人用狂犬病疫苗

人用狂犬病疫苗

Deborah J. Briggs and Thiravat Hemachudha

摘要

自从巴斯德和他的同事在1881年生产并给两个被严重咬伤的小男孩注射了一种受感染的兔脊髓粗混合物后，人用狂犬病疫苗发生了巨大的变化。升级换代的狂犬病疫苗提高了治疗的效果和安全性，但是人用狂犬病疫苗仍然昂贵，并且对于世界上贫困地区生活在危险中的许多患者来说是无法获得的。人用狂犬病疫苗有许多不同的细胞培养基质和不同毒种研制的产品，所有疫苗都要求肌肉注射剂量的效价达到2.5IU/剂。生物标准化项目目前正在监督一个专家工作组，评估一种可行的体外替代方法，以替代美国国家卫生研究院(National Institute of Health，NIH)的体内效力检测。目前的人用细胞培养狂犬病疫苗非常有效，通常耐受性好，而且安全。尽管暴露前和暴露后预防的加速、经济性皮内方案可以在7天内完成，但疫苗需要冷藏。一些新的狂犬病生物制品目前正在研究的不同阶段中；然而，很少有人用狂犬病疫苗进入临床试验阶段。狂犬病不是一种可以根除的疾病，因此将继续需要成本更低、更易获得和耐热的疫苗供人类使用。

介绍

狂犬病是人类已知的死亡率最高的传染病，超过98%的人类死亡是由于接触了被感染的犬。一旦出现临床症状，死亡几乎不可避免。如果不是因为即使暴露后也能预防，狂犬病很可能会在最危险的传染病名单上名列前茅。幸运的是，对于全世界每年数千万暴露于狂犬病的患者来说，在暴露发生后通过适当的伤口处理和施用高效抗狂犬病生物制剂(包括狂犬病免疫球蛋白( rabies immune globulins，RIG)和细胞培养狂犬病疫苗( cell culture rabies vaccines，CCVs) 可以预防狂犬病的发生。狂犬病的这一特征归因于这样一个事实，即病毒在新感染患者体内的增值过程几乎总是足够慢，以允许迅速施用狂犬病疫苗来引发保护性免疫反应，从而防止临床狂犬病的发作。此外，对所有开放性伤口进行及时和适当的清洗并给予RIG有助于杀灭在暴露期间进入肌肉组织的病毒。

人用狂犬病疫苗的发展

虽然最初关于狂犬病是如何从受感染动物传播到未受感染动物的报道是在19世纪早期，但是是路易斯·巴斯德和他的同事鲁克斯、钱伯兰和图伊利尔开发了第一种有效的，尽管是粗制的人用狂犬病疫苗。第一个人用狂犬病疫苗的研制源于鲁克斯的观察，即通过将感染兔子的脊髓干燥不同的时间长度，狂犬病病毒可以在15天后完全减毒。基于鲁克斯的发现，巴斯德开始了实验，用感染狂犬病的脊髓给犬接种疫苗，这些脊髓已经干燥了不同的时间长度，从最弱的组织开始，假定是非感染组织。尽管第一次实验的结果是非决定性的，基于他最初的发现，巴斯德还是选择了给两个严重暴露的病人接种疫苗，约瑟夫·梅斯特和让·巴普蒂斯特·朱皮勒。这两个病人被患狂犬病的犬严重咬伤，如果没有巴斯德粗疫苗的干预，很可能会感染狂犬病。两位病人都活了下来，约瑟夫·梅斯特继续担任巴斯德实验室的看门人。巴斯德根据他掌握的有限数据来治疗这两个人类患者的决定在当今的现代医学世界中是完全不道德的，并且当巴斯德在1881年决定注射他的兔脊髓疫苗时受到了医学界的强烈批评。然而，重要的是要记住，暴露后没有有效的治疗狂犬病的方法，这两个病人几乎肯定会在没有干预的情况下死亡。

从绵羊或山羊脑生产的神经组织狂犬病疫苗(Nerve tissue rabies vaccines，NTV)取代了兔脊髓巴斯德疫苗，并一直使用到19世纪中叶，直到开始开发更纯的狂犬病疫苗。产自绵羊脑疫苗的NTV仍在埃塞俄比亚生产，并给人用。在寻找低反应原性狂犬病疫苗的过程中，富恩扎利达(Fuenzalida)和来自拉丁美洲的同事改进了生产工艺，用乳鼠脑组织代替成年绵羊或山羊脑组织。动物组织的这种变化消除了疫苗中髓磷脂的存在，从而有助于减少疫苗引起的不良反应。然而，尽管当富恩扎利达疫苗取代更粗糙的羊脑疫苗时，报告的不良反应发生率降低了，但当反应确实发生时，它们更严重。富恩扎利达型人狂犬病疫苗目前仍在玻利维亚和阿尔及利亚使用。

20世纪30年代，在动物脑组织中发生了从生产狂犬病疫苗的转变，当时病毒学家开发了通过接种含胚胎的蛋来生产病毒的改良方法。这一发现导致了第一种鸭胚胎疫苗(duck embryo vaccines，DEV)的开发，这种疫苗今天已不再使用。与目前可获得细胞培养疫苗相比，这些首次开发的疫苗被认为是粗制的，但它们提供了一种更安全、更纯和更均一的疫苗。尽管这次开发是在提高人用狂犬病疫苗效力方面向前迈出的一大步，但它们的效力不如预期。获得旨在提高疫苗纯度、效力和一致性的先进技术导致了高纯度禽源鸭胚疫苗的开发和销售(purified avian based duck embryo vaccine，PDEV）。现代禽类疫苗的生产过程使制造商能够去除几乎所有的蛋基蛋白质和髓磷脂，从而提供高度纯化的产品。高度纯化的以禽类为基础的人用狂犬病疫苗已经使用了30多年，其安全性和有效性已得到充分证明。

原代细胞系适应体外生长是病毒疫苗生产的一个突破。自从巴斯德和他的同事们为了寻找预防狂犬病发作的方法而干燥了第一条兔脊髓后，在病毒疫苗的生产中已经使用了许多不同的细胞基质(表1)。原代细胞用于生产两种人用狂犬病疫苗中的一种，这两种疫苗已获得世界卫生组织预认证。使用原代细胞作为病毒疫苗的底物有优点也有缺点。原代细胞是非致瘤性的，因此必须持续更换，并且不适合用于疫苗的连续细胞系生产。细胞培养物必须补充的事实增加了污染的机会，这在封闭的连续细胞培养物生产系统中可能不太明显。用于生产狂犬病毒疫苗的受精卵必须经过无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）认证。这一事实，以及大量的质量保证和良好的生产实践，有助于确保消除污染问题。纯化的鸡胚细胞狂犬病疫苗(Purified Chick Embryo Cell Rabies Vaccine，PCECV)是使用原代细胞培养技术生产的，作为一种安全、有效和耐受性良好的疫苗，已有大量文献记载。

表1人用狂犬病疫苗的历史发展底物灭活过程疫苗名称神经组织疫苗

改编自Rupprecht CE，Nagarajan T，Ertl，H. Plotkin的疫苗:细胞培养狂犬病疫苗。

用二倍体细胞生产的人用狂犬病疫苗至今仍在使用。它们是高度免疫原性的，并且有很好的安全记录。人二倍体细胞狂犬病疫苗(Human diploid cell rabies vaccine，HDCV)可用于半连续生产系统，允许细胞的多次扩增。第一个HDCV是在威斯达研究所开发的，有文件证据表明，它们比地鼠肾肾细胞狂犬病疫苗更安全、免疫原性更强。HDCV的生产成本限制了它在资源贫乏国家的使用。

连续细胞系，例如Vero细胞，提供了能够维持生产病毒疫苗的封闭系统的优势。它们具有无限的寿命，并且已发表的研究表明它们对于多次传代来说是非致瘤的。纯化Vero细胞狂犬病疫苗(Purified Vero cell rabies vaccine，PVRV)于20世纪80年代开发和销售，已被证明是一种高效、安全和耐受性良好的疫苗。赛诺菲巴斯德生产的PVRV已经达到世卫组织资格预审标准，并在全球销售。PVRV和PCECV的发展和全球传播挽救了数百万狂犬病患者的生命。

人用狂犬病疫苗的注册

如上所述，自从巴斯德和他的同事在19世纪末制造出第一种NTV以来，用于人类的狂犬病疫苗在的纯度、效力和可靠性方面都有了显著的提高。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)公布了生产人用狂犬病疫苗的标准建议，并强烈建议用细胞培养体外生产的疫苗替代通过接种和随后收获受感染动物的大脑制备的神经组织疫苗。尽管生产用于动物的狂犬病疫苗可以配制成佐剂疫苗、修饰活疫苗、重组疫苗或灭活疫苗，但目前生产和许可用于人类的唯一的细胞疫苗是灭活疫苗。详细描述狂犬病疫苗生产过程的广泛综述已在其他地方发表。

各国政府有责任批准、许可和监督人用狂犬病疫苗在本国的使用。世卫组织与疫苗学和标准化领域的全球专家合作，建立了一套生物制品生产标准，包括狂犬病疫苗。关于具体生产建议的信息可在世卫组织网站上免费获得。此外，已经过评估并符合世卫组织良好生产工艺要求的疫苗生产设施可以申请世卫组织疫苗资格预审，这表明其疫苗生产符合或超过世卫组织生产和人类使用的要求。

世卫组织建议，根据NIH效价测定，CCV的每一次肌肉注射剂量至少含有2.5IU的抗原。对于狂犬病疫苗的皮内接种，世界卫生组织没有推荐额外的效力要求。已发表的数据表明，每肌内注射剂量含2.5IU的疫苗使用肌内注射，以0.1IU使用泰国红十字会PEP ID方案皮内给药时，均将产生足够的免疫应答。然而，各国政府可能有特定的效力要求，超过世卫组织要求的在本国使用的每支肌内使用2.5IU/瓶的水平。

很明显，不管是什么品牌的疫苗，人用狂犬病疫苗的效力会因批次而异。这与CCV的生产涉及生物系统以及制造过程中的许多不同步骤有关。所有这些过程都会影响病毒糖蛋白(G蛋白)的数量和稳定性，从而影响最终产品的效力。因此，为了确保每批人用狂犬病疫苗都具有足够的抗原特性，在使用世界卫生组织推荐的方案之一进行疫苗接种后引发足够的免疫反应，需要进行严格的质量控制。NIH小鼠接种试验是目前国际上公认的评估人用狂犬病疫苗效力的效力试验。50多年前，世界卫生组织采用了NIH效力测试。在过去的几年里，国际监管机构、世界卫生组织、全球专家和制药业一直在努力用更人道、更准确和更灵敏的检测方法来取代NIH效价检测。NIH测试的许多固有问题，无疑是取代NIH测试的最令人担忧的原因之一，是它需要大量的动物作为试验的一部分被牺牲掉。

2011年，来自至少六个不同国家的几个国际机构，包括监管机构、国际和国家卫生计划、统计人员和生产人用狂犬病疫苗的制药公司，举办了一个研讨会，以寻找一个合适的替代方法来替代NIH效力检测方法。该研讨会名为国际替代方法验证协调委员会(International Coordination Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM)，一致认为替代NIH效价测定是可行和可取的。该倡议背后的目标是改进对3 R的遵守，即在研究中替换、改进和减少使用动物；降低批量测试成本，从而缩短疫苗批签发的准备时间，并帮助减少疫苗短缺。已经进行了许多研究来评估NIH试验的替代试验，并且大多数狂犬病疫苗生产企业已经在生产线试验中取代了NIH试验，以评估生产过程中的效力。考虑到一个公认的事实，即针对狂犬病的保护是由于针对天然膜相关三聚体形式的G蛋白的中和抗体的产生，ICCVAM同意用完全体外试验代替体内NIH效力试验是一个可实现的目标。此外，欧洲药典建议使用有效的血清学或免疫化学试验来代替狂犬病疫苗NIH效力试验。

五个实验室参与了一项研究，使用几种不同的试剂和分析设计来评估标准化的夹心酶联免疫吸附试验。双方同意，下一步将在欧洲药品和医疗保健质量总监办公室/欧洲委员会和欧盟委员会的生物标准化计划(Biological Standardisation Program，BSP)的支持下，对选定的检测方法进行正式验证。2017年，工作组公布了他们的研究结果，并确定了下一步工作:(1)在生物标准化计划(BSP)的监督下，开展一项国际合作研究，该研究将使用从先前研究中选出的两种单克隆抗体评估重复性和再现性；和(2)在完成合作研究后，将采用商定的酶联免疫吸附试验作为人用狂犬病疫苗效力的NIH替代方法。预计在未来几年内将完成国家卫生研究院测试的替换工作。

狂犬病疫苗的评价

考虑到自30多年前最初开发和上市以来，已有数百万暴露于狂犬病的患者接受了CCVs，接种疫苗后只要极少数记录在案的人类狂犬病病例，很明显很少有“真正的”狂犬病疫苗免疫失败者。世卫组织称当按照规定的建议接种人用狂犬病疫苗时，它们是最有效的人类疫苗。几乎每一个在暴露发生后报告的人类狂犬病病例都可以归因于以下原因之一：患者没有寻求PEP、在寻找PEP时的延迟、不遵守世界卫生组织推荐的PEP方案，且未被归因于缺乏疫苗效力。肌内或皮内给药，与RIG联合给药，CCVs有效性的直接证据已在许多已发表的科学论文中记录。记载狂犬病疫苗免疫原性的间接证据也已在许多血清学临床研究中发表。过去30年来，通过注射CCVs积累的数据已经证明，CCVs是安全的、免疫原性的、持久的，绝不应对任何接触过狂犬病的人隐瞒。

在初始开发阶段、临床开发阶段和上市后监测阶段，有几个标准可以用来评估新的人用狂犬病疫苗。这些包括但不限于:抗原性、有效性、免疫原性、安全和耐受性。上文已经讨论过评估人用狂犬病疫苗的效力，世卫组织建议人用狂犬病疫苗的效力为2.5IU/肌内剂量。然而，任何疫苗的最终目的都是预防疾病。从历史上看，对CCV疗效的评估包括使用良好临床实践(good clinical Practices，GCP)程序对大约100名患者进行临床试验，记录在暴露于实验室确认的狂犬病动物后至少存活一年的情况。当新的疫苗技术被认为是目前用于预防狂犬病的狂犬病疫苗的替代品时，进行临床试验以提供疗效数据是一项必要的要求。自CCVs开发和上市以来公布的功效数据为这些疫苗是拯救生命的生物制剂提供了充分的保证。

如上所述，在GCP条件下进行临床试验以证明疫苗的有效性是昂贵的、困难的和耗时的，并且将暴露的患者置于未经证实的疫苗的风险中是不道德的。科学证据表明中和抗体对于预防狂犬病至关重要，因此，在狂犬病疫苗接种后检测中和抗体的存在仍然是评估CCV 有效性的非常有用的工具。有两种被世界卫生组织认可的检测狂犬病病毒中和抗体的方法，特别是快速荧光聚焦抑制试验 (Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test，RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验 (Fluorescent Antibody Virus Neutralization Test，FAVN)。这两种检测都很复杂，需要专门的实验室设备和训练有素的人员。对用由不同种子病毒产生的CCVs接种后中和抗体滴度水平的测量研究表明，可在最初14天内测量的中和抗体的量取决于所施用疫苗生产中使用的种子病毒和中和试验中使用的攻击病毒之间的同源性程度。

细胞培养疫苗的发展极大地提高了需要PEP的病人对狂犬病疫苗的安全性和耐受性。仍有少数报告的不良事件与注射CCVs有关，但PEP应绝不要对任何接触过狂犬病的病人隐瞒。轻度全身性不良事件通常与注射CCVs有关，包括注射部位疼痛、红斑、肿胀、发烧、发冷和头痛困扰。如果接受CCV治疗的患者确实经历了严重的不良事件，应立即寻求医疗建议。

未来人用狂犬病疫苗产品线

40年前首次开发和上市时，CCVs被贴上了“现代”的标签，极大地提高了人用狂犬病疫苗的安全性和有效性。不幸的是，对于大多数生活在日常感染风险中的人来说，它们仍然是昂贵的。这是几个因素造成的结果，包括狂犬病流行国家的农村诊所通常没有狂犬病疫苗；它们需要长时间的多次给药，因此需要多次门诊，经常需要昂贵的旅行费用；目前的疫苗需要冷藏，这在基础设施有限的地区往往不可靠。这些，不知何故已经得到了改善，通过引入一个“一周计划”，为双方的准备和公私伙伴关系。考虑到开发能够克服这些障碍从而提高可获得性的有效狂犬病疫苗所需的技术是可用的，鼓励开发新一代人用狂犬病疫苗是一个可实现的目标。

有少数新的狂犬病生物制品，包括狂犬病疫苗，在发展的初始阶段，大多数正在开发的疫苗都集中在动物使用。最近，Kalimuddin等人公布了一项二期临床试验的有希望的数据，该试验检验了一种含佐剂人用狂犬病疫苗的免疫原性。他们使用的佐剂是用卡那霉素和钙(PIKA)稳定的聚肌肽-聚胞苷酸的精制形式。使用这种佐剂疫苗的初步动物研究显示，仓鼠的滴度很高，并且能够存活。在人类中进行的第二阶段研究使用了2-1-1萨格勒布方案，并报道了57.6%接受PIKA狂犬病疫苗的受试者在第7天的滴度达到0.5 IU/ml，相比之下，接受非佐剂CCV的对照组的滴度为43.8%。

基于杆状病毒衍生糖蛋白的纳米粒子疫苗技术是一种RNA活性狂犬病疫苗，正在动物模型中进行测试，但这项研究是否会导致新的人用狂犬病疫苗仍有待观察。其他类型的新型狂犬病疫苗包括E1缺失型腺病毒载体或表达狂犬病G蛋白的黑猩猩源疫苗，它们可能为未来廉价的人用狂犬病疫苗提供希望。

总之，尽管目前可获得的CCVs非常有效，但价格昂贵，这导致了在世界上经济贫困地区无法获得这种CCVs。CCVs目前还需要多剂量来确保暴露后的保护，这也增加了PEP的成本。尽管世界卫生组织在过去的二十年里一直在敦促替代NTVs，但仍有三个国家生产和使用这些较旧的、不太纯净的非NTVs，向寻求PEP的患者提供疫苗。制造商投资与非传染性疾病相关的其他药物的动机继续阻碍着人用狂犬病疫苗的进一步发展，这种疫苗可以提供多剂量的替代物，并提供更持久的热稳定性。在未来十年内实现人类“无狂犬病”世界的目标是一个有价值的目标，也是一个可以实现的目标，但这将取决于有效且廉价的人用狂犬病疫苗的推广。

致谢：

本章节：Human Rabies Vaccines

作者：Deborah J. Briggs and Thiravat Hemachudha

原书：ISBN 978-3-030-21083-0 ISBN 978-3-030-21084-7 （eBook） https：//doi.org/10.1007/978-3-030-21084-7