无血清纯化Vero狂犬病疫苗与狂犬病人二倍体细胞疫苗(HDCV; Imovax® Rabie)在健康成人中以模拟狂犬病暴露后处置的免疫原性和安全性

Safety and immunogenicity of a serum-free purified Vero rabies vaccine in comparison with the rabies human diploid cell vaccine (HDCV; Imovax® Rabies) administered in a simulated rabies post-exposure regimen in healthy adults

摘要

新一代无血清、无抗生素、纯化的Vero狂犬病疫苗(PVRV-NG；赛诺菲)是基于用于目前许可的纯化Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV；Verorab®，赛诺菲)和人二倍体细胞疫苗(HDCV Imovax®，赛诺菲)。PVRV-NG已被证明具有令人满意的安全性，并可诱导强大的免疫反应，在健康儿童和成人中作为三剂暴露前预防(PrEP)方案接种时，显示出与PVRV相比的非劣效性。在此，我们评估了美国健康成年人使用PVRV-NG作为模拟暴露后预防(PEP)并同时使用人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)时，其安全性和免疫原性非劣效性。参与者根据5剂量Essen肌肉注射方案(4周，1次注射部位方案，在第0、3、7、14和28天给予单剂量)接种PEP疫苗，同时在第0天给予HRIG。在第0、14、28和42天评估狂犬病病毒中和抗体(RVNA)。如果PVRV NG和HDCV之间血清转换率(第14天RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL)差异的95 %置信区间(CI)的下限高于非劣效性界限–5%，则表明PVRV NG与HDCV相比具有非劣效性。在每次接种疫苗后评估安全性，并在整个研究过程中进行监测。PVRV NG组和HDCV组之间的血清转换率差异为–2.8%(95%可信区间为–8.08至4.20)，表明未显示非劣效性。在第14天，两个研究组的血清转化率均< 99 %。未发现重大安全问题，PVRV-NG的安全性与HDCV相似。

1. 介绍

狂犬病病毒存在于世界各地，尽管人类狂犬病主要发生在发展中国家，特别是亚洲和非洲的发展中国家，超过99 %的狂犬病死亡发生在这里。疫苗接种是疾病预防的关键，依赖于两种策略:暴露前预防(PrEP)和暴露后预防(PEP)。建议高暴露风险人群使用PrEP，如生活在狂犬病流行区的人群(每年被狗或吸血蝙蝠咬伤的发生率> 5 %)、有职业风险的人群以及去高风险地区的旅行者。PEP适用于暴露于潜在狂犬病动物的个体，无论先前是否有狂犬病疫苗接种史。对于从未接种过狂犬病疫苗的个人，PEP还应包括在暴露当天注射人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)。

几种基于细胞的疫苗目前被许可用于PrEP和PEP疫苗接种。广泛使用的狂犬病疫苗包括人二倍体细胞疫苗(HDCV; Imovax®，赛诺菲)、纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV; RabAvert®， Bavarian Nordic)和纯化的Vero细胞疫苗(PVRV；Verorab®，赛诺菲)，其具有良好表征的安全性和免疫原性特征。HDCV和PCECV是美国目前批准用于PrEP和PEP的仅有的两种狂犬病疫苗。

下一代无血清、无抗生素、纯化的Vero狂犬病疫苗(PVRV-NG；赛诺菲)是基于用于HDCV和世界卫生组织(WHO)预先鉴定的纯化Vero细胞狂犬病疫苗的相同Pitman-Moore病毒株开发的，使用来自动物/人类来源(RMAO)的无工艺的原材料，以最小化潜在的残留生物污染。一些指南建议尽可能避免使用动物来源的材料。此外，PVRV-NG是高度纯化的，导致低残留DNA含量(< 100 pg/疫苗剂量)。PVRV NG与PVRV相比的安全性和免疫原性非劣效性已在法国成人PrEP中得到证实，并作为中国儿童和成人的模拟PEP(未施用HRIG)。PVRV-NG与HDCV 的安全性和非劣效性也在菲律宾儿童和美国的成年人PrEP中得到证实。

在这里，我们评估了美国健康成年人作为模拟PEP接种，同时肌肉注射HRIG时，PVRV-NG与HDCV相比的免疫原性非劣效性和安全性。

2. 方法

2.1. 研究设计和参与者

这是一项II期、观察者盲、对照、随机、多中心研究，于2013年6月10日至2014年2月27日在美国的五个中心进行。本研究遵循《赫尔辛基宣言》和《人用药物注册技术要求协调国际会议(ICH)良好临床实践指南(GCP)》制定的标准，以及所有地方和/或国家法规和指令。适用的独立伦理委员会和机构审查委员会批准了研究方案。在执行任何研究程序之前，从参与者处获得了知情的书面同意。

该研究的设计和纳入标准类似于使用PrEP方案在健康成人中使用相同疫苗PVRV-NG进行的研究。年龄在18岁至< 65岁的健康成年人被邀请参加。排除标准包括:暴露于狂犬病的高风险，以前接受过任何狂犬病疫苗或在研究疫苗接种之前或之后的四周内接受过任何疫苗，在前三个月内接受过免疫球蛋白或血液制品，怀孕或有怀孕风险，已知/疑似先天性或获得性免疫缺陷或接受过免疫抑制治疗，自我报告的艾滋病毒、乙型肝炎或丙型肝炎血清阳性，以及已知对任何疫苗成分过敏。根据当地惯例，向参与者提供津贴，以补偿研究访问和程序所需的时间和旅行。

2.2. 随机化和盲法

符合条件的参与者使用交互式语音应答系统(IVRS)/交互式网络应答系统(IWRS)以2:1的比例随机分组，每组6人，根据埃森PEP方案(4周，1个注射点，在D0、D03、D07、D14和D28注射一剂)接受PVRV-NG或HDCV治疗。所有受试者在第一次接种时(D0)接受HRIG。每个研究中心指定一名未参与安全性或任何其他试验评估的非盲工作人员准备并施用指定的疫苗和HRIG。参与者不知道注射的是哪种疫苗，因为产品是在他们不在场的情况下制备的。包括参与安全性或任何其他试验评估的研究调查人员在内的工作人员没有参加疫苗接种会议。主办方人员也被蒙在鼓里。

2.3. 疫苗和HRIG

PVRV-NG[批次S4357 5.1 IU/mL]和HDCV[批次H11803，2 IU/mL]为冻干粉末，需要在使用前立即分别用0.5 mL生理盐水稀释液和1.0 mL无菌注射用水复溶。每剂疫苗含有灭活的狂犬病病毒(Wistar狂犬病Pitman Moore/WI 38 1503–3M株)，根据美国国家卫生研究院(NIH)效力试验，每剂疫苗的效力≥ 2.5 IU。HRIG作为理论浓度为150 IU/mL的即用型溶液提供，用于按照20 IU/kg或0.133 mL/kg体重的推荐剂量注射(批号:J1405效价204 IU/mL；Imogam® Rabies， 赛诺菲)。

研究疫苗在上臂三角肌区域进行肌内注射(IM )，随后在交替侧进行注射，并与前一次注射部位相距至少3 cm。在大腿前外侧肌肉注射HRIG，将所需体积分开(每个注射部位最多5 mL)并在不同部位接种(根据需要，交替侧和注射部位至少相隔3 cm)。

2.4. 免疫原性评估

所有参与者在第一次接种疫苗和注射HRIG前，在D0(基线滴度)、D14(第四次接种疫苗前)、D28(第五次接种疫苗前)和D42(第五次接种疫苗后14天)提供血样，用于评估狂犬病病毒中和抗体(RVNA)滴度。如前所述，使用快速荧光焦点抑制试验(RFFIT)测量RVNA滴度，在参考实验室(美国堪萨斯州立兽医诊断实验室[KSVDL]，由主办方的全球临床免疫学实验室负责)。RVNA滴度被定义为可中和50%攻击病毒标准11 (CVS-11)的血清的最高稀释度，校准至第一个世卫组织抗狂犬病免疫球蛋白国际标准(或内部类似校准的参考血清)的50%中和终点滴度。RFFIT分析的定量下限(LLOQ)为0.2 IU/mL。

2.5. 安全评估

每次接种疫苗后，观察参与者30分钟，看是否有任何不良事件或反应。在整个研究过程中，为他们提供了日记卡、数字温度计和柔性尺子，并指导他们如何使用它们来记录不良事件(AE)。要求参与者记录前三次注射之间以及剩余注射后最多7天内请求的注射部位反应(疼痛、红肿)和全身反应(发热、头痛、不适和肌痛)，以及每次注射之间以及最后一次注射后最多28天内请求的(自发报告的)全身AE。整个研究过程中监测的特别关注的不良事件(AESIs)包括过敏反应、脑炎和惊厥。从招募到最后一次注射后6个月监测严重不良事件(SAE)。

2.6. 结果

主要终点是由RFFIT测量的在D14(即第三次疫苗注射后7天)世卫组织定义的保护性RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者。次要免疫原性终点包括在第28天(第四次注射后14天)和第42天(最后一次注射后14天)RVNA滴度≥ 0.5的参与者比例、D0、D14、D28和D42的RVNA滴度以及参与者滴度比(D14/D0、D28/D0和D42/D0)。安全性终点是请求注射部位和全身不良事件的频率、主动不良事件的频率以及AE和SAE的发生率。

2.7. 统计方法

共同主要目的是证明PVRV NG在D14 RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例方面相对于HDCV的非劣效性，并证明PVRV NG组中达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例至少为99 %，95 %置信区间的下限至少为97 %。样本量计算由非劣效性检验驱动，α水平为2.5 %(单侧假设)，D14 RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例的最大临床可接受差异为5 %，作为PVRV NG与HDCV的非劣效性免疫原性界限。假设两种疫苗的RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例为99 %，且非平衡随机化为2:1 (PVRV-NG: HDCV)，PVRV-NG组的194名参与者和HDCV疫苗组的97名参与者将提供90 %的功效，以使用Farrington和Manning方法检验零假设。假设15 %的参与者不可评估，PVRV-NG组的228名参与者和HDCV疫苗组的114名参与者需要参加研究。此外，假设5 %的退出率，预计观察到的达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例至少为99 %，如果在每个方案分析集(PPAS)和全分析集(FAS)中有一个或没有参与者的RVNA滴度< 0.5 IU/mL，则95 %的置信下限至少为97 %。

使用D14 RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例差异的双侧95 % CI进行非劣效性检验。差异的95 %置信区间是在没有连续性校正的情况下使用威尔逊评分法计算的。如果两组间差异的双侧95 %可信区间的下限高于–5%，则证明非劣效性。对于第二个共同主要目标，在D14达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例和95 % CI使用精确二项式方法(Clopper-Pearson方法)计算)在PVRV-NG集团。

主要免疫原性分析在按方案分析集(PPAS)中进行评估，并在全分析集(FAS)上重复进行确认。FAS被定义为接受至少一剂研究疫苗的随机参与者的子集。PPAS是FAS的一个子集，包括符合所有方案规定的纳入标准、无排除标准、血清反应阴性、正确接受了所有指定的注射，并在第0天和第14天提供了所有必需的血清学样本和有效的检测结果的参与者。每个研究组中的四名参与者在D0时具有可检测的RVNA水平，因此他们被排除在PPAS之外。所有八名受试者都证实，他们在参与研究之前没有接种过狂犬病疫苗。安全性分析集(SafAS)针对每个个体剂量定义为接受该特定剂量的参与者子集。根据在该剂量下接种的疫苗对接受该剂量的任何参与者进行分析。对于安全性参数，使用比例的精确二项式分布(Clopper-Pearson法)计算比例点估计值的95%CI。

在一个临时后分析，使用美国免疫实践咨询委员会(ACIP)对主要目标(血清转化和应答率> 99 %的参与者比例)进行了重新评估，血清转化标准(即，在1:5稀释度下，完全病毒血清中和的参与者比例)。

所有统计分析均使用SAS企业指南5.1版软件进行。

3. 结果

3.1. 参与者

总共有342名参与者(PVRV-NG组230人，HDCV组112人)入选并随机分配到研究组。参与者的基线人口统计特征总结于表1。所有参与者都提供了基线血样，并在第一次研究疫苗接种时接受了HRIG。其中，320人(93.6 %)接受了五种计划疫苗接种:PVRV-NG组和HDCV组分别有217人(94.3 %)和103人(92.0 %)。研究中的参与者流程总结于图1。

表1. 基线人口统计(全分析集)。

n，具有相关终点的可用数据的参与者的数量；n，满足所列类别的参与者数量；标准偏差

图1. 研究中的参与者倾向。AE，不良事件；n，每次访问时出席的参与者总数；n，满足所列类别的参与者数量；v，访问。

3.2. 免疫原性

按疫苗组分列的D14 RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例总结于表2。在D14，两个比例(PVRV-NG-HDCV)之差的95 % CI的下限小于-5%，因此不符合第一个共同主要目标的非劣效性标准。在D14，RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例低于99 %，在PVRV NG和HDCV组中，95 % CI下限均< 97 %表2)。因此，第二个主要目标也没有实现。然而，两组中所有参与者在第五次疫苗接种后(D42)均达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL，在第四次疫苗接种后，PVRV-NG和HDCV组分别为97.7 %和98.1 %，在FAS(表S1)。对于PPAS也观察到类似的结果(表3)。值得注意的是，在D14的PVRV-NG组的四名参与者中未发现可检测的滴度，在D28的PVRV-NG组和HDCV组各有一名参与者(报告为0.1 IU/mL)。总的来说，在所有评估的时间点，两个疫苗组的RVNA GMT相似(表3和S1).

表2. PVRV NG与HDCV的非劣效性——根据随机疫苗组(根据方案分析集)， D14 RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例。

*如果RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的参与者比例的PVRV-NG-HDCV差值的双侧95 % CI的下限> 5.0 %，则达到非劣效性。

CI，置信区间；m，具有相关终点的可用数据的参与者的数量；n，具有相关终点的可用数据的参与者的数量；n，每组参与人数；快速荧光焦点抑制试验；RVNA，狂犬病病毒中和抗体。

表3. 免疫原性总结- RVNA滴度(RFFIT方法- IU/mL)(根据方案分析集)。

*拥有相关终点数据的参与者人数。

CI，置信区间；快速荧光焦点抑制试验；RVNA，狂犬病病毒中和抗体。

在这里临时后分析:根据ACIP血清转化标准，根据1:5稀释度的完全/不完全病毒中和标准，对PPAS的所有样品进行重新解读；分别有99.5 %和100 %的PVRV NG和HDCV参与者血清转换，两组之间的比例差异为-0.5%(95% CI；–2.62， 3.28)。这些结果表明，使用ACIP标准，发现PVRV NG不劣于HDCV，在D14的两个疫苗组中≥ 99 %的参与者达到完全中和，相应的95 % CI下限> 97.5 %。在FAS人群中也得到了相似的结果。

3.3. 安全

在任何注射后，请求注射部位和请求全身反应的频率按组总结在中表4。两组中诱发反应的频率相似，除了注射部位疼痛，PVRV-NG组报告的频率低于HDCV组(分别为35.2 %和57.7 %)。两组中不请自来的不良事件发生频率相似，大多数被评估为与研究注射无关，且不严重(表S2)。PVRV-NG2组中的两名受试者至少出现了一次不请自来的不良事件，这些事件被评估为与疫苗接种有关(一名受试者出现口腔和咽喉麻木，导致研究中止，另一名受试者在第四次和第五次疫苗接种后出现头晕，并在一天内缓解)。任何疫苗接种后28天内出现的主动不良反应见表S3。在D0和D56之间报告了三例SAE(两例发生在PVRV-NG组[急性胰腺炎和颌骨骨折]，一例发生在HDCV疫苗组[自杀未遂])。所有病例均被评估为与研究疫苗无关，且均已康复。在6个月的随访期间，报告了2例与研究疫苗无关的SAE(每组1例):PVRV-NG组的自然流产和HDCV组的哮喘恶化。研究期间未报告AE或死亡。七名参与者经历了至少一次导致停药的AE，一名在PVRV-NG组(如上所述)，六名在HDCV组；其中5例(PVRV-NG组1例，HDCV组4例)被认为与疫苗接种有关。

表4. 任何疫苗注射后的征求反应(最长7天)-安全性分析集。

CI，置信区间；m，具有相关终点的可用数据的参与者的数量；n，体验终点的参与者的数量。

4. 讨论

本研究评估了PVRV-NG与HDCV相比的非劣效性和安全性，作为成人HRIG模拟PEP的一部分接种。这是建立在先前的研究基础上的，该研究在法国成人中与PVRV相比、在美国成人和菲律宾的儿童中预HDCV相比，证明了PVRV-NG作为一种暴露前接种方案具有非劣效性，并作为模拟PEP方案的一部分，在中国的儿童和成人中与未合用HRIG的PVRV进行比较。

根据在D14达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL(世卫组织标准)的参与者比例，PVRV NG与HDCV的非劣效性未得到证实，在两个研究组中达到该滴度的比例均< 99 %。HDCV组的低血清转换水平(PPAS中D14为94.8 %，D28时仍为98.1 %)在研究时是出乎意料的，因为HDCV已经使用了40多年，并具有良好的临床表现。为了确定两个研究组中大量参与者未能达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL的原因，进行了大量调查，包括彻底检查疫苗批次、临床场所的样本和产品管理、参与者特征和RFFIT方法。然而，这些调查未能确定低比率的任何合理原因。用于评估RVNA的检测方法的固有可变性可能是一个原因。为了进一步研究RFFIT检测中的潜在可变性(可能的原因)，在另外两个独立实验室(法国巴黎巴斯德研究所和美国佐治亚州亚特兰大市亚特兰大健康协会)使用RFFIT检测对一组阳性和所有阴性样本进行了重新检测。在D14、D28或D42的53份RVNA水平< 0.5 IU/mL的样本中，重新检测显示，每个实验室分别有51份和49份样本实际上达到了RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL。然而，未达到0.5 IU/mL阈值的样品(分别为两个或六个样品)的滴度≥ 0.2 IU /mL，这表明存在一定水平的免疫反应。另一个可能起作用的因素是，由于HRIG的干扰，在D14对狂犬病疫苗的免疫反应延迟，这是一个众所周知的现象，并已在动物和人类中得到证实。值得注意的是，在D14的多项临床研究中，报告了RVNA ≥ 0.5 IU/mL且足够效价≥ 2.5 IU/mL(可能> 5 IU/mL)的许可疫苗的受试者比例相似，包括在现实世界中，在参考实验室中有1.4 %到13.0 %的受试者没有达到这一阈值。因此，所提出的共同主要目标和在D14达到RVNA ≥ 0.5 IU/mL的受试者超过99 %的阈值可能并不总是能够实现，并且在未来几年可能会有争议。此外，还应考虑免疫反应的动力学。

我们还进行了补充临时后使用ACIP血清转化标准对所有样品进行分析(在1:5血清稀释度下完全中和病毒)来重新解释最初的结果。在D14，根据≥ 0.5 IU/mL的阈值(世卫组织标准)，24个样本中有23个没有实现血清转换，当应用ACIP标准时，发现其为血清阳性。这些结果的差异是由于世卫组织和ACIP指南之间狂犬病血清学结果表达的差异，如与中和相比的国际单位。

总体而言，在模拟PEP Essen方案中，成人人群(≥ 18岁至< 65岁)服用PVRV-NG和HDCV，同时服用HRIG，耐受性良好，未观察到意外的安全性信号，这为使用PVRV-NG提供了进一步的支持，与早期的临床试验结果一致。

这项研究是在健康受试者中进行的，不包括免疫缺陷的个体或孕妇，因此限制了这些结果的普遍性。此外，肌肉注射全剂量的HRIG仅反映了ACIP指南的实践并且它没有反映更新的世卫组织指南的实践，即仅在伤口部位周围施用HRIG。还应注意的是，美国疾病控制和预防中心现在推荐四剂量PEP方案，除了用于免疫能力改变的人的五剂量方案，并规定世卫组织0.5 IU/mL阈值应用于评估狂犬病抗体水平。

总之，就在D14达到RVNA滴度≥ 0.5 IU/mL(世卫组织标准)的参与者比例而言，PVRV NG与HDCV相比的非劣效性未得到证实，两组中达到该阈值的参与者百分比均< 99 %。使用ACIP血清转换标准对所有样本的免疫学结果进行重新解释，结果显示PVRV-NG将证明不劣于HDCV，在这些条件下，D14两组中> 99 %的参与者达到血清转换。PVRV-NG的耐受性也很好，在研究过程中没有发现重大的安全问题。然而，由于不符合非劣效性要求，PVRV-NG被重新命名为PVRV-NG2，增加了抗原含量。在随后的II期临床研究(NCT03145766)中，分析了不同PVRV-NG2制剂的PEP免疫原性和安全性和两项III期临床研究(NCT03965962和NCT04478084，分别采用IM和ID接种途径)。

Pichon S, Moureau A, Petit C, Kirstein JL, Sheldon E, Guinet-Morlot F, Minutello AM. Safety and immunogenicity of a serum-free purified Vero rabies vaccine in comparison with the rabies human diploid cell vaccine (HDCV; Imovax® Rabies) administered in a simulated rabies post-exposure regimen in healthy adults. Vaccine. 2023 Dec 16:S0264-410X(23)01398-1. doi: 10.1016/j.vaccine.2023.11.052. Epub ahead of print. PMID: 38105138.