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Induction of broadly neutralizing HIV antibodies by a two-step mechanism informs vaccine design
作者
作者单位
- 美国宾夕法尼亚州费城，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院医学系与微生物学系
- 美国加利福尼亚州帕萨迪纳，加州理工大学生物与生物工程学部
- 美国宾夕法尼亚州费城，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院宾夕法尼亚 RNA 创新研究所
- 英国南安普顿，南安普顿大学生物科学学院
- 美国北卡罗来纳州达勒姆，杜克大学医学院杜克人类疫苗研究所与医学系
- 美国加利福尼亚州拉霍亚，斯克里普斯研究所免疫与微生物学系
- 美国马里兰州罗克维尔，生物质量公司
- 美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院国家过敏与传染病研究所分子微生物学实验室
- 美国纽约，洛克菲勒大学分子免疫学实验室
- 美国纽约，霍华德休斯医学研究所、洛克菲勒大学
- 美国马萨诸塞州波士顿，贝斯以色列女执事医疗中心病毒学与疫苗研究中心
- 美国马里兰州切维蔡斯，霍华德休斯医学研究所
- 美国新墨西哥州洛斯阿拉莫斯，洛斯阿拉莫斯国家实验室
- 美国新墨西哥州洛斯阿拉莫斯，新墨西哥联盟
†同等贡献作者
摘要
正文
引言
将 HIV-1 广谱中和抗体预防性输注至未感染恒河猴，可稳定保护动物免受人猴嵌合免疫缺陷病毒（SHIV）攻毒（1–3）。人体试验中，广谱中和抗体 VRC01 可抵御敏感 HIV 毒株感染（4,5）；若用于已感染患者的治疗，能够降低血浆病毒载量、延缓抗逆转录病毒停药后的病毒反弹，少数案例可实现功能性治愈（6–10）。上述研究推动学界大力研发可诱导内源性广谱中和抗体的疫苗，尽管已有阶段性进展，但尚未实现血浆中稳定产生达到临床保护滴度的广谱中和抗体。
目前研究的主要瓶颈是缺少标准化远交动物模型，无法稳定诱导强效广谱中和抗体并解析其发育通路。若建立该模型，既能作为迭代式疫苗设计的分子蓝本，也可作为疫苗效力评价基准。
现有诱导 V3 聚糖广谱中和抗体的主流策略为反向疫苗学：推导成熟广谱中和抗体的未突变共同祖先（UCA）序列，并以此为模板设计可特异性结合该胚系前体的免疫原（17,22）。但该谱系导向型策略存在局限：目前高置信度 V3 聚糖广谱中和抗体未突变共同祖先的推导数据十分匮乏，研究多采用推导胚系序列（iGL）替代；而推导胚系序列通常保留成熟抗体大部分重链第三互补决定区（CDRH3）序列。V3 聚糖抗体主要依靠 CDRH3 与抗原结合，该缺陷会大幅降低免疫原靶向效率（12–15）。此外，单一针对某一种未突变共同祖先优化亲和力的免疫原，无法保证与其他靶向同一表位的广谱中和前体产生交叉结合。
尽管存在上述缺陷，针对人源 PGT121、DH270、BG18 三类 V3 聚糖广谱中和抗体前体设计的免疫原已取得突破（23–26,27–28,29–31）。免疫球蛋白敲入小鼠模型的序贯免疫实验证实，该策略可在体内激活并扩增对应抗体谱系（24,27,31）；但在远交动物体内，仍无法稳定诱导达到保护性血浆滴度的 V3 聚糖广谱中和抗体（26,30）。
本研究将加强免疫所用重组蛋白 5MUT 替换为携带对应包膜的活感染型 SHIV 毒株。我们推测：SHIV.5MUT 可持续复制、体内抗原载量高，可与体液免疫应答同步共进化，作为 “动态演化免疫原”，可更高效地放大 RC1/11MUTB 初次免疫激活的抗体应答，推动其成熟。
结果
SHIV.5MUT 感染恒河猴可稳定产生血浆广谱中和活性
实验将恒河猴分为 4 组：1 组使用 RC1、11MUTB 蛋白纳米颗粒序贯免疫（n=8）；2 组使用编码稳定膜锚定包膜三聚体的 mRNA 脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）序贯免疫（n=8）；初次免疫 8 周后，1、2 组全部动物感染 SHIV.5MUT；3 组未免疫直接感染 SHIV.5MUT（n=12）；4 组未免疫、感染野生型 SHIV.BG505.N332 作为空白对照（n=14）（图 1A、补充数据 S1）。免疫原详细设计方案见补充文本、附图 S1A、S1B。
初次免疫 RC1 后 8 周，所有免疫动物均产生强效同源中和血浆应答；蛋白免疫组平均抗体滴度高于 mRNA 免疫组。11MUTB 加强免疫后滴度进一步提升，蛋白免疫组剂量递增亚组滴度高于单次大剂量亚组（附图 S1C）。完成全程免疫后，动物血浆无法中和携带 5MUT、BG505 包膜的假病毒，证明体液免疫被精准聚焦至 RC1/11MUTB 缺失聚糖的 V1V3 区域（附图 S1C）。以 11MUTB 为骨架进行丙氨酸扫描突变实验，发现中和应答主要靶向 gp120 N137、L139 残基（附图 S1D）。
感染前 12 周，所有 SHIV.5MUT 感染组动物均产生强效同源中和抗体，滴度随时间上升，20 周达到平台期并维持至少 48 周；SHIV.BG505 感染动物同源中和滴度整体更低（图 1C）。感染 20 周后，无论是否接受前期疫苗，SHIV.5MUT 感染动物血浆均检测到异源中和活性（补充数据 S2）。
整体统计：22 只 SHIV.5MUT 感染恒河猴中 14 只产生广谱中和抗体（定义：感染 48 周内可中和 8 株异源假病毒中至少 3 株）；其中 8 只可中和至少 6 株，半数 50% 抑制滴度（ID₅₀）常高于 1:1000，几何平均 ID₅₀滴度为 1:507（图 1D）。全部广谱中和应答均靶向 V3 聚糖表位（图 1E）。对照组 14 只 SHIV.BG505 感染动物 48 周内无一产生血浆广谱中和（费希尔精确检验，p<0.0001）（图 1D、补充数据 S3）。
是否接受 RC1/11MUTB 疫苗不影响 SHIV.5MUT 感染后广谱中和抗体产生概率，证明广谱中和谱系由 SHIV.5MUT 及其演化突变株诱导，而非前期免疫原（图 1D）。产生广谱中和抗体的恒河猴血浆病毒载量、同源中和滴度均高于未产生个体，说明持续抗原刺激是诱导广谱中和抗体的关键条件（附图 S2A、S2B）。
分离获得免疫遗传多样化 V3 聚糖广谱中和抗体
选取血浆中和广谱性最强的 8 只恒河猴，分离包膜特异性 IgG 阳性外周血 B 细胞并完成抗体基因测序；扩增优势克隆序列构建重组单克隆抗体（mAb）并检测中和活性。本研究共筛选 106 个独立抗体谱系、238 株单克隆抗体，最终得到 12 条 V3 聚糖广谱中和抗体谱系（图 1F）。同时从中和活性最优动物骨髓分选浆细胞，额外鉴定出广谱中和克隆 AM12-BM5，该抗体可中和全部检测假病毒株（图 1F）。
SHIV.5MUT 诱导广谱中和抗体免疫遗传多样性丰富，主要使用 VH3、VH4 家族基因，该两类基因在人与恒河猴 B 细胞胚系库中占比最高（36,37）；不同于 V2 顶点、CD4 模拟型广谱中和抗体，该类抗体无需特定稀有免疫球蛋白等位基因（38–41）。CDRH3 长度分布区间宽（14–25 个氨基酸，中位数 20），处于人与恒河猴天然抗体正常范围（附图 S5B、42）。仅 AM12-352 谱系 CDRH2 存在独立插入突变，其余谱系无插入缺失（附图 S6）。重链核苷酸水平平均体细胞突变率仅 8.4%，低于既往报道的人源 V3 聚糖广谱中和抗体一半；提示该类前体激活后仅需少量突变即可获得强效广谱中和能力（图 1I）。
恒河猴 V3 聚糖广谱中和抗体结构特征
选取 7 个谱系共 10 株代表性广谱中和抗体，解析 Fab 片段与 5MUT 包膜三聚体复合物单颗粒冷冻电镜结构（图 2A、附图 S7、S8、补充数据 S6）。全部抗体均识别 V3 聚糖表位，结合 gp120 N332 聚糖，依靠重链酪氨酸残基与 ³²⁴GDIR₃₂₇多肽相互作用，作用模式与人源 V3 聚糖广谱中和抗体高度相似（图 2B、2C、附图 S8C、43）。人源 V3 聚糖抗体常通过 CDRH3 内带负电谷氨酸结合保守 R327 残基（如 10-1074 抗体 HC Glu100I）；SHIV.5MUT 诱导的 AJ09-83、AJ09-110 可复刻该相互作用（图 2B）。
VRC01 类广谱中和抗体存在保守结合模式，本研究仅 AJ09-83 与 V634-136 存在同源包膜相互作用（图 2E）：二者重链 Phe100C/Tyr100D 结合 N332 聚糖 N – 乙酰葡糖胺，重链 Tyr32/Tyr33 与 R327 侧链、I326 主链相互作用。上述芳香族氨基酸均由 D3-15*01 基因 2 号阅读框编码的 YYY 基序提供，二者相互作用位点相邻；参与结合的重链 CDRH1 酪氨酸来自不同 VH 基因片段。
恒河猴 AM12-352 与人源 PGT128 切入角度不同、CDRH3 氨基酸同源性仅 28.6%，但二者 CDRH3 均形成 LRY 保守基序，与 ³²⁴GDIR₃₂₇的空间相互作用几乎完全一致（图 2F）。AM12-35 谱系成熟路径复刻 PGT128：依靠 CDRH2 独立插入分化亚谱系，提升中和广谱性（45）。本谱系克隆依据 CDRH2 插入分为多个分支，代表克隆中和覆盖范围差异显著：AM12-BM5（68%）、AM12-352（50%）、AM12-340（32%）、AM12-347（9%）（补充数据 S5）。仅 AM12-BM5、AM12-352 携带相同 CDRH2 插入，可中和缺失 N332 的毒株，功能依赖 N301 聚糖（图 1H、补充数据 S5）。删除 CDRH2 插入序列后，三株抗体中和广谱与效价大幅下降；冷冻电镜显示三者 CDRH2 构象完全不同，与 N301 聚糖结合模式存在差异：AM12-352、AM12-340 的 CDRH2 呈弯曲状堆叠于聚糖表面，AM12-347 为直链贴合聚糖侧面（图 2I）。该特征与 PGT128 谱系对应：PGT128 依靠 CDRH2 插入增强 N33 聚糖结合，而无插入的 PGT130 更易识别 N334 聚糖毒株（45）。
尽管 SHIV.5MUT 诱导抗体胚系基因多样化，不同恒河猴来源 AM12-352、AJ09-83 轻链序列高度同源。结构叠加显示二者轻链均结合 N332 聚糖，但分别依靠 CDRL1 搭配 CDRL2（AM12-352）、CDRL3（AJ09-83）识别聚糖两侧（图 2J）。
恒河猴 V3 聚糖广谱中和抗体发育谱系
本研究在多个时间点采集免疫后引流淋巴结（1–2 组）、感染后外周血单核细胞（1–3 组）B 细胞受体；同时采集单次时间点初始 IgM⁺IgD⁺外周 B 细胞，使用 IgDiscover、SONAR 生物信息学流程，从 8 只恒河猴中推导 12 条高置信 V3 聚糖广谱中和抗体未突变共同祖先序列（图 3A、附图 S10）。
SHIV.5MUT 感染前，1、2 组免疫动物引流淋巴结与外周血中未检测到任何广谱中和谱系，证明 RC1、11MUTB 无法激活该类前体。感染 12–24 周后所有实验组均可检出早期谱系克隆，说明 SHIV.5MUT 可快速高效激活 V3 聚糖前体；该时间与血浆广谱中和首次检出（20–32 周）完全匹配（补充数据 S2）。
广谱中和抗体成熟速度快、体细胞突变率低，提示成熟通路简单。绝大多数与抗原接触的关键氨基酸残基由未突变共同祖先编码，而非体细胞高频突变产物（图 3A、3C）；非胚系编码的接触残基中半数为低概率突变，说明疫苗可轻松诱导该类氨基酸改变（48）。
为评估本研究成果向人体转化潜力，比对恒河猴未突变共同祖先重链、轻链与 orgdb 数据库中人源 VH/VK 等位基因氨基酸同源性。所有恒河抗体胚系片段均存在高度同源人源对应序列，重链平均同源性 90%、轻链 91%（图 3A、3D、附图 S10），包含经典人源 V3 聚糖抗体 IGHV4-34（PCDN-38A）、IGHV4-59（PGT121）胚系片段（14,17,34）。81 个抗原接触残基中 50 个与人源同源氨基酸理化性质相似、41 个完全一致；证明人体 B 细胞库可产生与恒河猴结构、成熟路径相似的 V3 聚糖广谱中和抗体。
V1 环包膜演化先于广谱中和抗体产生
血浆病毒半衰期约 1 小时，产病毒细胞存活约 1 天；循环病毒准种的基因构成可灵敏反映病毒适合度与中和抗体筛选压力（41,50–52）。本研究纵向采集血浆病毒 RNA 进行单基因组测序（SGS），完整解析 gp160 包膜全长序列，直观追踪全包膜区域抗体筛选突变（53,54）。
仅 SHIV.5MUT 感染动物发生 V1 快速筛选，证明 5MUT 特有的 4 处 V1 残基提升包膜免疫原性。BG505.N332 V1 环存在 N133、N137 潜在 N 糖基化位点（PNGS），构成聚糖屏障，抑制包膜免疫原性（55–58）；5MUT 虽保留两个糖基化位点，但 136 位脯氨酸会改变相邻 N133、N137 糖基化效率：脯氨酸紧邻糖基化位点可降低聚糖占位（30,59,60）。质谱位点聚糖分析证实：5MUT SOSIP 蛋白 N133 位点几乎无糖基修饰，N137 完全糖基化；将 BG505 引入 N136P 突变后，N133 聚糖占位大幅下降、N137 无变化（图 4E、4F、附图 S13、S14）。V1 糖基化降低提升 5MUT 免疫原性，诱导靶向 V1 的早期抗体，形成筛选压力。多数共享 V1 突变通过点突变或缺失删除 P136，恢复 N133 聚糖修饰，帮助病毒逃逸早期血浆中和应答（图 4B、附图 S12）。
SHIV.5MUT 通过两步通路诱导 V3 聚糖广谱中和抗体
为验证模型，使用携带各类 V1 突变的假病毒检测感染 12 周血浆中和活性；所有动物血浆对 del4、del8、P136T 突变株中和滴度显著下降，证明早期体液应答以 V1 靶向抗体为主（图 5B）。同时从两只恒河猴分离 V1 靶向单克隆抗体，复刻早期血浆中和特征（图 5B）。
V1 靶向抗体 NN39-25 与 5MUT 包膜复合物冷冻电镜结构显示，该抗体结合 ¹³⁴YTPNLTN 区域，该序列包含 5MUT 特有的 4 处突变，因 N133 低聚糖暴露而充分外露（图 5C、5D）。同一动物来源 V3 广谱中和抗体 NN39-171 结合位置完全偏移，主要识别 ³²⁴GDIR 与 N332 聚糖（附图 S15）。
体内证实 V1 靶向抗体筛选 V1 突变株后，进一步表征突变包膜结构。del4、del8 对广谱中和抗体敏感性显著提升（图 4C），推测表位可及性增强。融合前天然构象中 V1 环直接覆盖 V3 聚糖表位，截短 V1 可暴露保守 GDIR 基序（61,62）。无配体冷冻电镜结构显示：相较于 BG505、5MUT，del4、del8 V1 结构更小，V3 聚糖表位暴露面积更大（图 5E、补充数据 S6）。质谱证实 5MUT V1 聚糖缺失提升表位可及性；但冷冻电镜中 N133、N137 聚糖无序，无法完整观测该效应（附图 S16）。
识别可激活广谱中和前体的早期包膜突变株
测序、结构、中和功能数据共同证明 del4、del8 是体内激活多样化 V3 聚糖未突变共同祖先的核心包膜突变。本研究构建编码 5MUT、BG505、del3、del4、del8 的稳定 mRNA，转染 293F 细胞表达包膜三聚体，流式检测包膜与人、恒河猴未突变共同祖先结合能力（图 5F）。全部构建均可正常组装三聚体，四级表位靶向 V2 广谱中和抗体结合信号强，证明折叠完整。全长高糖基化 BG505、5MUT.P136S 无任何未突变共同祖先结合信号；原始低聚糖 RC1、11MUTB 仅结合 2–3 种前体；而同时截短 V1、缺失聚糖的 del3/del4/del8 可结合最多 8 种未突变共同祖先，结合强度显著高于传统免疫原（图 5F）。上述短 V1 包膜是体内激活 V3 聚糖前体的核心模板。
6 株广谱中和未突变共同祖先（含 AM12-352-UCA、AJ09-83-UCA）无法结合全部 V1 逃逸突变株；本研究基于纵向 B 细胞序列，构建谱系发育各阶段中间抗体。AJ09-83 早期前体 AJ09-83-iA1 可结合 del3，AM12-352 早期前体 AM12-352-iA2 结合 5MUT，结合强度随谱系成熟提升（附图 S18B）。尽管未突变共同祖先无明显结合，生发中心多价效应可放大微弱相互作用，达到生理结合水平。感染 4–12 周病毒准种包膜多样性有限，del4、del8 等短 V1 突变是激活全部 V3 聚糖广谱中和谱系的核心包膜变体。
包膜 – 抗体共进化指导免疫原设计
人体内 HIV-1 包膜与广谱中和抗体持续共进化：抗体谱系筛选病毒逃逸突变，突变包膜又进一步筛选获得异源中和能力的成熟抗体（18,63）。逃逸突变普遍存在于全球流行毒株，抗体谱系随持续突变逐步获得广谱中和活性。本研究使用 LASSIE 算法对比 SHIV.5MUT、SHIV.BG505 感染恒河猴的包膜筛选位点（64），共鉴定 78 个受选择位点，51 个在多只动物中重复出现，多数为 BG505 固有免疫显性区域逃逸突变（聚糖空洞、C3-V4-V5 区，附图 S19A、S19B）。
比对检测面板 8 株异源病毒与 5MUT 在 10 个关键位点的氨基酸差异，定义异源识别必需关键位点；332、359 位点在全部检测毒株中保守，无差异故不纳入分析。病毒准种必须在关键位点产生对应突变，抗体谱系才能识别该异源毒株。169 组配对分析中 164 组关键位点突变早于或同步于对应异源中和活性出现；准种突变常直接替换为异源毒株特征氨基酸，证明抗体适配该残基是广谱产生核心（附图 S20–S33）。产生广谱中和抗体的恒河猴准种，完整覆盖全球 M 组毒株在 10 个关键位点的氨基酸多样性，V3 聚糖区域多样性最丰富（图 6G）。V1h 长度延长、新增糖基化位点的突变同样先于异源中和检出；广谱阳性动物 V1h 长度、糖基位点持续累积，覆盖更多全球流行毒株特征（图 6C、6H）。全部关键位点突变渐进累积，只有所有位点均发生突变后，血浆才可检出对应异源中和活性（附图 S34）。
讨论
长期制约 HIV 疫苗研发的核心障碍是缺少可稳定诱导广谱中和抗体的远交动物模型。现有仅啮齿类、恒河猴融合肽靶向广谱中和模型，但抗体效价低、成熟周期漫长。本研究 SHIV.5MUT 填补空白：22 只恒河猴中 14 只感染 1 年内产生 V3 聚糖广谱中和抗体，多数动物血浆滴度达到临床保护标准（ID₅₀>1:1000），单克隆抗体最高中和覆盖 68% 全球毒株。本数据可为后续疫苗评价基准，指导新一代免疫原开发。
向人体疫苗转化时推荐免疫方案：1. del4/del8 初免激活多样化 V3 前体；2. 携带 10 个关键位点突变、V1h 修饰的同源包膜加强，推动谱系成熟获得广谱；3. 混合多种天然异源包膜最终加强，模拟全球毒株多样性。目前恒河猴临床前验证实验正在开展。
本研究存在局限性：尽管 del4/del8 具备激活潜力，仍有部分 SHIV.5MUT 感染动物未产生广谱中和抗体。主要原因包括抗原刺激不足（广谱阴性动物病毒载量更低，69,72,73）、SHIV 感染模型固有的复杂免疫调控。但该局限同时提供优化方向：可基于本标准化远交灵长类模型，优化广谱中和抗体诱导稳定性、中和广谱、效价与持久度。
致谢
序列数据、冷冻电镜结构、质谱原始数据分别上传 GenBank、PDB、EMDB、MassIVE 数据库；SHIV、mRNA、单克隆抗体可通过材料转让协议索取，无自主编写分析代码。补充材料、附图、原始数据详见官网补充文件；投稿 2025.10.4，返修 2026.2.8，接收 2026.4.23，在线发表 2026.5.7，DOI:10.1126/science.aec6396。
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