Contents
Effect of BCG Danish and oral polio vaccine on neonatal mortality in newborn babies weighing less than 2000 g in India: multicentre open label randomised controlled trial (BLOW2)
- 在Adhisivam，新生儿学家1，
- Chinnathambi Kamalarathnam，新生儿科医生2，
- B·毗湿奴·巴特，医学研究与出版物顾问3，
- Kumutha Jayaraman，教授主任4，
- 西瓦·P·纳马奇瓦亚姆，高级专科医师5，
- 弗兰克·尚恩，教授研究员兼专科医师5 6，
- 布伦特·麦克沙里，主治医师7，
- 大卫，
- 拉贾，研究护士1，
- Mangalabharathi Sundaram，新生儿科学教授8
- 通信作者：F·尚 shannfas@gmail.com
- 2025年9月16日录用
摘要
目的 测试为体重不足2000克的新生儿接种一剂丹麦卡介苗（BCG）和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）对全因新生儿死亡率（年龄≤28天）的影响。
设计 多中心、开放标签、随机对照试验
研究地点 印度东南部的三个三级新生儿重症监护病房（NICU）。
人群 体重不足2000克的新生儿。对7067名新生儿进行了资格评估，5420名被随机分组（2714名接种卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗，2706名作为对照组）。
干预措施 新生儿按1:1的比例随机分组，接受0.1毫升丹麦株卡介苗皮内注射联合口服脊髓灰质炎疫苗，一组在进入新生儿重症监护室后48小时内接种（早期接种组），另一组延迟至至少出院时接种（对照组）。分层因素为新生儿重症监护室、性别和出生体重（<1000克、1000-1499克、1500-1999克）。
主要结局指标 主要结局为全因新生儿死亡率。主要次要结局在试验进行到三分之一时纳入，为感染导致的新生儿死亡率。
结果 在5420名随机分组的新生儿中，中位年龄为0.9天，中位出生体重为1560克，其中9名失访。早期接种组2714名新生儿中有238名（8.8%）死亡，对照组2706名新生儿中有273名（10.1%）死亡。在按新生儿重症监护室（NICU）分层，并对出生后年龄、出生体重、性别和胎龄进行调整的意向性治疗Cox生存分析中，早期接种组的新生儿年死亡率为1.29，对照组为1.50（调整后的风险比为0.83，95%置信区间（CI）为0.69至0.98；P=0.03）。预防1例死亡所需治疗人数为21（95%CI为10至245）。早期接种组的感染相关新生儿年死亡率为0.40，对照组为0.73（调整后的风险比为0.53，95%CI为0.40至0.70）。未发生结核病相关死亡，且接种未出现严重不良反应。
结论 在重症监护中体重不足2000克的新生儿中，在中位年龄0.9天时接种卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗，通过减少除结核病外的其他感染导致的死亡（一种非特异性或脱靶效应），降低了各种原因导致的新生儿死亡率。如果在高死亡率地区，由熟练的接种人员对很大比例的新生儿在出生当天或出生后不久进行接种，可大幅降低新生儿死亡率。
试验注册 印度临床试验注册中心 CTRI/2017/01/007676。
引言
2019年，全球5岁以下儿童死亡人数为519万，其中97.9%发生在非经济合作与发展组织（OECD）成员国的中低收入国家。1 如果2019年全球5岁以下儿童的死亡率与OECD国家相同，那么死亡人数将会是97万，而不是519万。1 尽管全球5岁以下儿童的死亡率大幅下降，但新生儿（出生后前28天）死亡率下降甚微，目前占5岁以下儿童死亡人数的47%。1 迫切需要能降低新生儿死亡率的干预措施。2
卡介苗可能具有非特异性（脱靶、异源）效应，可降低其他感染以及结核病的严重程度。34这些效应至少部分归因于异源免疫和由单核细胞表观遗传重编程介导的“训练性”先天免疫反应。45678卡介苗有益的非特异性效应可能至少持续1-2年，9这可能取决于菌株，310且若存在现有免疫力（如母亲有卡介苗疤痕或卡介苗复种），该效应似乎会增强，3911但后续接种非活疫苗（如白喉-破伤风-百日咳疫苗）可能会逆转这种效应。3
2023年，全球需要3.23亿剂卡介苗，最常用的菌株是世界卫生组织（WHO）预认证的那些：丹麦1331株、保加利亚SL-222株（一种俄罗斯菌株）、俄罗斯I株和东京172-1株。12世卫组织建议在结核病流行的国家，新生儿应在出生时接种卡介苗。13然而，对于低出生体重的新生儿，卡介苗的接种往往会延迟<bb2>14</bb2>15；因此，在这些婴儿中比较早期与延迟接种卡介苗具有伦理意义。在几内亚比绍针对体重<2500克的新生儿开展的三项随机试验中，出院时接种丹麦卡介苗（哥本哈根国家血清研究所）对主要结局均无统计学显著影响，但荟萃分析显示，新生儿死亡率降低了38%（95%置信区间17%至54%）141617；这种降低得益于感染相关死亡的减少。几内亚比绍的这些试验意义重大，因为它们是首批旨在测试卡介苗对全因新生儿死亡率影响的随机试验。随后在几内亚比绍开展的两项试验均提前终止：一项表明丹麦卡介苗对住院死亡率没有影响，18另一项发现东京卡介苗可能降低60天内的死亡率。19
然而，与在几内亚比绍进行的丹麦卡介苗试验不同，在印度三个新生儿重症监护病房（NICU）开展的两项大型试验（BLOW1）中，我们发现，出生后不久接种俄罗斯卡介苗（印度浦那血清研究所生产）联合或不联合口服脊髓灰质炎疫苗（OPV），并未降低出生体重<2000克新生儿的死亡率。15联合国儿童基金会向低收入和中等收入国家分发的四种卡介苗菌株在细菌活力、RNA含量和免疫学效应方面存在显著差异，20因此这些疫苗可能具有不同的特异性和非特异性效应。10在我们完成俄罗斯卡介苗试验后不久，由于该疫苗可能不如丹麦卡介苗有效，1020我们在出生体重<2000克的新生儿中开展了一项试验（BLOW2），在之前测试俄罗斯卡介苗的相同三个新生儿重症监护病房，采用相同的试验设计，来测试丹麦卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗的效果。将口服脊髓灰质炎疫苗与丹麦卡介苗联合使用，是因为这是印度的标准做法。我们使用0.1毫升剂量的卡介苗，是因为这是贾瓦哈拉尔研究生医学教育与研究学院新生儿科的长期做法，并且在印度被广泛使用。212223242526
方法
试验设计
BLOW2是一项多中心随机试验，在印度东南部的三家大型新生儿重症监护室（NICU）开展：分别是本地治里的贾瓦哈拉尔研究生医学教育与研究学院（几乎均为院内出生婴儿；院内出生婴儿指在设有NICU的同一家医院出生的婴儿，院外出生婴儿指在其他地方出生的婴儿）、金奈的儿童健康研究所及儿童医院（几乎均为院外出生婴儿），以及金奈相邻的妇产科研究所（几乎均为院内出生婴儿）。贾瓦哈拉尔学院的招募、随机分组和接种工作于2017年2月1日至2022年4月30日进行，儿童健康研究所和妇产科研究所的相关工作于2018年8月1日至2022年4月30日进行；结局数据的收集于2022年6月19日完成。该试验方案已前瞻性在印度临床试验注册中心注册。
患者
出生体重<2000克且入住三个新生儿重症监护室（NICU）之一的新生儿符合BLOW2试验的入选标准。若新生儿年龄<60分钟或>21天、预计24小时内无法存活、存在危及生命的严重畸形、已接种卡介苗（BCG）、母亲或婴儿已知感染HIV、乙型肝炎、带状疱疹或存在免疫缺陷、母亲年龄<18岁，或家庭拒绝同意，则被排除在外。所有在产前咳嗽两周及以上（无论是否伴有其他提示结核病的症状，如发热两周及以上、咯血、不明原因的显著体重下降或盗汗）的母亲均接受了痰涂片检查和核酸扩增检测。
样本量、随机化和盲法
在我们早期进行的卡介苗（BCG）俄罗斯疫苗和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）试验中，15延迟接种（对照组）的死亡率为17.6%。在本次试验中，我们使用Stata 14.1版本的sampsi命令估算，共需要510例死亡病例：假设对照组的死亡率为15%，那么每组需要1998名婴儿，才能有95%的把握度检测出使用卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗后死亡率降低30%（α<0.01）；这意味着对照组会有300例死亡（1998×0.15），早期接种组会有210例死亡（1998×0.15×0.7）。样本量以死亡病例数来确定，因此死亡率的变化会自动调整随机分配的新生儿数量。
入组前已获得一名家长的书面知情同意。新生儿通过专门编写的计算机程序进行随机分组，该程序会检查资格、分配治疗，并记录基线和结局数据。随机分组比例为1:1，按新生儿重症监护室（NICU）、性别和出生体重（<1000克、1000-1499克、1500-1999克）进行分层，组块大小在2-8名新生儿之间随机变化。当510名婴儿死亡时，入组于2022年4月30日停止。卡介苗（BCG）会导致明显的皮肤损伤，因此无法对工作人员隐瞒分组情况，因为在这些高危婴儿整个重症监护期间遮盖其上臂是不道德的；评估婴儿死亡或存活情况的护理人员并未设盲。
步骤
在贾瓦哈拉尔研究所，一名研究护士负责招募新生儿并为其接种疫苗，同时记录所有数据；在儿童健康研究所及妇产科研究所，一名研究助理负责招募新生儿并记录所有数据，一名免疫接种护士则为参与者接种疫苗。早期接种组的婴儿在进入新生儿重症监护室（NICU）后的48小时内，皮内注射0.1毫升丹麦株卡介苗（由金奈的GreenSignal生物制药公司生产），同时服用0.1毫升（两滴）1型和3型二价口服脊髓灰质炎疫苗（由海得拉巴的巴拉特生物技术国际公司或加济阿巴德的Bio-Med公司生产）。在贾瓦哈拉尔研究所，早期接种组的婴儿在出院时接种乙型肝炎疫苗，对照组的婴儿则接种卡介苗、口服脊髓灰质炎疫苗和乙型肝炎疫苗。在儿童健康研究所及妇产科研究所，早期接种组的婴儿在约6周龄时接种乙型肝炎疫苗，对照组的婴儿则接种卡介苗、口服脊髓灰质炎疫苗和乙型肝炎疫苗。研究未收集有关喂养方式的信息。
结果
主要结局指标为新生儿出生后28天内的死亡率，对以下情况进行了 censoring（删失）：失访时、28天前接种任何疫苗时（早期接种组的卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗除外）。同时，该结局指标校正了双胞胎或三胞胎之间的年龄和生存依赖性、随机分层变量（新生儿重症监护室、性别和出生体重），以及（若对Cox模型有影响）孕周、季节、母亲卡介苗疤痕情况，还有婴儿是否在研究医院出生。然而，对照组中相当一部分婴儿在出生28天内、大约出院时接种了卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗，且出院至28天内死亡病例极少。因此，数据和安全监测委员会建议，在对对照组进行主要分析时，不应因接种卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗而进行删失，因为这样做会导致偏倚——删失会去除对照组中低死亡风险时段（从出院到28天）的数据，而早期接种组则不会出现这种情况。 次要结局指标包括感染导致的死亡，以及母亲有卡介苗疤痕的新生儿的死亡。本试验规划时，初步证据表明，卡介苗疫苗可能仅在母亲有卡介苗疤痕的情况下对新生儿有保护作用27；因此，试验方案规定，若疫苗仅在母亲有卡介苗疤痕时能降低死亡率，则试验将延长，主要结局指标将改为母亲有卡介苗疤痕的新生儿的死亡率。感染导致的死亡这一次要结局指标未在原始方案中明确，而是在试验进行到三分之一时，根据数据和安全监测委员会的建议添加的。这是因为在几内亚比绍开展的一项新生儿卡介苗研究表明，接种疫苗可能降低感染性而非非感染性原因导致的死亡率<17</17>，随后有两项研究支持了这一发现<18</18><28</28>。 治疗临床医生根据预先指定的列表确定死亡原因：先天性畸形、透明膜病、感染、脑室内出血、坏死性小肠结肠炎、其他原因及不明原因。本研究中，感染（与败血症同义）的定义为：出现一个或多个感染的临床体征，且要么血培养检出微生物，要么血培养无菌但至少有两项感染筛查指标异常，包括：C反应蛋白>1.14µmol/L（120mg/L）、中性粒细胞绝对计数<1500/mm³、白细胞总数<5000/mm³、红细胞沉降率>15mm/小时，或未成熟中性粒细胞与总中性粒细胞比值>0.2<29</29>。
一个独立的数据与安全监测委员会对试验的实施情况进行了审查（详见补充文件S10部分的成员名单）。主要研究者于2022年11月17日签署了第5.0版最终统计分析计划。该统计分析计划已发布在马德拉斯医学院网站（www.mmc.ac.in）上。然而，该网站在2023年初停止运行；此后，所有版本的方案、数据与安全监测委员会文件以及统计分析计划均已发布在https://osf.io/3492q/。
统计分析
所有统计检验均为双侧检验，我们认为P值<0.05具有统计学意义。采用Stata 18版进行意向性治疗分析，使用Cox比例风险模型，按新生儿重症监护室（NICU）分层，以年龄为基础时间，使分析对年龄进行控制，同时对双胞胎或三胞胎之间的生存相关性进行方差调整，并在失访时进行删失。在Kaplan-Meier分析和图表中，对预先设定的二项式协变量（早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗接种、性别、院内出生或院外出生状态、季节（雨季或旱季）以及母亲卡介苗疤痕）进行了比例风险检验。我们使用分数多项式评估了连续变量（胎龄和体重）中非线性关系的可能性。Cox模型的比例风险假设通过Stata中带有log（时间）的时变协变量命令进行检验，并使用Schoenfeld残差、log-log图和单独估计的Kaplan-Meier曲线。Kaplan-Meier生存曲线以入组后的时间为基础时间。我们未对次要结局的95%置信区间（CI）和P值进行多重性调整。使用Stata的metan命令进行当前的荟萃分析，采用随机效应模型，搜索词列于补充文件的S13部分。
患者与公众参与
由于缺乏必要的资金和人员，没有家庭或公众成员参与该试验的实施。
结果
在三家研究性新生儿重症监护室收治的7067名出生体重<2000克的新生儿中，有1647名根据方案标准被排除。总体而言，5420名新生儿被随机分组（图1）：2714名进入早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗组，其中238名（8.8%）死亡；2706名进入对照组，其中273名（10.1%）死亡。由于母亲的卡介苗疤痕对死亡率无统计学显著影响，在出现510例死亡后停止入组。新冠肺炎疫情以及丹麦株卡介苗偶尔短缺，延缓了试验的进行。表1显示了参与者的基线特征。
| 特征 | 早期BCG-OPV（n=2714） | 对照组（n=2706） |
|---|---|---|
| 性别： | ||
| 男性 | 1389（51） | 1382（51） |
| 女性 | 1325（49） | 1324（49） |
| 入组时的中位年龄（四分位距）（天） | 0.86（0.54-1.46） | 0.86（0.56-1.38） |
| 中位数（四分位距）出生体重（克） | 1560（1320-1745） | 1560（1320-1745） |
| 出生体重（克）： | ||
| <1000 | 133（5） | 129（5） |
| 1000-1499 | 996（37） | 994（37） |
| 1500-1999 | 1585（58） | 1583（58） |
| 中位数（四分位距）妊娠期（周） | 33.4（31.7-35.4） | 33.6（31.7-35.4） |
| 早产（<37周） | 2374（87） | 2349（87） |
| 平均（标准差）阿普加评分： | ||
| 1分钟 | 6.71（1.52） | 6.76（1.48） |
| 5分钟 | 8.04（1.13） | 8.06（1.11） |
| 在研究医院出生 | 2460（91） | 2454（91） |
| 母亲的卡介苗疤痕 | 1601（59） | 1658（61） |
| 阴道分娩 | 1523（56） | 1476（55） |
| 双胞胎或三胞胎 | 210（7.7） | 197（7.3） |
| 雨季出生 | 1431（53） | 1425（53） |
| 研究医院： | ||
| JIMPER | 1440（53） | 1432（53） |
| 儿童健康研究所暨儿童医院（钦奈） | 252（9.3） | 249（9.2） |
| IOG | 1022（38） | 1025（38） |
ICH=钦奈儿童健康研究所及儿童医院；IOG=钦奈妇产科研究所；IQR=四分位距；JIMPER=本地治里贾瓦哈拉尔研究生医学教育与研究学院；NICU=新生儿重症监护室；OPV=口服脊髓灰质炎疫苗；SD=标准差。
在早期接种组的2463名约6周龄儿童中，有2398名（97.4%）对卡介苗出现了可见的皮肤反应（见补充表S1）。卡介苗未发现严重副作用，特别是未出现腋窝溃疡或播散性卡介苗感染。
10名婴儿出现了方案违背情况。在早期接种组中，4名婴儿接种的是俄罗斯卡介苗（印度血清研究所），而非丹麦卡介苗（均未死亡）；2名婴儿因被认为病情过重而未接种（均死亡）；1名婴儿被录入两次（但仅分析一次）；所有这些婴儿在分析中均被纳入早期接种组。在对照组中，1对双胞胎中的1名和1对三胞胎中的1名与他们的兄弟姐妹被单独随机分组，还有1名婴儿最初被记录为男性，实际为女性。
对分数多项式幂的检验表明，出生体重无需转换，但对于胎龄，应使用（10/胎龄）²。剖宫产、母亲的卡介苗疤痕、是否为院内出生或院外出生以及季节对Cox模型无影响，因此，以年龄为基础时间的最终模型包括早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗、性别、出生体重和转换后的胎龄，并按新生儿重症监护室（NICU）分层，同时对多胎出生的方差进行了调整（表2）。在Cox模型中，未发现卡介苗与其他变量之间存在统计学意义上的交互作用。早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗、性别、出生体重和转换后的胎龄均满足比例风险假设。
| 死亡率（死亡数/总人年）；否 | 调整后的风险比（95%置信区间） | P值* | ||
|---|---|---|---|---|
| 早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗 | 对照组 | |||
| 28天内死亡（主要结局） | 1.29（238/184）；2714 | 1.50（273/182）；2706 | 0.83（0.69至0.98） | |
| 感染导致的死亡 | 0.40（73/184）；2707 | 0.73（133/182）；2702 | 0.53（0.40至0.70） | <0.001 |
| 非传染性原因导致的死亡 | 0.89（164/184）；2707 | 0.77（139/182）；2702 | 1.10（0.88至1.39） | 0.41 |
| 院内死亡 | 2.33（237/102）；2714 | 2.69（269/100）；2706 | 0.83（0.70至0.99） | 0.04 |
| 28天内死亡；当在28天内接种卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗时，对照组数据被截尾（原始主要结局） | 1.29（238/184）；2714 | 2.25（273/121）；2706 | 0.78（0.65至0.93） | 0.006 |
| 符合方案分析 | 1.28（236/184）；2702 | 2.26（275/122）；2709 | 0.77（0.65至0.92） | 0.004§ |
| 入组后的死亡时间（天）： | ||||
| 0-2 | 2.53（56/22.1）；2714 | 3.41（75/22.0）；2706 | 0.72（0.51至1.03） | 0.07¶ |
| 3-6 | 3.48（99/28.4）；2658 | 4.13（116/28.1）；2631 | 0.84（0.64至1.10） | 0.21¶ |
| 7-27 | 0.62（83/134）；2553 | 0.62（82/132）；2512 | 0.91（0.67至1.24） | 0.55¶ |
CI=置信区间；OPV=口服脊髓灰质炎疫苗。
* 采用按新生儿重症监护病房分层的Cox回归分析，并对年龄、出生体重、胎龄和性别进行了调整。早期BCG-OPV组有6名婴儿，对照组有3名婴儿在28日龄前失访，并从最后一次接触时开始删失数据。
† 次要结局未进行多重性校正。
‡ 这是有偏估计，因为已接种疫苗的对照组中从出院到28天的低风险时间段被排除了。
§ 这是有偏估计，因为从接种对照组中剔除了出院至28天的低风险时间段，且在符合方案分析中，有两名死亡婴儿被随机分配至卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗组，但因被认为病情过重而未接种疫苗，随后被从卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗组移至对照组。
预先指定的描述性结局未进行多重性调整。
根据数据和安全监测委员会的建议，在主要分析中，对照组未对28日龄前接种的卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗进行 censored（表2）。在主要Cox模型中，与对照组相比，早期接种在28日龄前死亡的校正风险比为0.83（95%置信区间0.69至0.98；P=0.03）。图2显示了两个研究组的死亡概率。预防1例死亡所需治疗的人数为21（95%置信区间10至245）。
体重＜2000克新生儿入组后28天内的Kaplan-Meier生存概率。数值未按年龄、性别、出生体重、孕周或多胎情况进行调整。婴儿在28日龄前死亡或失访前均处于风险中。阴影部分代表95%置信区间。CI=置信区间；OPV=口服脊髓灰质炎疫苗
对照组的2706名新生儿中，1588名（59%）在出生28天前接种了丹麦株卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗，在28天前出院的1423名婴儿中，接种时间中位数为出院前4.5小时。
表3显示了从出生和入组到卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗接种、死亡和出院的时间。早期接种组有6名新生儿，对照组有3名新生儿在28日龄前失访；其余5411名婴儿的28日龄存活率通过随访或电话确定。表4显示了死亡原因。
| 早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗；否 | 对照组；否 | |
|---|---|---|
| 出生到入学 | 0.86（0.54-1.46）；2714 | 0.86（0.56-1.38）；2706 |
| 出生至接种疫苗 | 0.93（0.58-1.68）；2712 | 12.6（7.76-20.0）；1588 |
| 从出生到死亡 | 6.41（4.24-11.3）；238 | 5.99（3.95-9.91）；273 |
| 出生至出院 | 11.8（7.75-17.5）；2005年 | 12.0（7.78-18.0）；2010年 |
| 疫苗接种登记 | 0.03（0.01-0.07）；2712 | 11.8（6.96-18.9）；1588 |
| 入组至死亡 | 5.08（3.14-9.59）；238 | 4.65（2.80-8.23）；273 |
| 从入组到出院 | 10.2（6.27-16.2）；2005年 | 10.5（6.29-17.0）；2010年 |
OPV=口服脊髓灰质炎疫苗。
| 早期BCG-OPV（n=2714） | 对照组（n=2706） | 卡介苗对照率 | 总计 | |
|---|---|---|---|---|
| 感染 | 73（31） | 133（49） | 0.55* | 206（40） |
| 透明膜病 | 82（34） | 64（23） | 146（29） | |
| 脑室内出血 | 22（9） | 18（7） | 40（8） | |
| 坏死性肠炎 | 6（3） | 4（1） | 10（2） | |
| 先天性畸形 | 3（1） | 0（0） | 3（1） | |
| 窒息 | 10（4） | 1（0） | 11（2） | |
| 其他 | 41（17） | 52（19） | 93（18） | |
| 未知 | 1（0） | 1（0） | 2（0） | |
| 总死亡人数 | 238（100） | 273（100） | 511（100） |
OPV=口服脊髓灰质炎疫苗。
由于早期BCG-OPV组和对照组的百分比都必须加起来达到100%，因此早期BCG-OPV组中因感染导致的死亡比例较低，这意味着早期BCG-OPV组中非感染性死亡的比例总体上必然高于对照组。
例如，对于感染，（73/2714）/（133/2706）=0.55（调整后的风险比为0.53，95%置信区间为0.40至0.70）。
早期接种组与对照组相比，感染导致死亡这一次要结局的调整后风险比为0.53（95%置信区间0.40至0.70）；该置信区间未进行多重性调整（表2）。早期接种组2707名婴儿中，感染导致的粗死亡率为73例（2.7%），对照组2702名婴儿中为133例（4.9%），调整后的需治疗人数为7（95%置信区间4至15）。在206例因感染死亡的婴儿中，90例（44%）的血培养结果显示微生物阳性：早期接种组73例婴儿中有23例（32%），对照组133例婴儿中有67例（50%）（见补充表S2）。肺炎克雷伯菌在早期接种组的分离株中占9.6%（7/73），在对照组中占31%（41/133）；事后比值为0.31（95%置信区间0.15至0.66），P<0.001。没有死亡病例由结核病导致。
表5显示了早期接种的调整效应与8个预先指定变量之间的交互作用；这些交互作用均无统计学意义。补充文件包含按月份统计的死亡率（见补充表S3）、按性别统计的从随机分组到死亡的天数（表S4）、按入组年龄统计的死亡率（表S5）、按母亲卡介苗疤痕和性别统计的死亡率（表S6）、按母亲卡介苗疤痕以及是否为宫内或宫外出生统计的死亡率（表S7）、约6周龄时的卡介苗皮肤反应（表S1和S8）、死亡婴儿的血培养结果（表S2）以及口服脊髓灰质炎疫苗的类型（表S9）。
| 死亡率（死亡数/总人年）；否 | 风险比（95%置信区间）* | 与BCG-OPV相互作用的P值* | ||
|---|---|---|---|---|
| 早期卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗 | 对照组 | |||
| 出生体重（克） | ||||
| 9.67（60/6.2）；133 | 12.7（67/5.3）；129 | 0.75（0.53至1.08） | 0.81 | |
| 1.99（130/65）；996 | 2.31（148/64）；994 | 0.86（0.68至1.09） | ||
| 0.43（48/113）；1585 | 0.52（58/112）；1583 | 0.82（0.56至1.21） | ||
| 妊娠周数‡ | ||||
| 3.55（148/42）；689 | 3.82（159/42）；703 | 0.89（0.71至1.12） | 0.82 | |
| 0.69（34/49）；705 | 1.24（56/45）；662 | 0.56（0.37至0.87） | ||
| 0.56（26/47）；664 | 0.56（27/49）；683 | 0.92（0.54至1.56） | ||
| 0.65（30/46）；656 | 0.67（31/46）；658 | 0.95（0.58至1.57） | ||
| 成熟度（周） | ||||
| 早产（<37） | 1.43（228/160）；2374 | 1.62（254/157）；2349 | 0.84（0.70至1.01） | |
| 足月（≥37） | 0.41（10/24）；340 | 0.76（19/25）；357 | 0.63（0.29至1.36） | |
| 性别 | ||||
| 男性 | 1.57（146/93）；1389 | 1.69（155/92）；1382 | 0.88（0.71至1.11） | |
| 女性 | 1.01（92/91）；1325 | 1.32（118/90）；1324 | 0.75（0.56至0.99） | |
| 出生地 | ||||
| 研究医院 | 1.22（207/170）；2460 | 1.48（246/167）；2454 | 0.81（0.67至0.97） | |
| 其他地方 | 2.12（31/15）；254 | 1.81（27/15）；252 | 0.99（0.60至1.64） | |
| 母亲的卡介苗疤痕 | ||||
| 存在 | 1.22（133/109）；1601 | 1.40（157/112）；1658 | 0.78（0.62至0.99） | |
| 缺失 | 1.40（105/75）；1110 | 1.68（116/69）；1047 | 0.89（0.69至1.15） | |
| 分娩方式 | ||||
| 剖宫产 | 1.23（100/81）；1191 | 1.24（104/84）；1230 | 0.92（0.70至1.21） | |
| 阴道分娩 | 1.34（138/103）；1523 | 1.73（169/98）；1476 | 0.77（0.61至0.96） | |
| 季节 | ||||
| 雨季：7月至12月 | 1.33（128/96）；1431 | 1.52（145/95）；1425 | 0.82（0.64至1.05） | |
| 干燥期：1月至6月 | 1.25（110/88）；1283 | 1.49（128/86）；1281 | 0.83（0.65至1.06） | |
CI=置信区间；OPV=口服脊髓灰质炎疫苗。
* 按新生儿重症监护室分层的Cox回归，并根据年龄、出生体重、胎龄和性别进行调整。
† 连续变量、体重和（10/胎龄）²与BCG-OPV对死亡率影响的相互作用。
‡ 四组，每组人数大致相等。
对四项规模较小的试验（丹麦卡介苗对几内亚比绍新生儿全因死亡率的影响）14161718以及这项在印度开展的试验进行随机效应荟萃分析，结果显示新生儿死亡率的估计值为0.77（95%置信区间0.64至0.92；P=0.004），而在出生后前三天的估计值为0.71（0.55至0.90；P=0.005）（详见补充文件的S12部分）。
讨论
在印度三家新生儿重症监护室（NICUs）开展的这项针对体重不足2000克新生儿的随机试验发现，在出生后平均0.9天接种丹麦株卡介苗（BCG）和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV），可使新生儿（≤28天）全因死亡率降低17%；且在未进行多重性调整的情况下，感染导致的死亡率降低47%。5420名婴儿中仅有9人失访。总体而言，本试验共发生511例死亡，而此前所有试验的死亡病例总和为285例。
结果解读及与其他研究的比较
与在几内亚比绍进行的四项规模较小的关于丹麦株卡介苗（BCG）接种对新生儿死亡率影响的试验一样<0>14</0><1>16</1><2>17</2><3>18</3>，我们发现一种趋势：在足月出生而非早产、院内出生而非院外出生、女性而非男性、经阴道分娩而非剖宫产出生以及母亲有卡介苗疤痕的婴儿中，接种丹麦株卡介苗联合口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）的效果更佳；然而，我们的试验并没有足够的统计效力来检测协变量的影响，且这些趋势均无统计学意义。我们的试验和在几内亚比绍开展的试验均表明，丹麦株卡介苗在接种后的头三天对死亡率有影响；这与卡介苗能快速诱导“训练性”先天免疫应答的证据相符<4>5</4><5>6</5>。来自冈比亚的最新数据显示，一些表面健康但后来会患败血症的新生儿存在基因表达异常<6>30</6>；结合丹麦株卡介苗早期接种在出生后最初几天效果最为显著的证据<7>14</7><8>16</8><9>17</9>，这些发现表明，在某些新生儿中，卡介苗可能不仅能预防败血症，还能治疗败血症。
我们的试验与在几内亚比绍进行的另外四项规模较小、设有未接种疫苗对照组、旨在测试丹麦株卡介苗（BCG）对新生儿死亡率影响的随机试验存在重要差异。14161718 首先，我们接种的疫苗剂量为0.1毫升，而非0.05毫升，且疫苗制造商不同。其次，我们的试验规模更大，共出现511例死亡，而几内亚比绍的四项试验加起来仅有285例死亡。第三，我们试验中除5例死亡外，其余均发生在新生儿重症监护室（NICU），对照组的死亡率为10.1%；而几内亚比绍的四项试验中，有三项是在新生儿出院时进行随机分组，且纳入了部分在家中出生的婴儿，其对照组的死亡率为3.7%。第四，我们研究的是体重不足2000克的高危新生儿，而几内亚比绍的试验研究的是体重最高达2500克（第四项试验中更高）的新生儿。第五，我们对照组中仅有49%的死亡由感染引起，30%由透明膜病或脑室内出血（这些疾病不太可能受卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗影响）导致，而几内亚比绍试验对照组中63%的死亡由感染引起。
在中低收入国家，足月新生儿的死亡中，很大一部分是由感染引起的31。这表明，对此类婴儿在出生时接种丹麦株卡介苗（BCG）和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV），可能对新生儿全因死亡率产生比我们试验中观察到的17%降幅更大的影响。在我们的试验中，体重<2000克的新生儿中，对照组30%的死亡是由透明膜病或脑室内出血导致的。对四项规模较小的关于丹麦株卡介苗对新生儿死亡率影响的试验14161718以及本试验进行随机效应荟萃分析后发现，低出生体重新生儿在出生后不久接种丹麦株卡介苗，全因死亡率估计降低23%（见补充表12b）。此外，在乌干达开展的一项随机试验发现，新生儿出生后不久接种丹麦株卡介苗，在6周龄前，经医生诊断的非结核性感染发生率降低了29%32。因此，有充分证据表明，无论是否联合OPV，丹麦株卡介苗都能通过预防结核病以外的其他感染来降低全因死亡率，这是一种非特异性或脱靶效应。
本研究的优势与不足
感染导致死亡这一次要结局在原始方案中并未明确规定，但在试验进行到三分之一时，根据数据和安全监测委员会的建议被加入，因为在几内亚比绍针对新生儿开展的丹麦卡介苗研究表明，卡介苗降低的是感染性原因导致的死亡率，而非非感染性原因导致的死亡率，17 这一发现得到了后续两项研究的支持。1828 在我们的研究中，感染是预先指定的死亡原因之一。我们采用了新生儿感染的标准定义，29 其有效性得到了血液培养结果呈阳性的新生儿比例较高这一情况的支持：在206例因感染死亡的婴儿中，有90例（44%）的血液培养结果呈阳性（见补充表2），其中早期接种组73例婴儿中有23例（32%），对照组133例婴儿中有67例（50%）。
由于卡介苗（BCG）引起的皮肤损伤很明显，因此无法进行双盲试验，因为在这些高危婴儿入住重症监护室期间，一直遮盖其上臂是不符合伦理的。此外，我们不希望对照组的婴儿错过接种卡介苗的机会，因为母亲们可能会认为自己的孩子已经接种过了。缺乏盲法不太可能影响结果：我们之前两项采用印度血清研究所生产的俄罗斯卡介苗（联合或不联合口服脊髓灰质炎疫苗）的开放标签随机试验，共涉及879例死亡病例，这些试验与本试验在相同的新生儿重症监护室开展，且设计相似，但干预组和对照组之间的新生儿死亡率没有差异（合并风险比为0.98），15 这表明具有明显皮肤反应的卡介苗接种并未对研究结果产生偏倚。
在我们的试验中，早期接种卡介苗（BCG）时同时接种口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）可能有助于降低死亡率，但这种可能性不大，因为在我们早期的试验中，接种俄罗斯株卡介苗时同时接种口服脊髓灰质炎疫苗并未观察到死亡率降低（调整后的风险比为1.01），这与未接种口服脊髓灰质炎疫苗的俄罗斯株卡介苗组调整后的风险比0.95相近。15 不过，有可能口服脊髓灰质炎疫苗会增强具有活性的卡介苗菌株的非特异性效应，而当与几乎没有或完全没有非特异性效应的卡介苗菌株同时接种时，则无此作用。在试验期间，世界卫生组织（WHO）对丹麦株卡介苗（由GreenSignal生物制药公司生产）和口服脊髓灰质炎疫苗（由巴拉特免疫与生物制品公司生产）的生产标准提出了担忧，但未发现严重的副作用，且出生后不久同时接种这两种疫苗的婴儿死亡率有所降低。尽管卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗组接种的皮内剂量为0.1毫升，是世界卫生组织推荐剂量的两倍，但在试验中未发现严重的副作用。33
总体而言，对照组2706名婴儿中，有1588名（59%）在即将出院时或之后接种了卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗，因此，住院期间的死亡情况比较了出生后不久接种卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗与对照组中大部分未接种疫苗时期的情况，经风险调整后的住院期间死亡风险比为0.83，这与未对对照组中28天前接种卡介苗-口服脊髓灰质炎疫苗进行截尾处理的、28天内死亡的主要终点0.83相同。这表明对照组中28天前的高接种率并未影响本试验的结果。
对政策和未来研究的启示
我们的研究结果提供了额外证据，表明不同的卡介苗（BCG）菌株可能具有不同的非特异性效应，且丹麦株卡介苗的非特异性效应可能比俄罗斯株更强。1020 我们之前的两项大型随机试验发现，不联合口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）的0.05毫升皮内注射俄罗斯株卡介苗（印度血清研究所生产），以及联合OPV的0.1毫升剂量，对新生儿死亡率均无统计学显著影响（合并调整后的风险比为0.98）15；本试验在上述试验后不久开展，在相同的新生儿重症监护室（NICUs）进行，由相同的工作人员参与，采用相似的试验设计，结果显示联合OPV的丹麦株卡介苗与新生儿死亡率显著降低17%相关。这些发现表明，迫切需要对不同卡介苗菌株进行直接对比研究。10
在结核病高发地区，世界卫生组织（WHO）建议对胎龄＜37周或出生体重＜2500克的新生儿接种卡介苗（BCG），前提是胎龄＞31周且婴儿健康、临床状况稳定。33 然而，在我们的试验中，20%的新生儿胎龄≤31周，且均不健康或临床状况不稳定。我们的研究结果表明，无论胎龄如何，状况不稳定且病情严重的新生儿在出生后尽早接种丹麦株卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV）能获得显著益处。因此，世界卫生组织应考虑修改其建议。此外，为增加新生儿出生后不久接种卡介苗的数量，世界卫生组织的卡介苗接种指标应从12月龄时的接种率改为1月龄时的接种率，甚至1周龄时的接种率。
结论
结合在几内亚比绍开展的四项随机试验、乌干达的试验以及我们的研究结果，表明在结核病流行国家全面实施世界卫生组织（WHO）的出生时卡介苗（BCG）接种政策，可能会大幅降低新生儿死亡率。然而，目前这种潜在益处的很大一部分并未得到发挥。首先，75%的新生儿死亡发生在出生后第一周，但在结核病流行国家，只有37%的新生儿在出生后1周内接种了卡介苗；因此，只有当10-12名婴儿需要接种时才打开一瓶卡介苗的常规做法应该改变，即便只有一名儿童需要接种，也应打开一瓶卡介苗。其次，很大比例的卡介苗剂量——2014年为71%——是俄罗斯株卡介苗，其效果可能不如丹麦株和日本株。第三，许多接种过卡介苗的婴儿并未形成卡介苗瘢痕，这表明在高负担国家，常规的卡介苗免疫接种往往未能实现皮内注射，考虑到新生儿皮肤较薄，这是一项具有难度的操作。这表明，如果高死亡率地区的大部分新生儿能在出生后第一周内由熟练的接种人员接种卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗（OPV），且或许使用丹麦株或日本株卡介苗而非俄罗斯株卡介苗，那么新生儿死亡率可能会大幅降低。
关于该主题的已知信息
观察性研究和随机试验表明，出生后不久接种丹麦株卡介苗可能会降低新生儿因结核病以外的感染导致的死亡率。
在几内亚比绍对新生儿进行的三项丹麦卡介苗试验中，未发现其对主要结局有统计学显著影响——其中两项试验的主要结局是婴儿出生后第一年的死亡率，一项试验的主要结局是婴儿出生后第一个月的死亡率；然而，荟萃分析显示，该疫苗降低了婴儿出生后第一个月的死亡率。
在几内亚比绍进行的另外两项关于丹麦或日本卡介苗菌株的试验因招募缓慢而提前终止，而在印度进行的两项大型俄罗斯卡介苗试验未发现其对新生儿死亡率有影响。
本研究的新增发现
在这项随机对照试验中，出生后48小时内接种丹麦株卡介苗和口服脊髓灰质炎疫苗，降低了体重不足2000克的重症新生儿的死亡率，需要治疗21名新生儿才能预防1例死亡（95%置信区间为10至245）。
对于结核病高发地区，世界卫生组织（WHO）应考虑建议所有新生儿在出生后尽快接种卡介苗，而不仅限于健康、临床状况稳定且胎龄超过31周的新生儿。
为降低中低收入国家的新生儿死亡率，即使只有一名婴儿需要接种，也应打开一瓶卡介苗，并且世界卫生组织（WHO）的卡介苗及时接种指标应从12个月龄改为28日龄。
伦理声明
伦理批准
在每个研究中心开始随机分组前，该试验已获得贾瓦哈拉尔研究生医学教育与研究学院伦理及科学咨询委员会的批准（编号：JIP/IEC/2016/25/831）；针对儿童健康研究所及妇产科研究所，试验则获得了马德拉斯医学院机构伦理委员会的批准（编号：02052018）。该试验方案已前瞻性地在印度临床试验注册中心注册（编号：CTRI/2017/01/007676）。
数据可用性声明
Stata统计分析代码包含在补充文件中。去标识化的个体患者数据存储在https://doi.org/10.7303/syn68349250，在synapse.org注册后可完全访问。
致谢
我们感谢已故的V·纳马奇瓦亚姆（库达洛尔的儿科医生）在协助开展BLOW试验方面提供的宝贵帮助。我们还要感谢A·纳韦娜（金奈）和M·K·普马尼（金奈），以及本地治里的贾瓦哈拉尔研究生医学教育与研究学院新生儿科、金奈的儿童健康研究所及儿童医院、金奈的妇产科研究所的医护人员。
脚注
贡献者：BA、BM、BVB、CK、FS、KJ、MS和SPN构思了本试验，并参与了试验设计和方案制定。BA、CK、BVB、SPN、FS和MS担任项目管理员。FS、BM和PDR负责数据整理和数据验证。在FS的协助下，BM编写了用于确定合格性、分配治疗以及记录人口统计学和结局数据的计算机程序。PDR在Jawaharlal研究生医学教育与研究学院开展试验，由BVB和BA监督；CK在儿童健康研究所监督试验人员；MS在妇产科研究所监督试验人员。BA、CK、BVB、MS、SPN和FS负责资源分配。独立的数据安全与监测委员会提供监督。FS直接获取并核实数据，FS和SPN进行统计分析并撰写了论文初稿。所有作者均审阅了手稿并提出修改建议。所有作者均可获取完整的试验数据和Stata分析文件。所有作者均阅读并批准了手稿的最终版本，并共同负责决定投稿发表。FS和SPN为担保人。通讯作者证明所有列出的作者均符合作者资格标准，且没有遗漏其他符合标准的人员。
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