸光度的平均SD。

中和抗体检测狂犬病糖蛋白 G 在病毒包膜上的功能构象。使用免疫染色评估狂犬病 G 蛋白三聚体在 rVSV 上的掺入情况。使用中和抗体 17C7 和抗人 Alexa Fluor 488 抗体作为二抗检测与HEK293T细胞结合的 R-PV-SEAP 假病毒体。感染 30 分钟后染色的细胞显示出与细胞膜共定位的明显荧光斑点。这证实了 R-PV-SEAP 假病毒粒子表面存在狂犬病糖蛋白三聚体（图 4B）。

使用不同浓度的 R-PV-SEAP 感染HEK293T靶细胞，并测定上清液中的 SEAP 活性。如图 4C 所示，SEAP 活性呈剂量依赖性增加，表明受到 R-PV-SEAP 假病毒粒子感染。此外，通过将病毒浓度从 25 到 2000 TCID 改变来确定用于抗体中和测定的 R-PV-SEAP 假病毒粒子的最佳浓度₅₀/well 并使用阳性对照抗体（17C7;2IU/ml）和阴性对照抗体（4G2）的固定稀释度（1：64）。如图 4D 所示，在所有浓度的 R-PV-SEAP 中，特异性抗体完全中和，如碱性磷酸酶活性的显着降低所示。而在阴性对照抗体处理的病毒中，SEAP 活性保留，表明没有中和作用。此外，OD 值与所用病毒的浓度成正比增加，表明对感染的剂量反应。据观察，使用 100 个 TCID₅₀R-PV-SEAP 导致中等 SEAP 活性下降到吸光度的中位范围内;超过此范围增加病毒浓度会导致值饱和。因此，我们决定使用该浓度作为后续血清中和测定的病毒最佳剂量。

R-PV-SEAP 对参比抗体和具有不同 RFFIT 滴度的人血清样品的中和反应的敏感性

与 R-PV-GFP 一样，R-PV-SEAP 假病毒粒子也可通过不同稀释度的参比抗体 17C7 有效中和。我们观察到基于 SEAP 的中和测定在 OD₄₀₅使用 100TCID 时为 0.10 至 2.00₅₀R-PV-SEAP 假病毒粒子;以及 OD 以下的任何值₄₀₅0.20 表示 95% 的中和。如图 5A 和 5B 所示，较低稀释度的 17C7 和 WHO 参比血清样品显示完全中和，OD 值接近细胞对照（OD-0.10）。稀释度的增加也反映了 SEAP 活性的增加，与感染靶细胞的未中和假病毒粒子成正比。

图5 参考抗体和不同滴度人血清样品对R-PV-SEAP的中和效率。

A.100TCID₅₀通过改变17C7抗狂犬病G单克隆抗体和非中和阴性对照抗体(4G2)的稀释度，在37℃下孵育1小时，对10个R-PV-SEAP假病毒体进行中和；然后感染HEK293T靶细胞。在感染后12小时，对培养物上清液进行SEAP分析，并计算针对假病毒感染对照的中和百分比。每个值代表来自三个独立实验的吸光度的平均SD。B.代表性的比色反应板。100TCID₅₀通过在37℃与不同稀释度的世卫组织参照血清(2IU/mL)一起温育1小时，对R-PV-SEAP假病毒体进行中和；并随后用于感染靶HEK293T细胞。培养基对照和用未中和的假病毒感染的细胞作为对照。显示了12小时后培养上清液中SEAP活性的可视化。C.来自狂犬病疫苗接种个体的人血清样品的中和效率，所述个体具有不同水平的抗100 TCID50的狂犬病荧光焦点抑制试验(RFFIT)阳性SEAP假病毒粒子。每个数据点代表两个独立实验中吸光度的平均值±标准差。

在将检测应用于更大的样品组之前，我们评估了 R-PV-SEAP PVNT 的性能，其中 10 个人类血清样品的 RFFIT 值任意设置为高（>7.5 IU/ml;3 个编号）、低（3.75 IU/ml;2 个编号）、边界（1.8-0.5 IU/ml;2 个编号）和阴性范围（< 0.5 IU/ml;3 个）。如图 5C 所示，PVNT 测定清楚地区分了具有阳性中和的高低 RFFIT 值的阳性样品，而具有临界 RFFIT 值的样品在设定 100% 的临界值时显示可变的中和。RFFIT 阴性样品在 R-PV-SEAP PVNT 测定中也是非中和的。

在更大的人血清样品组中，假病毒中和滴度（PVNT）与 RFFIT 滴度的一致性

对于 RFFIT 分析，在一组以 1：64 稀释的 71 个人类样品中进行 PVNT 分析，并在两个较低的临界值（50% 和 75%）下比较结果。如表 1 和 S1 以及图 6A 和 6B 所示，对于具有高中和抗体滴度的样品，显示阳性中和的样品数量相同，如较高的 RFFIT 值所示。然而，对于具有临界 RFFIT 中和值的样品（由图 6A 和 6B 中的矩形框表示），存在差异。虽然少数样品在 PVNT 中显示出完全中和，但有许多样品显示出较低的中和水平。50% 和 75% 的临界值仅影响这些样本的 PVNT 阳性。

表1 以1:64血清稀释度比较人血清样本的PVNT和RFFIT结果。

图6 假病毒中和滴度(PVNT)与RFFIT滴度的一致性。

针对100 TCID50评估了来自71名具有已知RFFIT滴度的狂犬病疫苗接受者的人血清样品的中和效率R-PV-SEAP并绘制成图。A.在50%中和效率临界值显示阳性的样本数。边界线阳性样本用矩形框表示。B.在75%中和效率临界值显示阳性的样本数。从重复读数中计算出的平均值表示为数据点。C.71份人血清样本的假病毒中和滴度(PVNT)与RFFIT滴度的相关性。相对于世卫组织参考血清中和值，将PVNT值转换为国际单位并作图。一些数据点代表具有相同中和滴度的多个样品。D.PVNT检测的受试者操作者特征(ROC)。在不同的阳性临界值下，使用71个样本的PVNT分析的灵敏度和特异性值被计算并绘图(表2).一些数据点代表具有相同值的多个样本。

表2 RFFIT验证的人血清样品(n = 71)在不同中和临界值下的PVNT分析性能。

doi:https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013010.t002

根据 WHO 参考血清样品计算的 RFFIT 和 PVNT 中和滴度用于 Pearson 相关性分析。该分析的相关性为 0.855，如图 6C 所示。该检测在各种经 RFFIT 验证的样品中显示出一致的特性，例如特异性和敏感性（表 1 和 2）。接受者作员特征（ROC）分析（图 6D 和表 2）表明，该测定在任何中和临界设置下均具有 100% 的特异性，但灵敏度水平不同。如表 2 所示，灵敏度从 0.89 到 0.98 不等，中和临界值从 90% 降低到 50%。该测定的阴性预测值较低（0.59 至 0.91），并且在较低的临界值下增加。然而，在任何高于 50% 的临界值下，它具有 100% 的阳性预测值，可用于该 PVNT 对未知样本的评估。

讨论

正如联合国可持续发展目标所设想的那样，WHO 努力到 2030 年在全球范围内实现犬介导的狂犬病零死亡 [27,28]。它的战略重点是对狗进行大规模疫苗接种、更好的伤口管理和改善获得有效暴露后预防的机会。这反过来又为提高疫苗在人类和动物中的覆盖率创造了动力;以及需要确保疫苗接受者的保护性血清转化。

病毒中和试验（如 RFFIT 和 FAVN）对于测量人类和动物体内针对狂犬病病毒的中和抗体至关重要。它们广泛用于评估新疫苗和疫苗接种计划，确认免疫功能低下个体在接种疫苗后是否有足够的血清转化，并确定狂犬病暴露高风险个体的加强要求。在人类病例中，这些检测还支持临床疑似狂犬病的实验室确认。对于动物，建议它们符合国际移动和贸易法规，验证接种疫苗的宠物和牲畜的免疫力，支持野生动物狂犬病控制计划，并促进跨物种疫苗功效的研究 [4]。

在本研究中，我们旨在生成一种避免使用活狂犬病病毒的替代检测方法，而活狂犬病病毒是广泛使用基于 RFFIT 的中和检测的主要限制因素。假病毒在许多方面都优于活病毒，包括安全性和生物防护性。由于它们的传染性有限且缺乏毒性病毒成分，它们在实验室环境中使用要安全得多 [17\u201219]。尽管以前报道了使用基于慢病毒的假病毒的替代检测[21,22]，但产生的假病毒的低滴度和难以将其应用于大规模筛选是主要障碍。在我们的研究中，我们克服了使用基于 rVSV 的系统 [23] 的第一个问题，该系统只需要在 HEK293 生产细胞中转染表达狂犬病糖蛋白 G 的单个质粒。传统的假病毒粒子生成技术涉及使用多个质粒和转染，以实现假病毒粒子组装所需的所有组分。由于在转染过程中将这些多个质粒掺入同一细胞中仍然是一种罕见的事件，因此病毒组装过程效率非常低，并且导致病毒滴度较低且不一致。我们通过使用 rVSV 将高通量适应性整合到系统中，该 rVSV 在感染靶细胞时表达可量化报告基因（SEAP），这可以在 96 孔形式的常规 ELISA 读数仪中测量。

我们使用编码基于 GFP 的报告基因的 rVSV 的初步分析表明，会产生高滴度狂犬病假病毒（具有荧光灶单位，FFU 为 1.2-2.0 × 10⁵/ml），该病毒易于被特异性抗体中和（图 1-3）。随后，使用带有 SEAP 报告基因的 rVSV （R-PV-SEAP），我们可以在不同批次中重现高滴度假病毒的生产，病毒滴度范围为 5.1 至 6.3 × 10⁴TCID50 /ml，从而获得一致的 SEAP 吸光度值。通过选择产生稳定表达狂犬病 G 蛋白的 HEK293 生产细胞，这将在产生 R-PV-SEAP 时消除反复转染的需要，从而进一步增强这一点。在我们的实验中，我们还可以通过在共聚焦显微镜中可视化免疫染色的病毒颗粒来证明产生的假病毒与 HEK293T 靶细胞的细胞膜上的有效结合（图 4B）。

我们观察到 100 个 TCID₅₀是 PVNT 测定的最佳滴度（图 4D），尽管 R-PV-SEAP 可以在更高的滴度下产生。在使用参比抗体和人血清样品的中和测定中，结果是可重复的，对不同抗体稀释度的剂量反应一致（图 5A 和 5B）。使用具有不同 RFFIT 滴度的血清样品子集的 PVNT 测定可以清楚地区分阳性和阴性样品，但在临界样品中结果不同（图 5C）。总体而言，PVNT 测定在初始分析中显示出有希望的结果。

我们进一步扩展了研究，使用了 61 个 RFFIT 阳性人血清样本和 10 个阴性样本，这些样本进行了 PVNT 分析（图 6A 和 6B）。我们可以使用样本子集重现在试点研究中观察到的结果。临界线 RFFIT 阳性样本显示出可变的反应，许多样本显示完全中和，其中一些样本显示低中和。这种可变性还影响了测定的计算灵敏度以及 Pearson 与 RFFIT 滴度的相关性（图 6C）。然而，令人鼓舞的观察结果是，PVNT 测定在所有临界值集中具有 100% 的特异性和阳性预测值，如 ROC 分析所示（表 2 和图 6D）。任何具有假阳性的检测都不能推荐用于评估针对狂犬病等致命疾病的保护性免疫反应。因此，PVNT 的这种强度使其成为 RFFIT 的可靠替代品，尽管灵敏度较低。

这项研究有一些局限性。其中之一是在 ROC 分析中，我们无法进行曲线下面积（AUC）估计，因为所有数据点都局限在 Y 轴上，因为所有样本都具有 100% 的特异性。其次，我们可以在测定中只包括 10 个 RFFIT 验证的阴性样本，这可能是降低测定灵敏度估计的原因。总样本量也仅限于 71 个。目前正在进行进一步的研究来解决这些问题。

图7 R-PV-SEAP假病毒粒生产和假病毒中和试验(PVNT)总体方案。

(使用Biorender生成；https://www.biorender.com/).

图 7 显示了本研究中开发的测定的总体方案。这种基于 rVSV 的狂犬病 PVNT 检测以 SEAP 作为此处描述的检测系统，与基于活病毒的 RFFIT 检测相当。它克服了 RFFIT 检测的主要限制 [29]，最重要的是需要使用活狂犬病病毒。它消除了对昂贵的荧光显微镜的需求，也无需基于荧光的染色和在显微镜下对图像进行繁琐的手动检查。此外，在 RFFIT 分析中，需要格外小心以避免荧光漂白和淬灭，这也限制了结果的可重复读数。我们观察到的 PVNT 分析的另一个主要优点是显著缩短了周转时间。在经验不足的环境中，RFFIT 检测可能需要 48-72 小时才能读取结果 [13]。在 PVNT 中，可以通过中和后 12 小时检测 SEAP 表达。此外，它具有高通量适应性，因为它可以在多孔板中完成，并且可以使用商用读板器读取以测量吸光度。这也消除了与成像相关的主观性，并确保了可重复性和易于记录。

在评估对狂犬病疫苗的保护性免疫反应时，选择合适的检测方法至关重要 [30]。总体而言，我们的结果表明，这种狂犬病 PVNT 是一种可重复且高度特异性的测定法，具有客观和可记录的读数，可以作为 RFFIT 的合适替代方案，以评估对疫苗接种的保护性反应。

引用

狂犬病疫苗

评估人类抗狂犬病疫苗的反应：一种快速、高通量适应性、基于假病毒的中和试验，作为快速荧光病灶抑制试验（RFFIT）的替代方案

摘要