开发一种佐剂型、高剂量、细胞培养的流感疫苗：结合先进技术提高疫苗效力

2.1 病毒：抗原漂移及更广泛保护的必要性

甲型和乙型流感病毒是包膜的、负链单链 RNA 分节段病毒，它们通过表面糖蛋白血凝素（HA）的作用进入上呼吸道细胞，而另一种糖蛋白神经氨酸酶（NA）则使病毒能够穿透黏液并从感染细胞中释放出来。HA 是流感病毒中抗原变异性最大的蛋白，也是自然感染和流感疫苗诱导产生的保护性抗体的主要靶点[19]。 抗​​原漂移是指流感病毒中突变的积累，由于选择压力，这些突变经常改变 HA，并导致变异毒株的出现，这些变异毒株有可能逃避先前感染和疫苗接种产生的抗体反应[20,35]。抗原漂移也可能影响 NA，但程度较小，因为 NA 包含保守表位，这些表位在不同毒株之间往往保持稳定[36,37]。在流感流行季节不匹配的情况下，特别是 A/H3N2 流感（极易发生 HA 抗原漂移）占主导地位的情况下，N2 中保守的 NA 可能是对流感具有保护作用的最强因素[38]。

由于流感病毒不断发生抗原漂移，世界卫生组织每年都会根据对即将到来的流感季最可能流行的毒株的预测，选择候选疫苗病毒（CVV）用于疫苗生产[39]。然而，在某些流感季，持续或快速的季末抗原漂移会导致疫苗病毒与流行流感病毒不匹配，这通常会对疫苗的有效性产生负面影响。在 2014-2015 流感季，针对主要流行毒株（含 HA 基因 3C.2a 组的 A/H3N2；占感染病例的 81%）的疫苗有效率仅为 1%（95% CI，-14%至 14%），而针对疫苗样流感病毒 A/H3N2 3C.3b 组（占感染病例的 11%）的疫苗有效率则为 44%（95% CI，16%至 63%）[40]。在 2019-2020 流感季，针对该季后期占主导地位的抗原漂移毒株 A(H1N1)pdm09（6B.1A 分支）的疫苗有效率仅为 7%（95% CI，-14%至 23%），而以往流感季的有效率则为 40%至 60%[41]。诱导更广泛的交叉反应性免疫的策略可能有助于提高对漂移毒株的保护效力，并降低疫苗不匹配的影响。

2.2. 疫苗生产：鸡蛋适应性以及疫苗不匹配和不当印迹的可能性

自 20 世纪 40 年代流感疫苗问世以来，鸡胚一直是全球绝大多数流感疫苗的生产平台。在全球范围内，基于鸡胚的生产需要数十亿枚受精卵（通常每剂流感疫苗需要一到两枚鸡胚），这是一个耗时耗力的过程，大约需要 6-8 个月才能生产出足够的病毒[42,43]。此外，人类流感病毒在鸡胚中生长不良；接种到鸡胚中的病毒只有五分之二能够繁殖[44]。病毒之所以能够适应鸡胚环境，是因为禽流感病毒和人类流感病毒的血凝素（HA）蛋白与上呼吸道细胞受体的结合方式不同（禽流感病毒通过唾液酸α-2,3 连接，而哺乳动物细胞通过α-2,6 连接）[45,46]。禽类环境中对人源流感疫苗的选择压力驱动了血凝素（HA）的突变，使病毒能够更有效地与α-2,3 唾液酸受体结合，进入细胞并开始复制[46]。然而，HA 突变通常发生在受体结合位点，改变主要抗原位点或其邻近的氨基酸，从而改变疫苗的抗原性。一项对 2008 年至 2020 年间鸡胚培养的流感病毒与临床样本的比较研究发现，93%的鸡胚培养病毒存在非同义 HA 突变；其中，63%的 HA 氨基酸改变发生在抗原位点和受体结合位点[44]。一项对 2010 年至 2024 年间世界卫生组织推荐的鸡胚培养流感疫苗的详细序列分析表明，每个流行季和所有毒株均存在鸡胚适应性，尽管突变在 A/H3N2 毒株中最常见[47]。 与 Peck 等人 [44] 的观察结果一致，后一项调查中发现的许多突变都位于受体结合位点或其他重要的 HA 抗原位点上。真实世界研究（将在本文后续部分讨论）支持鸡蛋适应性对疫苗有效性的负面影响 [48–64]。

基于鸡蛋的疫苗也可能通过诱导不适当的印迹而对自然流感感染的长期免疫反应产生负面影响。既往感染和疫苗接种史都会启动免疫记忆，并可能对后续流感疫苗接种的反应产生积极或消极的影响[65-67]。美国疾病控制与预防中心 (CDC) 于 2021 年进行的一项研究检测了不同年龄组人群对鸡蛋适应型和野生型细胞培养的 A/H3N2 病毒的抗体反应[68]。在首次接触流感病毒且免疫功能低下的 3 岁以下儿童中，接种鸡蛋适应型流感疫苗后，其抗体反应主要针对流行流感病毒中不存在的鸡蛋适应型表位。在这些儿童中，针对代表流行病毒的细胞培养疫苗病毒的抗体反应则较为有限。相比之下，在那些曾因自然感染 A/H3N2 毒株而获得免疫启动的儿童中，如果他们之后接种了基于鸡蛋的疫苗，则对鸡蛋来源和细胞来源疫苗病毒的抗体反应相似。这些观察结果表明，当鸡蛋适应性疫苗构成首次接触流感病毒抗原时，它可能会引导免疫启动针对与流行毒株不同的抗原组成，从而降低后续疫苗的有效性。重复接种鸡蛋来源疫苗也会对老年人的免疫反应和疫苗有效性产生负面影响，这些老年人的儿童时期免疫启动发生在 A/H3N2 出现之前[68]。一项随机对照试验（RCT）进一步表明，重复接种鸡蛋来源疫苗可能会促进针对鸡蛋适应性表位的中和抗体的产生。 此外，可能需要多次接种非鸡蛋来源的流感疫苗，才能使免疫记忆驱动的抗体反应从适应鸡蛋的表位转向循环病毒上的表位，从而提高疫苗的有效性[69]。

多项研究观察到，随着连续接种，疫苗效力会逐渐减弱。近期一项荟萃分析的作者指出，病毒在鸡胚中的适应性可能是造成这种现象的潜在因素。该分析纳入了 41 项研究（其中大多数研究使用了基于鸡胚的疫苗），结果显示，在连续两个流感季接种疫苗的人群中，第二个流感季对甲型 H1N1、甲型 H3N2 和乙型流感病毒的疫苗效力分别比第一个流感季平均降低了 9%、18%和 7%。由于该分析缺乏足够的数据来比较病毒的生长底物（例如鸡胚与哺乳动物或昆虫细胞系）[67]，因此需要开展更多研究来证实病毒在鸡胚中适应性的作用。作者还发现，连续两年接种疫苗比完全不接种疫苗更能提供保护。此外，观察到的疫苗效力下降幅度逐年变化，且并不稳定或严重到足以改变目前关于年度流感疫苗接种的建议[67]。对于老年人来说，疫苗增强剂如 MF59 佐剂或增加抗原剂量也可以减轻（但不能消除）由于重复接种疫苗而导致的效力减弱 [70,71]。

这些观察结果支持避免病毒卵适应的策略，例如在哺乳动物细胞系中扩增 CVV 或在昆虫细胞系中合成重组 HA 蛋白。鉴于其提高疫苗有效性的潜力，一些卫生机构建议使用哺乳动物细胞培养或重组技术而非病毒卵培养技术生产的流感疫苗[22,72]。

2.3. 宿主：免疫衰老和炎症衰老

免疫衰老是一个动态过程，大约从50岁开始，被描述为“一种由免疫参数的显著变化所定义的状态，这些参数在年轻人和老年人之间存在差异，并且与明显的不良临床结局相关”[24,73]。包括肥胖、肝病、心血管疾病、糖尿病、肾病以及免疫系统和呼吸系统疾病在内的慢性疾病通常会随着年龄的增长而加重，并且与全身性慢性炎症密切相关，而全身性慢性炎症本身可能会损害免疫功能（即“炎症衰老”）[28-32]。因此，免疫衰老和炎症衰老都会导致免疫反应减弱和流感相关疾病的严重程度增加[9-11,74,75]。

免疫衰老会对所有流感疫苗的免疫应答产生负面影响，包括先天性和适应性免疫系统的应答。这包括 B 细胞功能受损和多样性降低；B 细胞分泌抗体的结合特异性和中和能力下降；初始 T 细胞数量减少；以及介导树突状细胞、自然杀伤（NK）细胞和其他免疫细胞成熟和增​​殖的细胞因子发生变化[25-27]。此外，T 细胞和辅助性 T 细胞的信号传导和活化减弱，以及 T 细胞受体敏感性的改变，也可能对记忆性 B 细胞产生不利影响[26]。

炎症衰老主要影响先天免疫，可能产生积极和消极的双重影响，但总体而言，其结果是免疫功能显著下降，发病率和死亡率增加[29-32,76-78]。慢性炎症可能增强免疫系统检测和应对病原体的能力，有助于预防感染，但也可能削弱巨噬细胞和其他免疫因子清除已发生感染的能力[79,80]。此外，炎症衰老会增加慢性心肾疾病和代谢性疾病的风险，并且个体慢性疾病的数量越多，发生急性呼吸道感染导致重症的风险就越高[11,78,80]。

3.1.疫苗佐剂：aTIV/aQIV

广义而言，疫苗佐剂是能够增强疫苗免疫反应的化学添加剂。相关机制包括细胞因子和趋化因子的上调、炎症小体的激活、抗原摄取和呈递给抗原呈递细胞（APC）的增加、APC 的激活和成熟以及 APC 向引流淋巴结的迁移[84,85]。佐剂还具有剂量节省效应，与未添加佐剂的疫苗相比，添加佐剂的疫苗只需更小的抗原剂量即可达到类似的免疫反应。剂量节省在流感大流行期间尤为重要，因为能够更快地分发更多剂量的疫苗是重要的大流行缓解策略。用于大流行性流感疫苗的佐剂包括明矾、病毒体、AS03 和 MF59。MF59 也已在已获许可的季节性流感疫苗中使用超过 25 年[85]。

MF59 是一种基于角鲨烯的油包水乳液，含有两种表面活性剂 Tween 80 和 Span 85，用于稳定乳液。注射后，MF59 可增加抗原呈递细胞 (APC) 对抗原的摄取和呈递；诱导趋化因子，增强注射部位固有免疫细胞的募集和活化；促进抗原向引流淋巴结的转运以及单核细胞向树突状细胞的分化；提高抗体滴度和亲和力成熟度；并增强 T 细胞反应，包括 CD4+ 辅助性 T 细胞和滤泡辅助性 T 细胞（图 4 ）[86-90]。这些作用被认为能够积极影响抗原特异性 B 细胞反应的质量和数量以及适应性免疫的结果 [87,91]。

在人体中，MF59 已被证实能够提高抗体结合亲和力和广度[92,93]。与 SD-QIVe 相比，aQIV 不仅增强了针对 HA 头部高度可变且免疫优势抗原表位的抗体反应，也增强了针对更为保守的 HA 茎部表位的抗体反应。在接种标准流感疫苗的人群中，茎部表位比头部表位更难诱导抗体反应，但在接种 aQIV 的人群中，针对茎部表位的抗体反应可能有助于观察到的交叉保护作用[93]。MF59 还被证实能够增强针对 NA 和 HA 的免疫反应，这可能进一步有助于 aTIV 相比 TIV 提供更佳的临床保护[94,95]。NA 已被证实能够提供跨流感亚型的交叉保护性免疫，提示抗 NA 抗体可能比抗 HA 抗体诱导更广泛的保护作用[36,96]。然而，在没有佐剂的情况下，HA 和 NA 会竞争免疫识别，HA 的免疫优势会抑制 NA 反应 [97,98]。添加 MF59 佐剂可以克服 HA 的免疫优势，从而提高靶向 NA 的抗体滴度 [94,95,99]。

一项比较增强型疫苗（aTIV、HD-TIV 和 RIV4）与 SD-QIV 在社区居住的 ≥65 岁成年人中免疫原性的随机对照试验显示，所有疫苗均能诱导产生相当的 H3-HA 特异性 IgG 活性，并能相似地提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。然而，与其他疫苗相比，aTIV 诱导的 H3-HA 抗体亲和力和针对 HA 高度保守的 G2 茎区的抗体滴度更高，从而激活了 NK 细胞以及其他效应功能。HD-TIV 诱导的 HA 特异性 NK 细胞活化水平最高，即使在有频繁接种疫苗史的个体中也是如此。本研究中，aTIV 和 RIV4 接种者表现出最高水平的高质量多功能 T 细胞募集，这些 T 细胞具有预防重症流感的保护潜力 [100]。

总体而言，与标准流感疫苗相比，aTIV/aQIV 在幼儿（免疫系统尚未发育成熟）、中年人（50-64 岁）以及 ≥65 岁的老年人中均能产生更强、更广泛、更持久的免疫反应，增强的免疫反应可能有助于延缓免疫衰老 [86,101-106]。aTIV/aQIV 诱导的血凝抑制 (HI) 和微量中和 (MN) 抗体滴度显著高于标准疫苗，且免疫反应可持续 ≥6 个月（表 2 ）[101-104]。与 SD-TIVe/QIVe 相比，aTIV/aQIV 在年轻人、老年人和免疫功能低下人群中，针对同源 A/H3N2、A/H1N1 和 B 型流感病毒株的血清转化率最高可提高 13%，几何平均滴度 (GMT) 最高可提高 30%（表 2 ）。 aTIV 还显示出针对大多数异源毒株更高的抗体滴度和更高的血清转化率，并且在连续接种疫苗的受试者中，免疫原性能够维持数个流感季 [101,104]。在比较增强型疫苗与 SD-QIVe 在既往接种过和未接种过流感疫苗的成年人中的免疫原性的研究中，所有疫苗组的再次接种受试者的抗体滴度均有所下降，但 aTIV 和 RIV 与 SD-QIVe 相比下降幅度较小 [70,71]。一项荟萃分析表明，aTIV 接种者针对同源 A/H3N2 和 B 毒株的抗体滴度可持续 6 个月，一项大型随机对照试验显示，针对 2021-2022 流感季的同源 A/H1N1 毒株的抗体滴度可持续 9 个月 [101,107]。证据还表明，MF59 佐剂可能加快对流感感染的保护作用的出现[103]。

就临床疗效而言，图 2 展示了一项荟萃分析的结果，该分析纳入了 2002 年至 2022 年间开展的 27 项观察性试验，其中包括约 650 万名接种了 aTIV/aQIV 疫苗的受试者、4200 万名接种了 HD-TIV/QIV 疫苗的受试者、61.2 万名接种了 RIV 疫苗的受试者以及 2200 万名接种了标准流感疫苗的受试者。结果显示，aTIV/aQIV 疫苗相对于标准疫苗具有明显的优势。此外，该分析还发现三种增强型疫苗之间的疗效无显著差异[81]。众多研究也证实了这些结果，这些研究表明，在老年人群中，aTIV/aQIV 疫苗比标准疫苗能预防更多的流感相关疾病、就医和住院治疗[108-117]。

基于超过 20 年的上市后监测，MF59 佐剂疫苗具有良好的安全性和耐受性[34,104,118-120]。在全面的系统评价中发现，与 SD-TIV 相比，aTIV 与更高的注射部位疼痛、肌痛、发热和寒战发生率相关[34,118]。在关键性试验中，aTIV 组报告的局部和全身不良反应发生率（分别为 32%和 32%）高于 SD-TIV 组（分别为 17%和 26%）；两组的严重不良反应发生率均为 3%~1%[103,120]。在三项随机对照试验中，每个疫苗组（aTIV 和 SD-TIV）共报告了 3 例相关严重不良事件（SAE），其中包括 aTIV/aQIV 接种者中的 2 例格林-巴利综合征[34,118]。未报告 SAE 住院率的差异。 aTIV/aQIV 与 SD-TIV/QIV 相比，SAE 的合并相对风险为 0.95（95% CI，0.19–4.72）[118]。总而言之，这些数据支持 aTIV/aQIV 具有良好的风险获益比。

3.2.抗原含量较高：HD-TIV/QIV

HD-TIV/QIV 采用鸡蛋培养平台生产，目前已在≥50 岁人群中进行过研究[121-126]。HD-TIV/QIV 中每种毒株的抗原剂量（60 μg）是标准剂量流感疫苗（15 μg）的四倍。与 aTIV/aQIV 类似，HD-TIV/QIV 有助于克服与​​年龄相关的免疫反应下降，并提供比 SD-TIV/QIV 更高、与 aTIV/aQIV 相似的流感保护[81,115,118]。

HD-TIV/QIV 中增加的抗原剂量增强了免疫应答的强度，与 SD-TIV/QIV 相比，可产生更高的 HA 抗体滴度和更好的血清保护率 [102,123,127]。GMT 比值始终显示 HD-TIV 优于 SD-TIV（表 2 ）[123,127]。在一项为期 2 年的 HD-TIV 关键性试验中，第二年的血清保护率比 SD-TIV 高 4%–13%（表 2 ）[123]。在既往接种过和未接种过流感疫苗的成年人的研究中，再次接种 HD-TIV 的受试者的应答略优于 QIVe，但不如 aTIV 和 RIV 的应答强烈 [70,71]。与 aTIV 类似，HD-TIV/QIV 也显示出 NA 抑制滴度的增加 [99,128]。

与 aTIV/aQIV 类似，HD-TIV/QIV 的免疫原性增强，使其在预防流感相关住院方面比 SD-TIV/QIV 更具优势（图 2 ）[81,115,129]。近期三项研究——DANFLU-2、GALFLU 和 FLUNITY-HD——表明，HD-TIV/QIV 比 SD-TIV/QIV 能预防更多实验室确诊流感住院病例，并且对心肺疾病住院也有保护作用，尽管两组疫苗在肺炎和其他疾病住院发生率方面相似[130-132]。

HD-TIV/QIV 的安全性已在十余年中得到充分证实 [34,118]。与标准流感疫苗相比，HD-TIV/QIV 注射部位疼痛、硬结和肿胀的发生率更高，头痛、寒战和不适的发生率也更高 [34,118]。据报道，严重不良反应的发生率在 1.1% 至 1.8% 之间 [133]。与 HD-TIV 相关的可能严重不良事件包括神经病变、第 VI 颅神经麻痹、休克、克罗恩病、重症肌无力和脑脊髓炎，HD-TIV/QIV 与 SD-TIV 相比，严重不良事件的合并相对风险为 1.02（95% CI，0.42–2.46）[34,118]。这些数据支持 HD-TIV/QIV 具有良好的风险获益比。

3.3. 使用哺乳动物细胞培养衍生流感疫苗避免鸡胚适应：TIVc/QIVc

TIVc/QIVc 已在儿童和成人人群中得到充分研究[134-136]。该疫苗中的病毒株在 MDCK 细胞中扩增，这些细胞接种疫苗病毒后，在包含大型（2000-6000 升）细胞发酵罐的封闭系统中进行培养[22,137]。MDCK 细胞和人细胞具有相同的 α-2,6 唾液酸受体，而禽类细胞则使用 α-2,3 唾液酸受体[45,46]。

2016 年之前，三价流感疫苗（TIVc）采用的是以鸡蛋为基础的种子病毒，但细胞培养的疫苗株（CVV）在 2017-2018 年开始用于甲型 H3N2 流感，并在 2018-2019 年用于乙型流感。到 2019-2020 流感季，细胞培养疫苗已完全采用细胞培养的疫苗株（CVV）生产[42]。由于缺乏禽类环境的选择压力，在 MDCK 细胞中培养的疫苗病毒的氨基酸变化很少且随机[44,45,47]。由于世界卫生组织（WHO）严格的病毒筛选流程，在细胞培养疫苗中未发现 MDCK 细胞培养病毒中报道的氨基酸变化[39,47]。哺乳动物细胞也比鸡蛋提供更好的生长培养基，从而获得更高的病毒产量，进而改善潜在疫苗株（CVV）的选择[44,138]。

尽管目前尚无随机对照试验比较细胞疫苗和鸡蛋疫苗在≥50 岁人群中的免疫原性或有效性，但大量观察性研究表明，与标准剂量四价流感疫苗（SD-QIVe）相比，细胞疫苗（QIVc）具有更高的有效性，可降低≤64 岁人群的流感样疾病发生率、流感相关门诊就诊、急诊就诊和住院率、心肺住院率以及实验室确诊流感病例（图 3 ）[48–64,82,83]。考虑到老年人群免疫衰老和炎症衰老问题，观察性研究数据并未显示细胞疫苗与鸡蛋疫苗相比，在≥65 岁人群中具有一致的益处[48,115,139–141]。

TIVc/QIVc 的安全性已得到充分证实，超过 15 年的临床数据显示其耐受性与标准剂量鸡蛋疫苗相似 [134–136]。免疫接种后，局部或全身不良事件的发生率未见具有临床意义的差异。大多数局部和全身反应为轻度至中度，且在 TIVc/QIVc 的临床试验中未报告严重不良事件 [134–136]。

3.4. 更高抗原剂量和避免卵适应：RIV

如图 1 所示，提高流感疫苗有效性的三大支柱中，RIV 包含两项：更高的抗原剂量和避免鸡胚适应的重组生产平台。RIV 每种流感病毒株含有 45 μg 抗原，是标准剂量疫苗的三倍 [142]。在美国和欧洲，RIV 的适用人群已从 18 岁及以上成人扩大到 9 岁及以上人群 [143,144]。

RIV 的抗原成分是利用杆状病毒载体，在源自草地贪夜蛾（ Spodoptera frugiperda ）Sf9 细胞的昆虫细胞系（ express SF+昆虫细胞）中合成的[142]。RIV 与灭活流感疫苗的一个关键区别在于，后者同时含有 HA 和 NA 抗原，而 RIV 仅含有 HA。尽管 NA 缺失的影响尚未得到充分研究，但 NA 的缺失可能导致 RIV 接种者无法获得与该蛋白相关的交叉保护。

与 SD-TIVe 相比，RIV 在 ≥50 岁的成年人中显示出对 A/H1N1 和 A/H3N2 毒株（而非 B 毒株）诱导的 HI 滴度显著更高，并且对 A/H3N2 的血清转化率也有所提高（表 2 ）[145,146]。在一项为期两年的试验中，一项预先计划的小型子研究评估了基于鸡蛋的 aTIV、HD-TIV 和 SD-TIVe 对不同 A/H3N2 毒株的免疫应答，89 名 65-74 岁的受试者在试验的第二年接种了 RIV4（第一年接种了 SD-TIV）[147,148]。在这项小型研究中，RIV 对三种异源 A/H3N2 毒株中两种的血清转化率高于 aTIV 或 HD-TIV，但针对同源毒株和第三种异源毒株的血清转化率在疫苗间差异无统计学意义，针对所有 A/H3N2 毒株的接种后中和抗体滴度差异也无统计学意义 [148]。在先前引用的涉及既往接种过和未接种过流感疫苗的成年人的研究中，RIV 在再次接种者中诱导的抗体反应强于其他疫苗，但多次连续接种流感疫苗后抗体滴度也会下降 [70,71]。

与 SD-TIVe/QIVe 相比，RIV 对 PCR 确诊的甲型流感病毒表现出更高的疗效和/或有效性，但对乙型流感病毒的疗效结果不一[145,149]。在两项检测阴性研究中，RIV 在预防 18-64 岁人群的流感相关门诊就诊[150]或≥65 岁成人亚组或≥18 岁高危人群的住院治疗[151]方面，疗效并不优于 SD-TIVe/QIVe。然而，在一项荟萃分析中，RIV 在预防≥65 岁人群住院治疗方面的有效性与 aTIV/aQIV 和 HD-TIV/QIV 相当（图 2 ）[81]。一项纳入 2019-2020 流感季 1270 万名 65 岁及以上 Medicare 受益人的观察性队列研究表明，三种增强型流感疫苗在预防流感相关住院方面均优于 SD-TIVe/QIVe，但同时也发现 RIV 与其他两种增强型疫苗相比具有统计学意义上的显著优势[139]。相比之下，英国一项最新的观察性研究发现，在预防实验室确诊的流感住院方面，任何类型的疫苗之间均无显著差异[152]。

与其他增强型疫苗类似，RIV 的安全性已得到充分证实 [34,104]。与 SD-TIVe/QIVe 相比，RIV 引起的局部反应（包括注射部位疼痛、红斑、肿胀和触痛）较少，但寒战发生率较高 [34]。RIV 报告的严重不良事件包括晕厥和心包积液，RIV 与 SD-TIVe/QIVe 相比，发生严重不良事件的合并相对风险为 3.04（95% CI，0.32–29.10%）[34,118]。