转变疫苗学

疫苗利用了免疫系统抵抗感染的自然能力。关于自然免疫的第一次描述可以追溯到公元前430年。雅典历史学家修昔底德，⁵在雅典和斯巴达之间的伯罗奔尼撒战争期间写了一篇关于一场瘟疫的报道，这场瘟疫杀死了雅典三分之一的人口。这种传染病是如此的具有破坏性，以至于即使在同一个家庭中，也没有人敢去照顾病人。然而，人们注意到，一旦康复，个人就不会再次生病，因此，只有那些已经康复的人才有责任照顾生病和垂死的个人。这标志着与自然免疫有关的第一个具体线索。

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图1. 历史上的技术突破推动了疫苗创新

该图强调了疫苗领域历史上的重大进步，这些进步极大地促进了疫苗学领域的发展。

在詹纳实验近一个世纪后，罗伯特·科赫和路易斯·巴斯德发现传染病是由微生物引起的，路易斯·巴斯德推测暴露于减毒病原体也可以赋予免疫力(图1)。因此，巴斯德开始开发多种方法来干燥，热灭活，将病原体暴露于氧气，或在不同的动物宿主中传代，以防止病原体引起疾病。巴斯德从一个概念证明开始，他证明了他可以在接种引起鸡霍乱的减毒细菌后保护鸡免于死亡多杀巴氏杆菌,¹⁰为减毒病原体疫苗的开发铺平了道路。然后，他着手开发一种狂犬病疫苗，其策略是使用干燥空气来削弱狂犬病病毒的毒性，并表明他可以在动物中提供针对该疾病的保护。鉴于在动物身上取得的有希望的结果，他于1885年成功地使用了狂犬病疫苗，挽救了被患狂犬病的狗咬伤的男孩约瑟夫·梅斯特的生命。^11,12

在巴斯德成功后不久，1890年，埃米尔·冯·贝林和柴田北里发现，从白喉毒素攻击后幸存的豚鼠中收集的血清能够治愈受感染的动物，并进一步在攻击前提供保护。¹³到19世纪末20世纪，很明显传染病是由微生物引起的，而且血清转移可以预防和治疗疾病。此外，很明显，通过削弱或杀死传染性病原体或通过接种非致命形式的病原体毒素而生产的疫苗可以在健康人群中产生免疫力并提供疾病保护。这些连续的创新浪潮导致了抗白喉、破伤风和炭疽的救命血清的生产。此外，生产了针对伤寒、鼠疫、霍乱以及后来针对百日咳(表1)。Albert Calmette和Camille Guérin通过将牛的直系同源物结核分枝杆菌, 牛型结核菌，通过动物230次来减弱细菌。¹⁴这种疫苗名为卡介苗，来自卡介苗，仍然是唯一被批准用于预防结核病的疫苗。1924年，英国的格伦尼和法国的拉蒙发现，白喉和破伤风毒素可以用甲醛完全解毒。¹⁵这一发现导致了至今仍在用于预防白喉和破伤风的毒素疫苗的开发。

几十年后，当在鸡蛋或细胞培养中大量培养病毒成为可能时，抗病毒疫苗被开发出来。¹⁶1935年，马克斯·泰累尔通过在实验室传代病毒开发了黄热病17D疫苗。¹⁷同样，1936年，托马斯·弗朗西斯能够在含胚胎的鸡蛋中培养流感病毒，这促进了1940年第一个流感疫苗的开发。¹⁶然后，Enders、Weller和Robbins对用于病毒生长的细胞培养基质的关键技术开发使得许多灭活或减毒病毒疫苗得以开发，包括1954年的Salk疫苗和1963年的Sabin疫苗，用于预防脊髓灰质炎。¹⁸继脊髓灰质炎疫苗之后，20世纪60年代，塞缪尔·卡茨(Samuel Katz)、莫里斯·希勒曼(Maurice Hilleman)和斯坦利·普洛特金(Stanley Plotkin)分别开发了麻疹、腮腺炎和风疹疫苗。^19,20此外，在1975年，Michiaki Takahashi利用细胞培养中的连续传代开发了减毒水痘活疫苗，为许多其他病毒疫苗的开发开辟了道路。²¹

1969年，Goldsheneider和Gotschlich报道了具有抗脑膜炎球菌荚膜多糖抗体的人可以免于疾病。^22,23这一观察使他们开发了从细菌中纯化高分子量多糖的新方法，从而开发了针对脑膜炎球菌A和C(图1)。抗原纯化方面的这一重大创新引领了其他几种荚膜多糖疫苗的开发，包括肺炎球菌疫苗、流感嗜血杆菌，还有伤寒。²⁴然而，不幸的是，尽管多糖疫苗在成人和老年人中提供了强有力的保护，但这些疫苗在最易受这些感染的婴儿中效果不佳，部分原因是缺乏由多糖疫苗刺激的辅助性T细胞(Th)反应。为了克服这一挑战，Porter Anderson、John Robbins、Rachel Schneerson和David Smith将多糖结合到载体蛋白(如白喉毒素或破伤风类毒素的无毒形式)，提供强大的th信号以促进对多糖的免疫。²⁵这一创新导致了结合多糖疫苗的开发和许可流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌和伤寒。

在20世纪60年代末，已经开发了大量针对病原体的疫苗，这些疫苗可以被杀死或减毒(表1)。征服新疾病需要新技术。需要新技术的疾病包括乙型肝炎，这种病毒不能在培养基中生长，也不能减毒。1976年，莫里斯·希勒曼通过从高病毒载量个体的血浆中纯化抗原，开发了一种灭活疫苗²⁶ (图1)。该疫苗提供了抗感染保护，但由于安全和供应链问题，这种疫苗的可持续性值得怀疑。值得注意的是，在1979年，Pablo Valenzuela和Bill Rutter发表了乙型肝炎表面抗原的核苷酸序列，²⁷到了1982年，该小组改造了一种酵母菌株，使其产生重组抗原的表面蛋白，与病毒产生的表面蛋白没有区别。²⁸由酵母产生的抗原提供了无限量的乙型肝炎表面抗原，并允许在1986年批准第一个重组疫苗。²⁹不久之后，在1992年，Lowi和Shiller从昆虫细胞中表达了人类乳头瘤病毒(HPV)L1抗原。值得注意的是，昆虫细胞产生了类似病毒的L1抗原形成的纳米颗粒，这诱导了强大的中和抗体，³⁰从而在2006年获得了预防宫颈癌的疫苗许可。³¹受这些结果的启发，重组DNA被用于工程百日咳博德特氏菌表达一种失去毒性的突变百日咳毒素。^32,33与甲醛灭活的毒素相比，这种基因解毒的毒素诱导了5倍高滴度的毒素中和抗体。这一进步导致了无细胞百日咳疫苗在20世纪90年代中期获得许可。

在结合疫苗革命中，开发了针对脑膜炎球菌A、C、Y和W的疫苗，开发了针对脑膜炎球菌B (MenB)的疫苗(在欧洲和美国引起超过60%的脑膜炎球菌脑膜炎病例³⁴)被证明是困难的，因为MenB多糖与自身抗原相似。尽管为鉴定替代的MenB抗原做了一些努力，但迫切需要新的技术。1995年，Craig Venter发表了第一个活生物体的基因组序列，为新抗原的发现奠定了基础³⁵ (图1)。Craig Venter、Richard Moxon和Rino Rappuoli之间的联盟导致了完整的MenB基因组测序，结果发现了90多种新的表面抗原，其中30种诱导了杀菌抗体。选择了三种抗原，并开发成疫苗，于2013年获得许可。³⁶MenB疫苗开创了基因组革命，激发了“反向疫苗学”领域，这是今天疫苗发现的基础。³⁵

21世纪的巨大进步，X射线晶体学、冷冻电子显微镜和核磁共振极大地加速了疫苗的开发，提供了一种可视化和工程化抗原的方法³⁷ (图1)。抗原(通常与保护性抗体复合)的原子结构的测定提供了驱动强大中和反应所需的目标相互作用的分辨率。例如，使用结构导向设计，来自三个变体的非重叠表位被缝合在一起成为单个分子，以产生独特的通用MenB免疫原。³⁸类似地，尽管疫苗设计失败了近50年，³⁹来自呼吸道合胞病毒(RSV)的融合(F)蛋白的结构导向设计最终导致了2023年高免疫原性和保护性疫苗的开发。^40,41,42具体来说，融合前的形式，包含关键的中和抗体位点，非常不稳定，倾向于进入融合后状态，不能引发中和抗体反应。然而，在2012年，杰森·麦克勒朗、彼得·邝和巴尼·格拉汉姆发表了F融合前构象的第一个X射线结构，允许该团队通过插入二硫键和三聚化结构域来设计稳定的融合前抗原，这稳定了分子并将其锁定在融合前状态，诱导了强水平的中和抗体。⁴³两种稳定的F蛋白疫苗于2023年获得许可。^40,41使用相同的原理，新冠肺炎疫苗开发了一种为中东呼吸综合征冠状病毒开发的结构导向方法，⁴根据杰森·麦克勒朗之前对冠状病毒的研究，通过添加两个脯氨酸，将刺突抗原锁定在融合前状态。⁴⁴

基于结构的稳定突变导致了HIV包膜(Env)的发展，该包膜能够结合一些最有效和最广泛的中和抗体。Rogier Sanders，约翰·摩亚和他的同事设计了BG505 SOSIP.664，用二硫键连接了HIV Env抗原的两个亚单位gp120和gp41，并用I559P取代稳定了蛋白质，将抗原锁定在融合前状态。^45,46,47第一次，在兔和猕猴中用BG505 SOSIP.664加佐剂免疫导致诱导显著的自体中和抗体应答。然而，这些抗体对其他HIV毒株仍表现出最小的中和广度。在一些慢性感染HIV和由于突变而相继出现多种HIV变异的人群中，广泛中和抗体(bnab)的发展提高了这样一种可能性，即模拟这种相继暴露于不同Env蛋白的疫苗接种策略可能有助于“引导”B细胞对产生bnab的克隆的发展作出反应。这种方法包括用免疫原引发，所述免疫原可以结合在初始的抗原特异性B细胞上表达的B细胞受体(所谓的“种系靶向”)，随后用一系列免疫原进行加强免疫，每种免疫原与前一种稍有不同，其“引导”B细胞克隆沿着发育途径发育，最终产生产生bNAb的B细胞。⁴⁸例如，Bill Schief设计了一种最小的CD4结合位点抗原eOD-GT8，这是一些最有效和最广泛的bNAbs(如VRC01)靶向的区域。⁴⁹在1期研究中，eOD-GT8能够触发VRC01家族的原始种系前体B细胞，该细胞可以在转基因种系BCR表达小鼠的进化途径上进化到连续的步骤。⁵⁰类似的基于结构的种系靶向抗原方法也正在针对流感等其他病原体进行开发，目标是开发一种“通用流感疫苗”。⁵¹然而，与人工智能(AI)的爆炸相关联，结构导向疫苗设计和种系靶向的创新步伐大幅加快。人工智能驱动的蛋白质折叠预测现在能够预测几乎任何肽/蛋白质的结构，能够快速整合稳定突变，工程形状免疫优势，以及能够选择移植蛋白质设计的最小区域。^52,53

唐·吉布森(Don Gibson)和克雷格·文特尔(Craig Venter)在2010年开创了轻松制造合成基因的能力，⁵⁴使得直接从基因组序列合成疫苗成为可能，而不需要接触病原体。第一个例子是在2013年，中国疾病控制中心(CDC)在互联网上发布了一种新的H7N9禽流感病毒的序列。^55,56,57这种病毒已经导致中国三人死亡，并且具有疫情病毒株的所有特征。⁵⁸当许多小组试图获得这种病毒来制造常规疫苗时，圣地亚哥的Craig Venter的小组第二天就下载了序列，并在一天之内合成了血凝素(HAI)和神经氨酸酶基因，然后连夜运往诺华。这些基因被用来制造两种疫苗:(1)一种常规的亚单位疫苗，通过反向遗传学生产，然后在卵和细胞培养物中进行病毒生长⁵⁵和(RNA疫苗⁵⁶ (图1)。mRNA疫苗和用于生产常规疫苗的重组流感毒株在序列可用后1周内就准备好了，而在病毒可用于常规疫苗开发前几个月就准备好了。这种亚单位疫苗是第一种来自合成生物学的疫苗，在临床试验中获得成功。⁵⁹

然而，直到又过了7年，我们才看到合成疫苗彻底改变了现代疫苗学。2020年1月10日，中国疾控中心在互联网上发布了新型冠状病毒病毒的基因组序列。第二天，全球350多个实验室能够下载该序列，并开始生成S抗原的合成基因。合成基因被用来制造完全合成的mRNA疫苗⁴⁴；构建重组病毒载体(主要是非复制型腺病毒)^60,61,62；或者构建重组哺乳动物，⁶³昆虫或植物细胞来表达S蛋白。^64,65所有的方法都很有效，但是mRNA获得紧急使用授权的速度最快，距离序列可用仅11个月。⁶⁶病毒载体其次获得许可，而重组蛋白由于需要发酵和纯化过程以及添加佐剂而变慢。尽管蛋白质生产有所延迟，但蛋白质工程的技术进步，特别是纳米颗粒设计的技术进步，导致了强大、持久和广泛的免疫原性的诱导，标志着使用新的蛋白质设计策略优化免疫的机会。^67,68,69,70

然而，合成疫苗的力量超越了感染目标，因为反向疫苗学、基因测序和合成疫苗设计的革命已经改变了癌症疫苗领域⁷¹并有望冲击耐受性疫苗领域。⁷²在肿瘤学背景下，癌症中专有免疫原性新抗原的发现导致了测序算法的发展，该算法定位为与健康参考组织基因组相比，快速定义测序肿瘤中独特的专有基因组突变(新抗原),以构建个性化的癌症疫苗。⁷³新抗原序列用于设计一系列新表位，在个性化合成疫苗中发现，这些疫苗已开始显示出在胰腺癌治疗中的重要前景⁷¹和黑色素瘤。^74,75,76

历史上，候选疫苗的成功是通过一系列漫长的临床前研究和临床试验来评估的，以衡量疫苗对症状性疾病、严重疾病或感染的安全性和有效性。通常，疫苗开发管道包括在动物模型中对候选疫苗进行临床前测试，随后是评估安全性的1期临床研究，随后是评估疫苗免疫原性的2期研究，随后是通常涉及数万受试者的3期功效研究，以最终确定疫苗针对症状性感染的功效。⁸⁰3期试验所涉及的高成本和时间对快速评估许多有希望的候选疫苗刺激有效免疫反应的能力构成了主要障碍。评估疫苗效力的另一个途径是所谓的受控人类感染模型(CHIM ),在该模型中，接受疫苗或安慰剂的健康人类志愿者被有意暴露于受控环境中的病原体。已经为几种感染建立了这样的CHIMs，包括疟疾、流感、伤寒、霍乱、百日咳、志贺氏菌和新冠肺炎。^{81,82,83,84,85,86,87,88}值得注意的是，口服霍乱活疫苗Vaxchora是美国食品药品管理局(FDA)根据CHIM研究批准的第一种疫苗。⁸⁹

对于许多疫苗来说，疫苗接种引起的抗原特异性抗体的数量被用作免疫学终点，标志着“保护相关性”,被假设为疫苗效力的替代物。⁹⁰有限数量的疫苗仅在保护相关性方面获得许可，仅在由于病原体传播有限而无法进行效力试验的疫苗设置中。因此，对于大多数病原体而言，需要进行疗效试验，这在很大程度上与免疫相关终点的真实预测影响的压倒性监管不确定性有关。

保护相关性通常在接种疫苗后几周测量，并且代表与那些死于感染/疾病的个体相比，在受保护的个体中富集的免疫学生物标记。⁹¹传统上，相关物被用于针对同一病原体的有希望的新疫苗候选物的监管批准，或者用于在先前没有评估的人群中延长同一疫苗的监管批准。⁹²病原体特异性抗体的测量已被用作几乎所有临床批准疫苗的保护相关性，最近的例子是减毒活基孔肯雅疫苗。⁹³具体而言，病原体特异性抗体滴度已被用于量化针对病毒和细菌病原体的保护水平，中和抗体滴度已被用于量化针对病毒或细菌毒素的免疫，调理吞噬细胞抗体滴度已被用于鉴定抗菌活性。⁹⁰能够引发与这些免疫相关性相当或更高水平的疫苗被认为已经达到了保护性免疫的特征。这些测试已经变得非常标准化，并且执行起来相对简单。对于每种病原体，在临床前开发期间建立特异性抗体测量，以定义具有最高预测值的生物标志物。

尽管广泛使用抗体滴度作为许多疫苗保护的相关因素，但对抗体的关注掩盖了免疫系统的复杂性，免疫系统已经进化出多种防御机制，包括T细胞和先天免疫来抵抗病原体。因此，在某些情况下，保护性免疫与抗体反应无关。例如，对于水痘病毒疫苗接种，水痘特异性T细胞已被证明是防止水痘病毒再激活的最佳指标，并被认为是儿童和老年人保护的潜在相关因素。^94,95,96类似地，尽管通常使用1/40的HAI抗体滴度作为保护的关联，但是免疫的额外标志，包括高强度的病毒特异性流感特异性T细胞反应^97,98,99和抗体依赖性细胞毒性，^100,101,102与突破性疾病的减少相关，无论接种后抗体滴度如何。同样，对于新冠肺炎疫苗，针对中和抗性病毒的持久保护能够引起全球传播浪潮，这可能是由疫苗诱导的T细胞免疫反应赋予的，^103,104先天免疫，或替代抗体功能。¹⁰⁵因此，确定与疾病保护相关的精确免疫机制可以为设计更有效的下一代疫苗或指导加强活动提供非常有价值的见解。

对于许多复杂的病原体，如艾滋病毒、疟疾和结核病，传统的抗体测量无法在疫苗设计中提供预测价值，保护性免疫的相关性也没有得到很好的定义。^106,107,108例如，在早期的HIV疫苗试验中，甚至在异常高的HIV Env结合滴度下也会发生感染。^106,109相反，三十年的后续研究表明，bNAbs，而不是结合抗体或类型特异性中和抗体，对抵御这种快速进化的病原体至关重要。类似地，如上所述，对于RSV，针对稳定形式的F蛋白的中和抗体滴度，而不是针对未折叠的F蛋白的总抗体，是开发保护性RSV疫苗的关键免疫决定因素。⁴³然而，有趣的是，在新冠肺炎疫苗接种后，与中和抗体相比，结合抗体滴度被证明对预防疾病同样具有预测性。¹¹⁰

与艾滋病毒疫苗失败类似，能够诱导强烈抗体反应的疫苗只能提供部分抗结核保护¹⁰⁷和疟疾。¹⁰⁸许多候选疫苗对这种复杂病原体的失败强调了我们对有助于控制或清除人类感染的保护性免疫机制范围的不完全了解。对于这些感染中的许多，T细胞和B细胞反应以及先天反应，特别是在器官中的局部反应，都与控制和清除有关。^111,112因此，可能有必要放弃为抗体滴度开发的简单线性功能信号模型。事实上，以前旨在确定与保护相关的抗体阈值的策略可能不太可能有助于解释对这些复杂病原体的保护。相反,“保护的相关因素”可能更合适，在这种情况下，多种免疫机制的平衡可能协调互补地有助于病原体的识别、控制和清除。例如，当满足两个条件时，可以实现针对病原体的保护:(CD8组织驻留记忆(TRM)细胞的频率满足给定的阈值，和(2)中和抗体滴度的大小达到某个阈值。此外，这些免疫反应可能会在不同族群间互相补偿，因此疫苗可以诱导较高数量的T细胞¹¹³或抗原依赖性细胞毒性(ADCC)¹¹⁴可能需要较低阈值的中和抗体来提供持久的抗感染保护。

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图3. 系统免疫学工具包

这幅漫画描绘了过去几十年中出现的新技术，这些技术是疫苗学和免疫评估革命的关键。

人类免疫系统由几十个特化细胞亚群组成的复杂网络组成，这些细胞亚群广泛分布于全身各种器官中。疫苗接种导致一系列复杂的事件，涉及多个器官中多种细胞类型的协调作用，如果成功，可导致免疫反应的产生，从而针对给定病原体提供保护和免疫记忆。在人类基因组计划之后，高通量“组学”技术的出现，如RNA测序(RNA-seq)、高分辨率质谱蛋白质组学/代谢组学、CyTOF质谱血细胞计数器(CyTOF)、表观基因组图谱、单细胞RNA-seq和测序可转座染色质分析(ATAC-seq)和全基因组CRISPR筛选，以及人工智能的惊人进展，为破译人类免疫接种反应的复杂性提供了一种强有力的方法^116,117 (图3)。

使用系统生物学工具定义预测对疫苗接种的免疫反应的早期分子标记的这种方法的第一个概念证明来自对黄热病YF-17D减毒活疫苗免疫原性的免疫学预测因子的系统生物学分析，¹¹⁸这是迄今为止最有效的疫苗之一。该疫苗已在全球范围内为超过6亿人接种，有效率超过95%。通过分析血液中的转录、细胞和细胞因子反应，全面分析健康成人对YF-17D疫苗接种的免疫反应，并确定疫苗接种几天内诱导的与抗原特异性CD8相关的分子相关性⁺T细胞反应和中和抗体反应。^118,119在两项独立的研究中，YF-17D疫苗在接种后几天内诱导了强烈的1型干扰素(IFN)抗病毒信号。此外，机器学习工具能够预测抗原特异性CD8⁺独立盲法试验中T细胞和中和抗体反应的准确率超过90%。¹¹⁸这些研究为将基于系统的分析用于其他疫苗铺平了道路，包括针对流感、脑膜炎球菌感染、带状疱疹、疟疾和新型冠状病毒的疫苗。^{115,120,121,122}类似地，最近的一项研究整合了来自13种疫苗的28项研究的820名成人的3000多份样本的转录数据，并分析了疫苗接种诱导的抗体反应的特征。分析显示，指向强有力的成浆细胞反应的转录信号与所有疫苗的抗体反应的大小相关并可预测抗体反应的大小。¹²⁰因此，系统生物学方法不仅可以定义单个疫苗后的免疫原性生物标志物，还可以识别预测跨疫苗类型和平台的疫苗反应的共同免疫生物标志物。

系统生物学工具的使用也揭示了防止感染的新的相关因素。比如卡兹明等人。¹²¹分析了接种了三次连续剂量的AS01b佐剂RTS，S疟疾疫苗的人的免疫应答，或在用表达环子孢子蛋白(CSP)的腺病毒35 (Ad35)载体初次免疫后接受两次RTS，S/AS01b免疫的人的免疫应答，随后通过暴露于疟原虫-受感染的蚊子，最后一次免疫接种后3周。两种疫苗都产生了50%的保护作用，但是保护作用的相关性是不同的。对于RTS，S-only方案，CSP-特异性抗体滴度的大小与保护作用相关，与此一致，最后一次疫苗接种后7天的成浆细胞应答的血液转录信号与抗体滴度和保护作用相关。然而，在接受Ad35-CSP初次免疫的组中，抗体反应较低并且与保护无关。相反，它是多功能CD4的频率⁺与保护相关的T细胞，先天免疫的早期信号和树突细胞(DC)激活与保护高度相关。这项研究强调了在CHMI研究中使用基于系统的方法来定义相关因素的效用，并证明了针对恶性疟可以通过多种机制实现。

在上述使用RTS，S疫苗的CHIM研究中，深入的抗体谱显示了ADCC和嗜中性粒细胞调理吞噬细胞CSP特异性抗体在预防疟疾感染中的关键作用¹¹⁴横跨两臂，突出了体液免疫反应的定性而非定量特征。同样，在一项非人类灵长类动物的研究中，静脉注射卡介苗疫苗，产生了近乎灭菌的保护作用结核分枝杆菌(Mtb)，具有深度抗体谱的系统免疫学谱揭示了CD4辅助T细胞、补体固定抗体和自然杀伤(NK)细胞之间的关键协调，^123,124为控制肺部细菌相关的保护信号提供了意想不到的见解。总之，这些研究强调了在CHIM和灵长类动物挑战研究中使用基于系统的方法来定义保护相关性的效用。

此外，深度抗体谱的使用揭示了针对许多病原体的保护中意想不到的抗体效应机制。^{114,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134}具体来说，深入的功能性体液分析揭示了调理吞噬细胞抗体在灵长类动物中通过两种不同的免疫途径和两种不同的疫苗平台抵抗HIV类似物猴免疫缺陷病毒(SIV)的关键作用。¹²⁵这些数据表明，除了bNAbs之外，抗体促进吞噬作用的能力可以导致病毒颗粒的快速清除。类似地，深度抗体谱表明单核细胞调理吞噬作用在对抗RSV中的重要作用¹²⁹以及嗜中性粒细胞调理吞噬作用和补体激活作用，用于对抗埃博拉病毒。¹²⁸

系统免疫学概况也为免疫系统调节疫苗以引发保护性免疫反应的机制提供了重要的见解。例如，他们揭示了人类宿主微生物群在形成疫苗诱导免疫中的作用的第一个因果证据，^135,136胆固醇代谢在形成疫苗反应中的关键作用，^137,138和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)之间的氨基酸感应通路¹³⁹和疫苗反应的强度。此外，最近的研究揭示了佐剂通过先天免疫的表观遗传印记诱导广泛抗病毒防御的新机制，这一发现导致了“表观遗传佐剂”的概念¹⁴⁰目前正在对此进行评估。这些研究共同为疫苗设计提供了关键线索，以克服抑制免疫的潜在途径，包括替代疫苗平台或佐剂。

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图4. 疫苗学面临的普遍挑战

该图显示了疫苗设计的主要未来挑战。在提高持久性、增强细胞毒性T细胞、规划组织常驻免疫、快速开发疫苗以及围绕高度预测性机械生物标志物开发监管策略方面取得的进展表明，有望彻底变革传染病及其他疾病的疫苗开发。

Slifka及其同事的一项开创性研究表明，在美国成年人群中，许多病毒感染如麻疹、腮腺炎和水痘诱导的中和抗体滴度非常稳定，估计半衰期从水痘-带状疱疹病毒(水痘)的50年到牛痘的92年到超过500年和3000年。¹⁷²与此相一致，活病毒疫苗诱导的抗体反应可以持续一生。与对病毒和活病毒疫苗的高度持久的抗体反应相反，对破伤风和白喉抗原的抗体反应减弱得更快，估计半衰期为11年和19年。此外，在灭活的亚单位疫苗中，例如针对季节性流感的亚单位疫苗，百日咳博德特氏菌, 肠道沙门氏菌血清型伤寒，还有脑膜炎奈瑟菌，以及针对艾滋病毒和疟疾的候选疫苗。对疫苗免疫反应持久性数据的解释需要注意的是，亚临床暴露于地方性病原体可能会增强免疫反应并导致持久性增强。然而，在牛痘疫苗接种的情况下，估计可能是准确的，因为天花已于1980年根除，而且在美国，没有已知感染人类的地方性正痘病毒。

最近对新冠肺炎mRNA疫苗的研究表明，初次免疫后，在最初的6-12个月内，对原始WA.1毒株的结合或中和抗体反应的持久性下降了10倍，衰减率约为56天^{173,174,175,176,177}。第三次或第四次加强免疫后，抗体滴度增加，但体液免疫反应的持久性仅适度改善，半衰期约为76天。^177,178然而，峰值中和活性低于主要关注的病毒变体(VOCs)，针对Omicron BA.2.75.2、BQ.1.1和XBB.1.5的中和抗体滴度显著下降(相对于WA.1毒株，滴度分别下降48倍、71倍和66倍)，反应下降至低于检测限6个月。¹⁷⁷这些数据强调了两个关键点:(1) mRNA疫苗诱导的免疫反应从免疫原性峰值开始衰减，以及(2)这些疫苗不能诱导与类型特异性反应水平相同的bNAbs。相反，随着时间的推移，疫苗诱导的T细胞和记忆B细胞免疫反应非常稳定。¹⁷⁹然而，逃避中和抗体反应的挥发性有机化合物的频繁出现，加上抗体滴度的下降，使得定期加强免疫成为必要。然而，鉴于加强免疫仅提供短暂的传播阻断活性窗口，并且事实上，即使针对中和抗性变异体，针对严重性和死亡的保护也持续存在，^180,181推荐对脆弱人群进行常规加强免疫，这些人群可能没有能够快速控制和清除病原体的强有力的既往反应。¹⁸²

两个主要的注意事项模糊了对新冠肺炎疫苗接种后保护性免疫持久性数据的解释:(1)几乎所有的研究都只估计了疫苗接种后第一个6-12个月内的抗体应答半衰期，在此期间，大多数疫苗的抗体滴度会迅速下降，随后的几个月和几年内滴度会保持更稳定的水平。因此，缺乏Slifka研究中获得的长期抗体滴度数据，¹⁷²以及缺乏任何加强免疫，对评估由新冠肺炎mRNA疫苗诱导的免疫反应的真正长期持久性提出了挑战。(2)假设对新冠肺炎的保护仅由中和抗体介导。在这种情况下，接种疫苗后，对严重疾病和死亡的保护作用持续存在，甚至对中和抗性挥发性有机化合物也是如此，这表明疫苗诱导的免疫反应，而不是血清中和抗体滴度，提供了保护作用。提出了几种替代的相关性，包括交叉反应性T细胞应答，¹⁸³持久性抗VOC调理吞噬抗体，^105,184,185或者能够补充VOC特异性中和抗体反应的快速发展的记忆性体液免疫反应。^186,187因此，虽然中和抗体可能在免疫接种后很快减弱，但了解减弱的细胞免疫和抗体的Fc介导功能是充分了解针对新冠肺炎的免疫保护的持久性的关键。

虽然我们目前的新冠肺炎疫苗的最终目标是减少疾病，但未来的新冠肺炎疫苗和针对呼吸道病原体的疫苗的最终目标将是防止传播。^{110,188,189,190}然而，阻断传播需要产生大量的抗体，特别是在上呼吸道的传播部位。对维持抗体滴度的免疫学机制的理解仍处于初级阶段。小鼠和人类的实验表明，骨髓中长寿命的抗体分泌浆细胞(LLPCs)在维持抗体滴度方面起着关键作用。^172,186,191因此，学习如何设计能够有效刺激LLPCs产生的疫苗是疫苗学的一个主要挑战。活病毒疫苗黄热病疫苗YF-17D诱导显著持久的抗体应答，这与在不同的DC亚群上触发多个TLR相关，这一事实提高了与灭活疫苗一起给予的佐剂可诱导这种强烈持久的抗体应答的可能性。¹⁹²含有TLR4和TLR7/TLR8配体的合成聚乳酸羟基乙酸(PLGA)纳米颗粒与可溶性抗原一起给药，在小鼠中诱导了强烈和持久的抗体反应、生发中心反应、滤泡th细胞反应和LLPCs¹⁹²在非人类的灵长类动物中。¹⁶⁵此外，由TLR配体的组合诱导的抗体反应在小鼠中持续终生，并且需要多个DC亚群的活化和B细胞的直接活化。类似地，将3M-052包封到PLGA纳米颗粒中诱导了非常高的量级和持久的长期骨髓浆细胞反应，该反应持续超过一年，¹⁶⁵目前正在进行临床试验，以确定佐剂是否会影响持久性。按照这些思路，经历了一些衰退的新冠肺炎mRNA疫苗不触发TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7或炎症小体激活，也不触发坏死性凋亡或焦凋亡细胞死亡途径。¹⁹³添加激活先天反应的佐剂是否能增强免疫反应的持久性目前尚不清楚。

除了佐剂之外，最近的数据表明抗原释放的动力学在形成抗体反应的持久性方面起着关键作用。^194,195最近的研究表明，释放抗原和/或佐剂的递送系统在活生物体内具有延迟释放动力学，例如渗透泵或缓释凝胶，可以增强抗体反应的强度和持久性。¹⁹⁴虽然认为抗原释放的延迟动力学是这种增强和持续的抗体反应的决定因素，但也有可能先天免疫细胞的持续活化也有助于更强、更长寿命的生发中心(GCs ),最终导致维持抗体反应的更高PC的产生。

尽管大多数针对感染的疫苗接种策略集中于诱导中和抗体反应，但越来越多的证据支持CD8诱导的细胞免疫的关键作用⁺T细胞在抗病毒免疫中对感染如HIV、^113,196疟疾，¹⁹⁷流感，^97,198新冠肺炎，^199,200和癌症⁷¹ (图4)。抗原特异性CD8⁺T细胞可以杀死病毒感染的细胞，减少病毒负荷，清除感染的细胞，并可能改善疾病症状。然而，尽管在小鼠中，活病毒疫苗或佐剂疫苗可以诱导有效的CD8⁺T细胞反应，在人类中，只有活病毒疫苗可以诱导高强度抗原特异性效应物CD8⁺T细胞反应和记忆CD8⁺T细胞反应。²⁰¹基于蛋白质的疫苗大量诱导CD4⁺T细胞反应，²⁰²mRNA疫苗也诱导CD8⁺人类的T细胞免疫，^176,179尽管比用活病毒疫苗观察到的量级小。²⁰¹病毒载体诱导细胞毒性CD8免疫的倾向与最初的病毒抗原载量有关²⁰³和先天信号。例如，小鼠实验表明，YF-17D诱导抗原特异性CD8⁺T细胞通过多种TLR以MyD88依赖的方式产生反应，表明靶向特定TLR的佐剂有可能引发CD8⁺人类的T细胞反应。¹¹⁸与此一致，在小鼠中，显著的CD8⁺TLR佐剂亚单位疫苗可诱导T细胞反应。²⁰⁴类似地，通过C-型凝集素受体(CLR) DEC205将抗原递送至特定的树突状细胞(经典的1型树突状细胞(cDC1s ))也显示出促进抗原向CD8的交叉呈递⁺T细胞。²⁰⁵然而，在人类和非人灵长类动物中，亚单位疫苗，即使与有效的佐剂一起递送，也不会诱导大量的CD8⁺与用活病毒疫苗观察到的反应相当的T细胞反应。²⁰²因此，学会诱导大量的抗原特异性CD8⁺人类的T细胞反应仍然是疫苗学的一个主要挑战，这可以通过更深入地了解启动时释放这些有效效应机制所需的先天信号来克服。

最近的工作强调了TRMs的关键作用，TRMs在组织内长期存在，并提供对抗病原体的前线前哨功能²⁰⁶ (图4)。当病原体进入粘膜部位时，抗原特异性TRMs被迅速激活，并在局部微环境中协调浆细胞的募集和先天反应的激活。我们最近在非人灵长类动物中的研究表明，诱导高水平的gag特异性CD8⁺与单独用有佐剂的HIV Env免疫所提供的保护相比，通过异源病毒载体方案接种TRMs，与有佐剂的HIV Env蛋白协同，导致针对粘膜猿猴-人类免疫缺陷病毒(SHIV)攻击的增强且更持久的保护。¹¹³引人注目的是，在仅用有佐剂的HIV Env免疫的动物组中，300的中和抗体滴度与保护相关，但是在异源载体加Env组中，与保护相关的中和抗体的阈值低得多。使用粘膜组织中的单细胞转录组学，证明了原地的用gag激活TRM导致了组织中先天反应的增强，如粘膜先天细胞和CD4中的一组抗病毒限制因子所证明的⁺T细胞。这些结果表明CD8⁺由异源病毒载体(HVV)免疫方案诱导的TRMs在介导针对SHIV感染的保护中与抗体应答和先天应答协同作用。¹¹³与这些结果和最近在猕猴中预防新型冠状病毒感染或接种疫苗的研究一致，CD8⁺如果中和抗体反应不是最佳的，T细胞反应也可能起作用。因此，未来的疫苗接种策略应旨在利用抗体、TRM和先天反应在介导抗感染保护中的协同作用。沿着这些思路，最近的工作表明，在小鼠静脉注射卡介苗疫苗后，持续的抗原特异性CD4⁺肺中的Th1反应持续至少3个月，刺激持久的抗病毒先天反应，从而提供针对新型冠状病毒及其变体、流感、SARS和相关冠状病毒的广泛保护。^207,208,209这些结果强调了利用适应性和先天免疫系统的综合相互作用的重要性，称为“综合器官免疫”²¹⁰开发新的疫苗，在粘膜组织中介导保护性免疫。

200年的疫苗开发经验已经建立了监管预期和流程，包括明确的安全协议、疗效终点和免疫相关性。然而，免疫学工具的快速发展和我们对协同促进保护的多种免疫机制的日益了解正在挑战历史教条，并为使疫苗更有效提供了新的见解。从历史上看，大多数疫苗的许可都是基于大型3期疗效试验。然而，大型3期试验的高成本和时间框架对快速评估有前景的候选疫苗构成了主要障碍。此外，几十年来，监管机构一直依赖于抗体滴度的评估作为保护的推定相关性，在某些情况下实现了免疫桥接。²¹¹然而，最近，动物挑战模型中的保护，与安全性和对人类的免疫桥接相关联，使得基孔肯雅疫苗能够获得许可。²¹²然而，如上所述，抗体反应仅代表对病原体的保护性免疫反应的一个方面。系统免疫学方法已经对保护性免疫中涉及的多种机制产生了深刻的见解，并确定了疫苗接种后早期诱导的分子标记，这些标记可以预测随后的免疫反应。因此，该领域的一个主要挑战是如何将这些方法整合到监管框架中以加速疫苗开发(图4)。尽管很难建立新的检测方法来探测细胞免疫功能，但新的样品收集工具和高通量免疫检测方法的出现为疫苗设计、开发和免疫潜在机制相关的许可提供了一条途径。然而，机械关联的发展是这个过程成功的关键。同样重要的是应用这种方法来定义“基线”(即接种疫苗前)的生物标志物或信号，这可以预测不良反应。

虽然疫苗开发通常需要10年或更长时间，但抗击流行病需要非常快速的反应。在新冠肺炎疫情的情况下，mRNA和病毒载体等新技术的出现，加上公共部门的超高速投资，导致临床试验的平行进行，使得在仅11个月的前所未有的时间内紧急发放疫苗许可成为可能。然而，到那时，7900万人已经被感染，170万人已经死于新冠肺炎。²¹³显然，疫苗的发展还不够快。为了进一步加速疫苗开发(图4)，研究现在集中于开发原型疫苗，这可能允许在短短100天内开发疫苗。这种方法已被NIH、CEPI、G7和G20所接受，建议深入研究为一个成员开发疫苗(原型)²¹⁴以积累开发针对该病毒家族的疫苗所必需的基础知识。这包括识别保护性抗原及其保护性表位，即制造稳定有效疫苗所必需的基于结构的设计。至关重要的是，这还涉及到对保护性免疫的性质和疫苗接种后早期诱导的分子标记的描述的更深入的理解，这些分子标记可用于预测1期和2期临床研究中的安全性和免疫原性，以及许可的监管要求。我们的目标是利用为原型疫苗积累的基础知识，在100天内开发出针对同种病毒的疫苗。