Comparison of protection against mpox following mRNA or modified vaccinia Ankara vaccination in nonhuman primates
图形摘要
关键词
介绍
Mpox病毒(MPXV)是一种来自正痘病毒属的人畜共患病毒，它还包括天花病毒(VARV)，天花病毒是天花疾病的病原体，估计在1980年根除天花之前死亡率为30%。1第一例人类感染MPXV是在1970年在刚果民主共和国(DRC)发现的，2这种病毒可分为两个分支:一个是毒性分支I毒株，致死率约为10%,另一个是第二分支II毒株，致死率约为< 1 %- 3 %,具体取决于爆发和毒株。3自从被发现以来，MPXV已经与西非和中非反复发生的小规模流行病爆发联系在一起。然而，在过去几十年里，这些疾病的爆发频率增加了，很可能是由于人群对天花的免疫力下降。4此外，在2022年夏天，MPXV的一个分支II菌株从传统的流行区域溢出并在全球传播，导致超过90，000例mpox病例和170例死亡。5病毒传播的缓解主要通过社会对策实现，如教育和社区参与以缓解传播，以及使用治疗药物(如tecovirimat)和当代改良的安卡拉(MVA)痘苗疫苗(JYNNEOS)，在现实世界的研究中，单剂后提供35%至75%的保护，两剂后提供66%至85%的保护。6,7,8,9此外，clade I病毒于2023年在刚果民主共和国爆发，并已蔓延至中非，造成大量死亡，2024年8月报告了500多人死亡，病死率约为2.9%。10尽管JYNNEOS疫苗对mpox有效，但供应问题，11不利的反应原性，11不完全免疫，11和对毒性更强的毒株的交叉保护的不确定性为开发潜在的新疫苗模式提供了关键的动力，以改进疫苗来弥补这些差距。8,11
在新兴的疫苗平台中，mRNA疫苗提供了前所未有的灵活性、速度和免疫原性。12,13然而，mRNA疫苗是否能提供与全减毒痘病毒疫苗载体相当的免疫保护仍不清楚。在对保护性痘苗病毒(VACV)诱导的免疫反应进行深度免疫分析后，定义了四种明确的正痘病毒蛋白靶标。14,15所选抗原中的两种存在于细胞外病毒体(EVs)上，两种存在于成熟病毒体(MV)表面上，所有这些抗原都参与病毒附着和感染，并且已经证明当作为蛋白质或DNA疫苗递送给鼠、兔和猕猴模型时，它们能够提供保护。14,15虽然单个抗原实现了有限的保护，但是四种抗原A29、A35、B6和M1的组合提供了最佳的保护16,17和保护非人灵长类动物(NHPs)免受静脉注射(IV) MPXV攻击。18此外，针对这些靶标的单克隆抗体在小鼠中提供了保护，并且B细胞的减少，而不是CD4+或CD8+ T细胞的减少，取消了保护，突出了体液免疫反应对保护的关键作用。18,19沿着这些路线，用相同的四种关键MPXV EV/MV抗原进行mRNA疫苗接种导致了针对异源VACV感染的保护，与强大的中和和Fc效应子功能相关。20然而，mRNA疫苗是否能够提供针对致命MPXV病毒的保护以及减轻疾病仍然不清楚。
在这里，我们利用一个严格的进化枝I MPXV扎伊尔1979 (Z79) MPXV NHP攻击模型来评估mRNA-脂质纳米粒(LNP)疫苗mRNA-1769的保护效力，与MVA相比，该疫苗表达了四种MPXV相关抗原(A29、A35、B6和M1)的优化版本。20,21临床相关剂量用于施用mRNA和MVA疫苗。虽然MVA和mRNA-1769在致死性MPXV攻击后提供了完全的保护，但mRNA免疫的动物经历了10倍的损伤减少，疾病持续时间减少，以及mRNA队列中循环和粘膜病毒血症的显著缓解。与MVA免疫的NHPs相比，通过经典的结合和中和试验以及系统血清学方法对体液反应进行深入的免疫学分析，揭示了在mRNA-1769免疫的动物中，针对四种MPXV抗原的更强的MPXV中和反应、广泛反应性的异源中和滴度以及更强的功能性体液免疫反应。此外，免疫相关性分析强调了针对EV和MV靶标的中和和Fc效应子功能之间的关键协调，EV-Fc靶标特异性功能和中和是抗病毒控制的关键相关性，EV靶标抗原特异性调理吞噬细胞活性和中性粒细胞/自然杀伤(NK)细胞靶向MV的功能是病变控制的关键决定因素。这些发现表明，表达四种关键MPXV蛋白的mRNA-LNP疫苗诱导了强大的功能性体液应答，类似于MVA免疫，可以抵抗致命的MPXV攻击，但提供了更好的疾病保护，这意味着在旨在保护免受新出现的正痘病毒威胁的当代疫苗库中还有改进的空间。
结果
基于mRNA的疫苗和MVA疫苗在致死性NHP mpox病毒感染模型中的功效
在史无前例的2022年全球mpox疫情期间，MVA疫苗(JYNNEOS)的快速部署为高危人群提供了快速保护。7,22虽然疫苗减少了传播，减轻了疾病、疫苗生产和不完全保护性免疫的负担11强调了开发下一代疫苗的潜在需求。与表达所有病毒抗原的复制缺陷型JYNNEOS疫苗不同，基于蛋白质和核酸的疫苗专注于在MV和EV上表达的病毒表面抗原的子集，这些抗原在所有旧世界正痘病毒中高度保守。23重要的是，四种特异性抗原的组合对于实现完全保护是必不可少的，24以及这四种抗原(MV:，A29和M1；EV、B6和A35图1a)导致针对异源致死VACV攻击的近乎灭菌的保护。20然而，与MVA相比，这种疫苗是否可以在灵长类动物模型中提供针对致死性MPXV攻击的保护并改善疾病仍然没有完全确定。
图1 在NHP模型中，mRNA疫苗诱导对致死性MPXV攻击的较好保护
(A)说明本研究中使用的疫苗的差异。改良的痘苗病毒(MVA)是一种减毒活病毒，而mRNA-1769包含四种mRNA分子，每种表达一种正痘病毒表面蛋白。PDB模型3VOP、1YPY和3K7B用于代表感兴趣的抗原。
(B)NHP免疫和激发期的研究设计以周(W)为单位，免疫通过肌肉内进行，激发通过静脉内进行(n= 6/组)。
(C)每组在挑战期的存活百分比(n= 5–6个/组)。
(D)每组每只动物的MPXV病变数显示为平均值的平均标准误差([SEM])；n= 5–6个/组)。
(mpox疾病的持续时间显示了每只动物在攻击期间的持续时间，并记录了损伤出现和消退的日期。安乐死的日期用一个头骨符号表示。
(F)通过定量PCR收集每毫升全血的基因组计数(估计的噬斑形成单位[PFUs])，并通过噬斑试验从攻击期间获得的样品评估咽拭子的PFU。报告每组的平均SEM(n= 5–6个/组)。
请参见图S1.
因此，在用MPXV进化枝I Z79进行致死性攻击后，在食蟹猴中测试了mRNA-LNP MPXV疫苗mRNA-1769与减毒正痘病毒活疫苗(MVA)的保护效力和疾病调节活性。将动物随机分成3组，每组6只动物，用150μg mRNA-1769、100M MVA噬斑形成单位(PFUs)进行免疫，或者以初次加强的方式给予生理盐水对照(PBS ),免疫间隔为4周(图1b)。鉴于粘膜攻击途径表现出向病变严重疾病的延迟进展，并提供较低的保护水平，在此我们选择进行静脉内攻击，模拟类似于在人类中观察到的病毒爆发动力学。25,26此外，用IV激发观察到的更可靠的疾病病理学使得能够更严格地比较mRNA提供的保护作用，这是第一次与MVA相反。因此，在用50m pfu的MPXV Z79进行静脉注射攻击之前，每2周从动物中收集血清。每天观察动物的疾病进展迹象和损伤计数。在感染期间，每隔一天采集咽拭子和全血。在研究结束前达到预定生存能力标准的动物被人道地安乐死。mRNA免疫组中的一只动物在攻击前没有从麻醉事件中恢复，并且不包括在该研究的攻击部分中。
接受MVA和mRNA-1679的动物完全免于MPXV Z79感染的致死性，而PBS组中六个nhp中的五个死于感染(图1c)。从攻击时开始跟踪体重，以PBS组中的显著体重减轻、MVA免疫动物中的体重保持以及mRNA臂中的体重增加为标志(图S1a)。MPXV病变数被用作疾病负担和发病率的关键指标，在感染过程中PBS组显著增加，峰值平均病变数为1，448(图1d)。相对于对照组动物，MVA免疫组动物的病变计数减少，该组动物的平均最大病变计数为607。相比之下，mRNA免疫的动物在感染期间每个NHP显示最少的损伤，峰值平均损伤计数为54。鉴于世界卫生组织(世卫组织)将每个个体的严重疾病分类为大于100个病变，将严重疾病分类为大于250个病变，所有PBS对照动物都经历严重疾病，并且MVA组中六分之四的动物表现出严重疾病，所有其他动物都表现出严重疾病(图S1c)。相比之下，mRNA免疫组的所有动物都没有达到严重疾病的标准。
图S1 NHP模型中mpox病毒攻击后的观察数据，与图1
疾病的持续时间也作为损伤开始到消退的函数进行测量，并为每只动物绘制图表(图1e)。当将MVA免疫的动物与接受mRNA疫苗的动物相比时，疾病的持续时间减少了10天以上(图S1b)。此外，在感染过程中的病毒负荷通过用于直接传染性病毒测量的咽拭子噬菌斑测定的评估来确定(图1f)和全血病毒血症(qPCR看见图S1d)。对照组动物表现出明显的病毒负荷，在感染后第11天血液病毒血症中病毒负荷达到峰值，存活动物的病毒负荷降低，直到研究期结束。与PBS处理的动物相比，MVA免疫的动物表现出血液病毒血症中的病毒载量和咽喉中的传染性病毒减少；然而，在MVA免疫的动物中，病毒载量增加，直到感染后第7天，此后血液和咽喉中的病毒载量下降，直到感染后第3周。接受mRNA-1769疫苗的NHPs显示出对血液和咽喉感染的优异控制，在快速控制之前，在血液中的第11天和在咽喉中的第13天有轻微反弹。因此，总的来说，虽然MVA和mRNA-1769都提供了针对致死性MPXV攻击的强大保护，但mRNA-1769提供了针对体重减轻、损伤数目、损伤持续时间以及咽喉和血液中病毒复制的优异保护。
跨疫苗模式的不同结合和中和抗体反应
为了开始定义两种疫苗平台的免疫学差异，以解释疾病负担的差异，我们接下来分析了加强免疫后2周免疫原性峰值时动物组的体液免疫应答。首先分析结合抗体与mRNA-1769中所含抗原的代表性，所述mRNA-1769来源于MVA MPXV进化枝II的当代2022株或VARV的印度1967株(图2一，S2和S2B)。对于所有测试的抗原，mRNA组的抗体应答显著高于MVA和PBS组。MVA组中的两种NHPs引发了针对MPXV B6和VACV B5的可检测的抗体反应。MVA免疫的动物确实引发了A33、B5和L1的抗-VARV抗原应答，该应答高于对照免疫动物设定的背景。此外，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测试了针对MVA裂解的全病毒制剂的抗体反应，以确定总体病毒体结合滴度(数字S2c和S2D)。尽管MVA免疫的动物暴露于完全匹配的病毒，但mRNA-1769免疫的动物与裂解的全病毒的结合滴度仍然显著最高。
图2 用编码MPXV抗原的mRNA-LNP疫苗免疫可产生强有力的广泛的体液反应
(A)在引发后第40天评估针对源自MPXV、VACV或VARV的抗原的IgG结合滴度。数据显示为每个样品的平均中值荧光强度，一式两份。横条代表组几何标准偏差的几何平均值(n= 6/组)。
(B和C)使用蚀斑减少中和试验，以单份或两份显示每只动物的百分之五十中和滴度。对于表达GFP的VACV和CPXV菌株，利用的是GFP荧光细胞数量的减少，而不是病毒噬斑的减少。在存在抗MV单克隆抗体的情况下进行VACV EV中和，以仅评估EV特异性反应。条形图代表每组的平均标准差(n= 6/组)。
(D)显示了每只动物的所有抗体结合和中和数据的热图。通过减去每种分析物的免疫前反应的平均值，对值进行背景校正。使用带有Tukey多重比较校正的单向ANOVA进行统计检验(∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, and ∗∗∗∗p < 0.0001).
请参见图S2.
图S2 免疫学测量，如每个抗原对完整的、裂解的MVA病毒体的IgG结合滴度，或中和作用，涉及图2
(A和B)在感染前的所有血清学时间点，通过多重Luminex测定法测定所有(A) MPXV和(B) VACV衍生的重组蛋白的抗体结合滴度。显示了每组的几何平均滴度几何标准差(n= 6/组)。检测的检测限(LOD)用虚线表示。
(C–F)使用ELISA测定抗体结合滴度，使用完整的裂解MVA作为包被试剂，用于在初次免疫后第40天收集的血清。显示了每组的(C)原始结合曲线或(D)曲线下面积值(n= 6/组)。在感染前的所有血清学时间点，通过蚀斑减少中和试验测定MPXV菌株(1979年扎伊尔进化枝I和(2003年美国进化枝2的抗体滴度。(E和F)检测的检测限(LOD)用阴影框表示。
(G)使用GFP报告痘苗病毒株Western Reserve通过减少GFP阳性细胞来确定中和滴度。显示了每组的几何平均滴度几何标准差(n= 6/组)。采用Tukey多重比较校正的单向ANOVA(∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, and ∗∗∗∗p < 0.0001).
为了进一步分析疫苗诱导的抗体的功能潜力，我们接下来利用攻击前的血清进行中和抗体分析(图2b)。对MPXV菌株clade I Z79和clade II USA 2003(图2b，左，和S2e)和VACV菌株西部保留地(WR；图2b，中间)，其也被测试为高通量表达绿色荧光蛋白(GFP)的VACV，以与传统的PRNT分析进行比较。还进行了在补体和单克隆抗体存在下进行的PRNT测定以去除MV，以评估EV特异性抗体应答对中和的贡献(图2b，右)。mRNA免疫的NHPs引发强烈的中和滴度，其明显高于MVA或PBS接种任何测试病毒引发的滴度。MVA免疫没有引起对任一测试的MPXV的中和抗体反应，除了一只动物，其略高于检测限。对于用VACV WR进行的PRNT试验，也观察到了类似的结果，尽管这种病毒的GFP表达型确实检测到了高于背景的VACV中和反应，但在统计学上没有显著高于PBS免疫的反应。在MVA免疫后，在一半的免疫动物中观察到EV特异性中和反应，但整个组与PBS组没有显著差异。相比之下，所有mRNA免疫的动物都诱导了强烈的EV特异性中和抗体反应。中和反应的动力学证明了在用mRNA-1769(数字S2e–S2G)。此外，对另外的正痘病毒株进行中和试验，以测试疫苗诱导的免疫反应的广度(图2c)。在PRNTs中使用了兔痘病毒、骆驼痘病毒和鼠痘病毒。此外，表达GFP的牛痘病毒株被用于微中和试验。在用mRNA-1769免疫的动物中观察到针对每种异源病毒株的强烈中和反应，而用MVA免疫的动物与用PBS免疫的NHP相比，对任何病毒的滴度没有显示出统计学上显著的增加。此外，所有抗体测量的整合强调了跨3组动物的正痘病毒特异性免疫的明显梯度，在MVA免疫的动物中，中间水平的抗体主要靶向VACV抗原，在mRNA免疫的猕猴中，交叉反应性结合滴度和中和抗体应答(图2d)。这些数据表明，在mRNA-1769免疫的动物中诱导了强有力的、广泛交叉反应性的体液免疫应答，这可以解释不同组之间的不同抗病毒控制以及保护多种正痘病毒的潜力。
不同疫苗形式的抗体Fc-效应子谱不同
除了中和抗体在针对痘病毒的抗病毒保护中的作用之外，额外的抗体功能，包括抗体介导的补体激活，27受到了保护。因此，尽管MVA诱导了低水平的中和作用，我们接下来使用系统血清学(图3a–3D)。在mRNA免疫的动物中观察到NK细胞活化(ADNK ),尽管仅限于在PBS和MVA免疫的动物中的4种抗原中没有观察到ADNK活性(图3a)。在mRNA免疫的动物中观察到针对A35、B6和M1抗原的可检测的NK细胞脱颗粒、干扰素-g (IFNg)释放和巨噬细胞炎性蛋白-1 (MIP1b ),对A29抗原的ADNK活性二分法(数字S3a–S3D)。虽然在PBS和MVA免疫的动物中观察到有限的抗体依赖性补体沉积(ADCD ),但在所有动物中观察到ADCD反应具有相同的动力学和针对A35、B6和M1抗原的强峰值免疫滴度(图3b)。与对ADNK观察到的相似，半数mRNA免疫的动物对A29抗原产生ADCD反应。类似地，在mRNA免疫的动物中，针对所有4种抗原的抗体依赖性细胞单核细胞吞噬(ADCP)反应，观察到了强有力但略微延迟的动力学(图3c)。此外，对于所有4种抗原，在mRNA组中观察到抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬作用的快速诱导，但在MVA免疫的动物中没有观察到(图3d)。
图3 fc-功能抗体活性由mRNA免疫驱动，并反映在系统血清学评估中
(A)显示了每种测试抗原的抗体依赖性补体沉积(ADCD)分析反应。第40天的反应显示为每只动物重复反应的平均值。横线代表每组的中间值。还显示了挑战前随时间变化的数据，每个点代表每组反应范围的平均值(n= 6/组)。
(B和C)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和嗜中性粒细胞吞噬作用(ADNP)测定数据显示了攻击前随时间的变化，每个点代表每组反应范围的平均值(n= 6/组)。
(D)抗体依赖性自然杀伤激活(ADNK)测定数据以用相关抗原刺激后分泌指定细胞因子的细胞的百分比报告。反应显示为每只动物重复反应的平均值，横条代表每组的中间值(n= 6/组)。使用带有Kruskal-Wallis多重比较校正的单向ANOVA进行统计检验(∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, and ∗∗∗∗p < 0.0001).
(E)系统血清学数据的热图在针对每种抗原/分析物(列)和个体动物(行)的多重Luminex测定中收集。记录每种条件和每只动物的重复荧光强度中值的平均值。
(F)使用中和和系统血清学数据进行主成分分析。每个点代表一只动物的轮廓。
请参见图S3.
图S3 攻击前时间点的fc-功能性抗体效应物反应，与图3
为了进一步观察功能性体液免疫反应的异质性，对3个疫苗组(图3e)。重要的是，虽然没有2只动物具有相同的抗体谱，但热图说明了在MVA免疫的动物中存在低水平的体液免疫应答，而在mRNA免疫的动物中存在针对MPXV、VACV和VARV抗原的更强的亚类和Fc受体结合谱。最后，为了评估各组的总体多变量抗体谱，我们将系统血清学捕获的所有亚类、同种型、Fc-受体结合和功能性抗体反应结合起来，并进行主成分分析(PCA图3f和S3e)。数据强调了所有3组动物中存在不同的抗体谱。然而，重要的是，虽然PBS对照更加均一(聚集在一起)，但在MVA免疫的动物中观察到了差异，其中有两只动物从该组中分离出来。此外，mRNA免疫的动物明显不同于PBS对照组和MVA免疫组，但也显示了个体动物之间的一些可变性。这些动物之间的差异提供了一个独特的机会来挖掘在疾病过程中影响病毒复制或病变数量的免疫相关性。
抗体与抗病毒控制和损伤预防相关
先前的NHPs天花疫苗接种后的细胞耗竭研究强调了体液免疫而非细胞免疫在对抗MPXV攻击中的关键作用。18因此，为了最终确定可以解释疾病减轻的精确体液机制，我们接下来进行了多变量相关分析(图4).具体而言，所有动物的体液免疫特征通过血液病毒载量、咽喉病毒载量和病变数量进行回归，以开始定义疫苗诱导的针对疾病不同方面的保护机制(图4a)。引人注目的是，疫苗诱导的抗体特征能够根据动物的全身病毒载量和疾病表现来有力地区分动物。
图4 中和作用、抗体滴度和功能性抗体活性与较低的病毒载量和较少的病变数量相关
(A)建立了使用LASSO+PLSR的监督多变量模型，以在给定来自结合、中和和功能性体液抗体测定的数据的情况下，鉴定与全血病毒载量相关的抗体特征的最小集合。该模型对全血qPCR数据随时间的曲线下面积(AUC)回归了抗体特征。
(B)根据动物的血液病毒血症、咽喉病毒血症或病变计数，由模型选择最大程度分离动物的最终组。
(C)还进行了相关性网络分析，以鉴定与向下选择的模型特征相关的额外抗体特征。仅与BH调整的相关性p < 0.01 and absolute rho > 0.7 were visualized.
(D)假设了一个模型，该模型总结了本研究中确定的相关性以及它们如何应用于疾病的不同功能症状。
请参见图S4.
在最小绝对收缩和选择算子(LASSO)之后进行偏最小二乘回归(PLSR ),以识别追踪系统性病毒控制的特征(图4b，左)。在收集的40多个抗体特征中，只有3个足以区分动物的病毒载量，包括VACV A33-IgG2滴度、VACV中和抗体滴度和A33-FcgR3a结合水平。这些数据表明，中和作用和EV特异性A33-Fc-受体结合活性是病毒控制的关键预测因子。类似地，VACV中和抗体滴度也与较低的咽喉病毒载量相关，但与A33-补体沉积和B5-VARV-FcgR3a协同作用，表明Fc介导的活性对两种EV抗原(图4b，中间)。通过损伤编号对疫苗诱导的抗体谱进行PLSR分离需要从每只动物中收集全部疫苗诱导的抗体特征的5个(图4b，右)。预测特征包括EV VARV B7/MPXV B6 FcgR2a和中性粒细胞吞噬细胞(ADNP)反应，作为与较低病变数量相关的首要特征。此外，中性粒细胞对MV MPXV A29抗原的调理吞噬作用、NK细胞对MPXV MV M1抗原的活性以及对EV VACV A33抗原的补体活性也是模型中的关键预测因子，突出了Fc-效应子功能对EV和MV靶标在疾病表现控制中的关键作用。此外，PLSR选择的特征与额外的中性粒细胞、NK和补体激活特征紧密相关，中和作用是次要的相关因素(显著性显示于图S4).
图S4 PLSR模型的重要性诊断，涉及图4
讨论
目前在刚果民主共和国爆发的2023-2024年mpox与20，000多例记录在案的感染和500多例死亡有关。10,28加上2022年全球mpox疫情，迫切需要制定战略来应对这种导致不可预测的流行病和大流行的阴险的人畜共患疾病。虽然以前开发的疫苗为高危人群提供了保护，但安全性、供应链和不完全保护已经推动了其他疫苗策略的开发，以减轻正痘病毒造成的威胁。最近的数据表明，在NHPs中，mRNA疫苗诱导的对致死性MPXV攻击的保护作用。29使用模拟人类感染和病理的静脉注射挑战，25,26在这里，我们证明了在致死性MPXV攻击后，mRNA对基于MVA的免疫接种同样具有保护作用，但在病毒载量、体重减轻和病变控制方面，它也提供了优于基于MVA的免疫接种的保护作用。此外，这项研究显示了mRNA疫苗接种后广泛交叉反应抗体的进化，建立在以前的数据基础上，强调了体液免疫反应在预防MPXV中的关键作用，18我们证明了mRNA介导的对发病和疾病的保护是由中和和非中和抗体功能的组合介导的，所述中和和非中和抗体功能靶向成熟和细胞外病毒颗粒上的抗原。根据最近证明补体在针对MPXV的中和抗体介导的保护中的作用的数据以及强调NK细胞在MPXV易感CAST小鼠中的关键作用的数据，30,31这些数据为mRNA疫苗诱导的抗MPXV免疫相关性提供了重要的见解，这可以支持许可，提供关于疫苗性能的机制见解，支持在易感人群中优化疫苗使用，并在需要添加或改变抗原的新型正痘病毒威胁出现时启发重新设计。
MVA免疫减少了受攻击的NHPs中的损伤，但是基于世卫组织损伤数分类，大多数MVA免疫的动物仍然被归类为经历“严重”疾病。32相比之下，在感染期间，没有一只mRNA免疫的动物达到“严重”疾病的标准。尽管MVA疫苗已经显示出引发体液和细胞免疫反应，33,34先前的免疫相关性分析表明，MVA诱导的体液免疫反应，而不是细胞免疫反应，是必需的，并且足以介导针对MPXV攻击的保护。18然而，正如在最近的现实世界突破性研究中所观察到的，MVA诱导的体液免疫可能不足以充分减弱疾病。35,36相反，已知mRNA疫苗可诱导强烈的免疫原性，并可提高对正痘病毒靶的反应。37,38在这里，我们观察到了针对四种关键抗原的强有力的抗体滴度，已知这四种抗原通过体液免疫机制提供保护。39此外，除了这些疫苗诱导的免疫反应的中和活性之外，mRNA免疫还诱导了强大的Fc-效应子功能，其与中和抗体活性合作，提供针对病毒复制和损伤形成的保护。
除了损伤形成之外，咽喉中病毒复制的减少可能在传播和扩散中具有重要意义，因为正痘病毒传统上通过粘膜组织接触传播。重要的是，2022年的全球爆发源于通过性接触的意外传播，通常是在男男性行为者(MSM)中富集的粘膜屏障处。40mRNA疫苗接种几乎完全减少了全身性病毒复制和咽喉中的低水平复制，在第11天和第13天之间只有短暂的病毒波动。病毒复制的这种高度显著的减弱不仅可能导致疾病修饰活性，而且可能减少传播。重要的是，增强的病毒控制似乎出现在中和抗体和抗体效应子功能之间的协调作用中，由FcgR3a和EV抗原的补体介导。尽管EVs仅代表全部生产的病毒体的一小部分，41EV的形成在痘病毒中是高度保守的，有利于病毒感染，并且代表了关键的逃避性病毒后代。因此，这里的数据表明，额外的Fc介导的功能可能对病毒生命周期的这一特定步骤至关重要，以完全控制和清除病毒，并可能对限制传播至关重要。
获得了关于用mRNA或MVA免疫后体液反应广度的额外信息。IgG结合和功能分析表明，用MPXV抗原免疫导致产生交叉反应性VACV-A27、-A33、-B5和-L1和VARV-A31、-A36、-B7和-M1抗原，突出了用高度保守的MPXV抗原免疫所提供的广泛交叉反应性。此外，相关分析选择了VACV特异性反应，突出了这些交叉反应反应在预测病毒载量和病变控制方面的高度预测性。这些数据表明，MPXV mRNA疫苗可以刺激与许多正痘病毒相互作用的抗体。相反，MVA疫苗接种的动物显示出对测试抗原的低结合滴度，尽管观察到对四种VARV蛋白中的三种(A33、B5和L1)的一些反应。类似地，MVA免疫的动物对测试的VACV毒株表现出一些中和反应，但对测试的MPXV或其它正痘病毒毒株的反应最小。然而，重要的是要注意，体液反应和Fc功能活性的焦点是针对mRNA疫苗中包含的抗原进行测量的，以前曾报道，在VACV暴露后，这些抗原是免疫显性的。42此外，MVA免疫(在临床批准的剂量范围内)在这里和过去的动物实验中确实提供了对抗致命攻击的保护。18我们推测较高剂量的MVA可能会增强免疫原性和保护作用。然而，生产的限制使得很难大幅度增加MVA在人体内的剂量。考虑到B细胞是保护所必需的，这些数据认为MVA诱导的对其他抗原的体液免疫应答可以提供对死亡的保护，或者MVA诱导的体液疫苗特异性免疫能够在对MPXV攻击病毒的应答中快速进化。相比之下，mRNA免疫在攻击时诱导针对EV和MV病毒表面的体液免疫，这可以提供更强的免疫屏障，特别是针对感染的发病机制，可以有效地限制病毒的复制和传播。
MPXV作为一种病原体的出现能够通过性传播的增加引起世界范围的爆发，最近首次报道了进化枝I病毒，43,44这是一个值得关注的重大问题。战略药物储备和当代疫苗(JYNNEOS)足以在半年的传播后遏制传播，避免了大部分生命损失，部分原因是clade II菌株的毒力较低。然而，关键的是，中非2023-2024年的疫情目前是由更致命的MPXV分支I菌株驱动的，最近的报告表明该病毒也具有性传播能力。缺乏疫苗部署和医疗对策加剧了病毒从传统流行的农村地区向大城市中心的传播，并导致约500多人死亡，病死率为2.9%。该地区缺乏使用现代VACV疫苗的常规免疫接种，这似乎为病毒的持续低水平传播提供了肥沃的土壤，并为突变提供了机会，导致了MPXV的持续爆发。因此，迫切需要能够快速适应病毒突变的其他安全高效的疫苗平台，以缓解MPXV和其他人畜共患正痘病毒的未来爆发。
核酸疫苗，如mRNA-LNP疫苗技术，可以对新出现的病毒威胁做出快速反应。在确定病原后，针对关键基因的序列可以快速合成并转化为潜在的疫苗，在全球制造中心允许的感兴趣区域生产，特别是在低收入和中等收入国家。此外，新冠肺炎疫情证明了该平台赋予的强大的免疫原性，导致诱导有效的中和抗体滴度、持久的T细胞应答和持久的记忆B细胞应答。45幸运的是，在痘病毒的情况下，研究人员之前已经从200多种可能的痘病毒基因中筛选出了少数高度保守的保护性靶标，当这些基因组合在一起时，可以高效地跨越病毒。14,15,20,21,29,46这些研究和其他临床前数据导致在正在进行的I/II期临床试验(NCT05995275)中评估mRNA-1769，以解决基于mRNA的正痘病毒疫苗的安全性和免疫原性。然而，是否可以添加额外的抗原来驱动完全保护和驱动针对额外的正痘病毒的保护，是否额外的免疫应答(例如，T细胞)可以加强保护，或者是否诱导免疫，特别是在粘膜屏障处，可以提供针对粘膜攻击的增强保护，仍然不清楚，但是这些都是未来MPXV mRNA疫苗创新和测试的潜在途径。
此外，mRNA-1769免疫后的免疫应答的寿命在这里没有被测量。所有疫苗平台的疫苗动力学通常遵循两个衰减阶段。这包括峰值成浆细胞诱导后的快速抗体衰减阶段，随后是更长时间的浆细胞反应，这在很大程度上提供了对疾病的持久保护。47,48沿着这些思路，来自真实世界血清流行病学研究的新数据表明，mRNA疫苗诱导高峰免疫反应，该高峰免疫反应衰减，但随后是第二波更长期的浆细胞衍生的抗体反应，该抗体反应对最初编码的新型冠状病毒抗原是持久的，并且这一现象已被其他mRNA疫苗证实。49,50此外，研究还表明，记忆B细胞反应在mRNA免疫后趋于稳定，这可能赋予病毒感染后更长时间的快速记忆反应。45,51然而，mRNA疫苗是否会提供终身免疫，类似于复制型VACV疫苗提供的显著免疫，仍不清楚，但将在正在进行的1/2期试验(NCT05995275)中进行研究，并代表了未来抑制疫情的mRNA疫苗对新型正痘病毒病原体及其他病原体的另一个期望目标。
研究的局限性
这项研究描述了通过静脉注射致死性MPXV感染的NHP模型中mRNA和MVA疫苗的观察和免疫学比较。本研究中选择的剂量是基于相关的人类剂量，但一个剂量范围将是理想的，以更高的分辨率进一步描述免疫反应。静脉给药被认为是复制人类感染过程中疾病自然病程的最佳方法，但对其他给药途径的探索可能为探索传播和疾病的免疫相关性提供不同的视角。细胞免疫分析不包括在这项研究中，以比较不同类型的疫苗，但将包括在未来的临床前和临床研究中。
资源可用性
铅接触
有关资源和试剂的更多信息和请求，请联系首席联系人Jay Hooper(jay.w.hooper.civ@health.mil).
材料可用性
mRNA-1769的可用性受到限制，需要与Moderna签订材料转让协议才能使用。
数据和代码可用性
感谢
我们要感谢Dave Dyer和Ondraya Frick对研究标本的后勤支持，感谢USAMRIID兽医学分部和病理学分部人员的专业支持，感谢Sarah Norris的统计分析。我们还要感谢巴特尔纪念研究所的团队为ECTV提供的技术支持。一些数字是用BioRender制作的。N.J.S .得到了波士顿大学董事会的资助，p . l . e . j . l . a . c . a . c .和B.M .的资助由校内研究部和NIAID提供。
作者投稿
概念化，A.W.F .，A.C .，w-h . y .，N.J.S .，B.M .，G.A .，和j . w . h；方法论，e . m . m . m . s . l . b . c . a . p . l . e . h . n . g . s . t . r . f . g . a . d . s . p . a . j . k . h . w .-h . y；形式分析，华盛顿特区；调查、e . m . m . s . l . b . c . a . p . l . e . h . n . g . s . t . r . f . r . h . l . l . a . a . m . g . a . j . l . a . c . c . c . j . w . k . c . c . c . I . d . d . s . k . o . j . l . r .和K.M.R .资源，e . m . m . a . w . f . d . c . c . a . p . l . e . r . h . l . a . m . g . a .和K.H。写作——初稿、e . m . m . m . a . w . f . g . a .和J.W.H。写作-审阅和编辑，e . m . m . m . a . w . f . s . l . b . d . c . w-h . y . n . j . s . b . m . g . a .和J.W.H .可视化、e . m . m . m . a . w . f . d . c . c . a .和H.N监理、a . w . f . a . c . w-h . y . n . j . s . b . m . g . a .和J.W.H。项目管理；资助收购、a . c . b . m .和J.W.H
利益申报
观点、解释、结论和建议是作者的，不一定得到美国陆军的认可。a . w . f . d . c . c . a . h . n . g . s . t . r . f . r . h . l . a . m . G.A . d . s . p . a . j . h . b . j . c . j . k . h . a . c . w-h . y .和g . a .都是Moderna的员工。G.A .是Systems Seromyx和Leyden Labs的股东，并在过去一年获得了Moderna、GSK、Sanofi、Medicago、BioNtech、Clover和Pfizer的合作资助。p . l . e . j . l . a . c . a .和B.M .得到了NIH NIAID校内研究部门的支持。
STAR★方法
关键资源表
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 抗体 | ||
| 抗豚鼠补体C3 | MP生物医学 | Cat # MP0855385RRID AB _ 2334913 |
| 单克隆抗体，抗痘病毒L1 | USAMRIID | 7D11 |
| 抗CD66b细胞蓝 | 生物遗传 | 目录号305112；RRID AB _ 2563294 |
| 单克隆抗体，抗痘病毒A33 | Mucker等人。52 | C6C |
| 单克隆抗体，抗痘病毒B5 | Mucker等人。52 | C8a |
| 抗CD107a BV605(克隆H4A3) | 生物遗传 | 目录号328634；RRID AB _ 2563851 |
| 抗CD56抗原提呈细胞(克隆MEM-188) | 生物遗传 | 目录号304610；RRID AB _ 314452 |
| 抗CD3 APC-Cy7(克隆UCHT1) | 生物遗传 | 目录号300426；RRID: AB_830755 |
| 抗MIP1b-BV421(克隆D21-1351) | BD生物科学 | 目录编号562900；RRID AB _ 2737877 |
| 抗IFNg-PE(克隆B27) | 生物遗传 | 目录编号506507；RRID AB _ 315440 |
| 山羊反人类 | 适马·奥尔德里奇 | 目录编号401954；RRID: AB_212016 |
| 抗恒河猴IgG-PE | 南方生物技术公司 | 目录编号6200-09；RRID AB _ 2796270 |
| 抗恒河猴IgA-生物素(克隆10F12) | NHP试剂资源 | 目录号PR-0126；RRID AB _ 2819304 |
| 抗恒河猴IgG 1-生物素(克隆7H11) | NHP试剂资源 | 目录号PR-7116；RRID AB _ 2819311 |
| 抗恒河猴IgG 2-生物素(克隆dio) | NHP试剂资源 | 目录号PR-0003；RRID AB _ 2895608 |
| 抗恒河猴IgG 3-生物素(克隆tria) | NHP试剂资源 | 目录号PR-0006；RRID AB _ 2895616 |
| 抗恒河猴IgG 4-生物素(克隆7A8) | NHP试剂资源 | 目录号PR-7186；RRID AB _ 2819323 |
| 细菌和病毒菌株 | ||
| 1979年扎伊尔第一期MPXV(v 79-I-005) | Mucker等人。53 | 不适用的 |
| 美国IIA分会第十五届会议，2003年 | Likos等人。54 | USAMRIID |
| 重组痘苗病毒株WR-GFP | 厄尔等人。55 | 尼亚伊德 |
| 重组MPXV-GFP | 弗雷恩等人。20 | 尼亚伊德 |
| 痘苗病毒，WR株(BEI NR-55) | Mudhasani等人。56 | 生物防御参考材料库 |
| MVA改良安卡拉痘苗病毒 | 怀亚特等人。34 | 不适用的 |
| 兔痘病毒，乌特勒支(ATCC VR1591) | Mudhasani等人。56 | 生物防御参考材料库 |
| 骆驼痘病毒，索马里株 | Smee等人。57 | USAMRIID |
| 莫斯科鼠痘病毒 | 贝资源 | 类别编号VR-1374 |
| 生物样本 | ||
| 人类补体 | 雪松烷 | Cat# CL6600 |
| 豚鼠补体 | 雪松烷 | 类别编号CL5000 |
| 化学品、肽和重组蛋白 | ||
| 正痘病毒mRNA-LNP疫苗 | 弗雷恩等人。20 | mRNA-1769 |
| Magpix痘苗病毒和MPXV抗原 | 胡珀等人。14,15还有赫罗等人。19 | A27/A29、A33/A35、B5/B6和L1 |
| VACV、MPXV和VARV重组蛋白 | 弗雷恩等人。20 | A27/A29/A31、A33/A35/A36、B5/B6/B7和L1/M1/M1 |
| 恒河猴Fcγ受体IIa-生物素 | 中国生物 | 目录号90016-K49H-B |
| 恒河猴Fcγ受体IIIa-生物素 | 中国生物 | 目录号90013-C27H-B |
| 关键商业分析 | ||
| xMAP耦合套件 | Luminex | 目录号4050016 |
| TaqPath 1步RTqPCR主混音 | ThermoFisher科技公司 | 目录号A15299 |
| 荧光微球中性链亲和素标记的微球 | 英杰公司 | 目录号F8776 |
| 存放的数据 | ||
| 数据可用性 | 门德利数据 | https://doi.org/10.17632/7pwgvpwf9b.2 |
| 代码可用性 | 芝诺多 | https://doi.org/10.5281/zenodo.12865619 |
| 实验模型:细胞系 | ||
| Vero E6 | ATCC | 目录号CRL-1586；RRID: CVCL_0574 |
| HEK293T | ATCC | 目录号CRL-3216；RRID: CVCL_0063 |
| Vero 76 | ATCC | 目录号CRL-1587；RRID: CVCL_0603 |
| 海拉·S3 | ATCC | Cat # CCL2.2RRID CVCL _ 0058 |
| 实验模型:生物体/菌株 | ||
| 食蟹猴(食蟹猴) | 全球灵长类公司 | 不适用的 |
| 寡核苷酸 | ||
| MPXV qRT-PCR正向引物 | 5 ‘-ctcattgattttcgcgggata | MPOX-F3L-F290 |
| MPXV qRT-PCR反向引物 | 5 ‘-acgatactcctctmgttggtc | MPOX-F3L-R396a |
| MPXV qRT-PCR探针 | FAM-CATCAGAATCTGTAGGCCGT-MGBNFQ) | MPOX-F3L-p333 |
| 软件和算法 | ||
| 制图板棱镜 | GraphPad软件有限责任公司 | 版本9.4 |
| 流动作业 | BD科学 | 不适用的 |
| Flexmap 3D | Luminex | 不适用的 |
实验模型和研究参与者详情
非人灵长类动物
统计学家将18只柬埔寨雄性食蟹猴随机分成三个疫苗接种组，每组6只，按体重分层。在研究开始时，所有动物的体重都在3.7到6.3公斤之间，除了一只重9.1公斤的动物被放在对照组中。所有nhp的年龄为6至8岁，是研究的新手，并在研究开始前通过兽医检查确定是健康的。研究在BSL-3设施中进行，动物单独圈养，所有工作在USAMRIID根据IACUC批准的协议(USDA注册号51-F-00211728 & OLAW保证号A3473-01)进行，符合动物福利法和其他与动物和涉及动物的实验相关的联邦法规和条例。进行这项研究的机构得到了国际实验动物护理评估和认证协会的完全认可，并遵守2011年国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》中规定的原则。所有涉及MPXV的操作均在BSL-3条件下进行。
细胞
免疫测定中使用的细胞包括Vero E6 (ATCC CRL-1586，雌性)、HEK 293T (ATCC CRL-3216，雌性)和Vero 76 (ATCC，CRL-1587，雌性)，并由USAMRIID病毒学部门使用标准程序在37℃和5% CO下保存2。HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2，雌性)用于VACV-GFP和MPXV GFP中和试验，并使用标准程序在37℃和5% CO下维持2。本研究未进行细胞系鉴定。
病毒
方法详细信息
疫苗组合物
编码相同浓度的四种MPXV分支IIb基因A35R、M1R、A29L和B6R的mRNA由Moderna (mRNA-1769)提供，并保持在-80°C±10°C。将mRNA-1769解冻用于疫苗制备，并在冰冷的1X不含钙/镁的PBS(Corning)中稀释至150μg/剂，用于肌内(IM)给药。剂量选择是基于SM102配方mRNA-LNP疫苗先前可接受的安全性数据。先前描述了改良的安卡拉痘苗疫苗34并储存在-80℃±10℃。接种前，将MVA解冻并在冰冷的1X PBS中稀释。0.7 x 10的目标剂量8PFU/剂量通过皮下(SC)途径给药。该剂量是基于已获许可的MVA疫苗的人类剂量(0.5 x 108至3.95 x 108每0.5毫升剂量的感染单位)。
非人灵长类动物的疫苗接种
非人灵长类动物的损伤MPXV模型
为了进行功效测试，如前所述使用了mpox和天花的食蟹猴损伤(静脉内)模型。59在第53天，将动物转移到动物生物安全级别3 (ABSL-3)进行MPXV攻击。简而言之，在第一次疫苗接种后56天，动物暴露于5×10的目标静脉内剂量7PFU的进化枝一MPXV。在施用病毒后2分钟内按顺序采集血液。这些样本用于确认成功分娩，确保适当的感染和导致的疾病。激发后，根据中提供的方案收集外周血和口咽拭子图1。在采血时进行麻醉体检，包括体重、直肠温度和损伤评估(图1).病变发作后每天服用美洛昔康，并持续至疾病消退。每当出现脱水迹象(例如，皮肤隆起、粘膜变化)时，给动物提供皮下乳酸林格氏溶液。感染后，每天至少进行一次笼侧观察，当动物开始表现出临床症状(反应性变化、损伤出现等)时，增加到每天至少两次。).安乐死的标准是基于反应能力、虚脱程度以及体温的综合考虑。每当动物奄奄一息时，或在指定的研究结束时(攻击后第26天)，在深度麻醉下通过心脏施用基于戊巴比妥的安乐死溶液对动物进行人道安乐死。
传染性病毒滴定
如前所述，使用6孔板中的Vero E6细胞单层进行细胞培养材料的样品(细胞培养物储备/接种物、全血和拭子)制备和噬菌斑滴定。60简而言之，在样品冻融和超声处理后，在含有2%热灭活胎牛血清(FBS)(原液/接种物)、含有2%热灭活FBS和抗真菌/抗生素的MEM(拭子)或不含镁或钙和抗真菌/抗生素的1X PBS(全血)的改良Eagle培养基(MEM)中进行10倍稀释。向孔中加入0.1 mL的体积，吸附约1小时，然后施加液体覆盖层。对于全血样品，吸附后用1X PBS(无镁或钙)清洗孔。
MPXV核酸的定量
从全血中提取总核酸用于病毒载量定量。简而言之，将100 μl全血与100 μl缓冲液ATL (Qiagen)混合，在振荡培养箱中以300 RPM在56℃孵育15分钟，并使用Qiagen 1&2病毒迷你试剂盒2.0提取。样品在90 μl洗脱缓冲液中洗脱。范围从5.6 x 10的标准曲线5–5.6 x 101使用如上所述提取的攻击原种病毒产生PFU/毫升。提取的核酸以1∶10连续稀释，并在每个实时PCR板上运行。根据制造商的说明，使用引物MPOX-F3L-F290、MPOX-F3L-R396a和探针MPOX-F3L-p333，使用TaqPath 1-Step RTqPCR Master Mix，CG (ThermoFisher Scientific)通过实时PCR测试5μl提取的核酸。QuantStudio Dx(thermo fisher Scientific)上的循环条件为:25℃×2分钟；50摄氏度x 15分钟；95摄氏度x 2分钟；45次循环(95摄氏度x 3秒，60摄氏度x 30秒)。如果Cq值低于40次循环，则样本被视为阴性。
Luminex分析
如前所述产生了来自VACV (A27L、A33R、B5R和L1R)、MPXV (A29L、A35R和B6R)和VARV抗原(A31、A36、B7和M1)的重组表达抗原。20按照制造商的说明，通过磺基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(Thermo Fisher)，利用羧基化学将抗原偶联到Magplex荧光条形码珠(Luminex)上。在稀释和热灭活后，偶联的珠子与灭活的NHP血清样品一起在37℃温育2小时，同时轻轻摇动。样品与预先优化稀释度的珠子一起孵育，以检测总IgG (1:50，000)、IgG1 (1:10，000)、IgG2a (1:10，000)、IgG2b (1:2，500)、IgG3 (1:1，000)、IgA (1:1，000)和FcγRs: FcγR2b (1:10，000)和FcγR3 (1:10，000)。每个样品都进行了一式两份的技术分析。洗涤珠子以去除任何未结合的样品，并与藻红蛋白(PE)标记的二级培养。抗Ig同种型在0.65 μg/mL下运行(南方生物技术，6200-09；NHP试剂资源AB_2819304，AB_2819311，AB_2895608，AB_2895616，AB_2819323)。对于除抗-IgG以外的所有抗-Ig试剂，洗去试剂，加入1 μg/mL的链霉亲和素-PE，室温下振荡孵育30分钟。重组生物素化Fcγ受体以1 μg/mL (Sino Biological)使用，并使用4∶1摩尔比的链霉亲和素-PE形成四聚体，并孵育10分钟。加入摩尔过量的生物素并孵育10分钟。将得到的四聚体加入孔中。通过洗涤除去过量的检测抗体，并在Flexmap 3D (Luminex)上分析样品。
MAGPIX和重组抗原
如前所述产生来自VACV (A27L、A33R、B5R和L1R)和MPXV (A29L、A35R和B6R)的重组表达抗原。14,15,19磁性微球和xMAP抗体偶联试剂盒购自Luminex Inc .(美国德克萨斯州奥斯汀)。从适马-奥尔德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯市)购买抗体后，根据制造商的说明，使用PE lightning link试剂盒(Abcam)生产磷酸盐缓冲盐水、吐温-20、脱脂奶粉和山羊α-人IgG (H&L)藻红蛋白缀合物(α-人PE，1 mg/mL)。
按照制造商的说明将抗原共价连接到微球上。对于需要去除溶液的所有步骤，通过将稀土磁体放置在反应容器附近来固定微球，并通过移液管去除溶液。只要有可能，就用铝箔将微球避光。简而言之，用500 μL激活缓冲液洗涤1250万个微球三次，并重新悬浮在274.5 μL激活缓冲液中。接下来，加入144.0 μL磺基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺和81.5μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液，并将试管轻轻旋转20分钟。活化后，用偶联缓冲液洗涤微球三次，并以每百万微球4 μg加入抗原。将反应物孵育2小时，然后用500μL PBS-T(含0.05%吐温-20的PBS)洗涤微球三次，以每毫升1250万个微球的浓度重新悬浮于PBS-T中，并储存于4℃下。为了进行多重分析，将每种抗原偶联至不同的微球:45号上的VACV A27L、75号上的VACV A33R、78号上的VACV B5R、22号上的MPXV A29L、MPXV A35R
通过使用96孔板在Magpix平台上滴定血清来确定相对抗体的存在。将血清在含5%脱脂乳的PBS-T中以1:100稀释，然后连续稀释5倍，最终稀释至1:7.8×106。样品与微球一起孵育1小时；每孔50 μL样品和每种抗原2500个微球。孵育后，每个孔中的微球用100μL PBS-T洗涤三次。山羊α-人PE在PBS-T的5%脱脂乳中以1:100稀释，以50μL/孔的量施加到微球上，并允许孵育1小时。微球用PBS-T洗涤三次，悬浮在100μL PBS-T中，并通过Magpix仪器读取。样品一式两份，每个平板包括阳性和阴性对照血清。抗体滴度测定为信号除以阴性对照信号降至10时的稀释因子。
裂解MVA酶联免疫吸附试验
通过水浴超声处理3分钟使纯化的MVA失活。ELISA板(密理博适马，M9410)用4 μg/mL稀释的MVA包被，并在4℃孵育过夜。在用SuperBlock (Thermo Scientific，37580)在37℃封闭1小时之前，用1x PBS-T洗涤平板4次。在用于分析之前，NHP血清在56℃下热灭活30分钟。在将75 μl加入到相应的孔中并在37℃下孵育1小时之前，在测定缓冲液(PBS-T + 5%山羊血清)中稀释血清。洗涤后，将板与100 μl TMB (Sera Care，目录号5120-0075)一起孵育10分钟，然后加入100 μl TMB终止液(Sera Care，目录号5150-0020)。在450 nm处读取平板OD值。使用GraphPad Prism软件分析所有数据。
痘病毒MV型PRNT
MV中和试验如前所述进行。61简而言之，将热灭活血清或抗L1抗体的稀释液与MPXV clade I或IIA以100 PFU/孔(例如，2000 PFU/mL)的目标孵育约1小时。然后对样品进行噬菌斑滴定，用结晶紫染色并计数噬菌斑。PRNT50滴度报道为最高稀释度的倒数，其中病毒(噬斑数)相对于阴性对照减少50%。显示少于50%的样品被指定为14.1的滴度，等于我们的最低最终稀释度(1:20)除以2的平方根。这是一种常见的方法，用于确定低于检测限值的样品的值。
痘病毒EV型的预防
表达GFP的VACV和MPXV中和
使用表达VACV菌株WR或MPXV Z-79进行半自动、流式细胞仪中和试验蓝色水母如前所述的绿色荧光蛋白。55热灭活血清的两倍稀释液(56o30分钟)在96孔圆底聚丙烯板中制备，使用spinner改良的含有2%胎牛血清的最低必需培养基。大约2.5 x 104将VACV-WR或MPXV-Z-79 GFP表达病毒的PFU加入到每个孔中，并将平板在37℃孵育1小时5将HeLa S3细胞移液到每个孔中，并将平板在37℃下再孵育16至18小时。将细胞固定在2%多聚甲醛中，使用FACS Canto II流式细胞仪和FlowJo软件(BD Biosciences)对GFP表达进行定量。使用Prism软件(GraphPad/Dotmatics)计算NT50值。通过去除异常的NT50值并计算1.65倍标准偏差来确定从模拟免疫动物获得的血清的LOD。传染性MPXV的操作程序由经过培训并接种过天花疫苗的研究人员按照NIH机构生物安全委员会批准的方案在注册的特选制剂BSL-3实验室进行。
抗体依赖性补体沉积
抗体依赖性补体沉积(ADCD)的实施与前述相似。62将抗原偶联到Luminex Magplex珠上，并如上文在多重Luminex测定中所述形成免疫复合物。洗涤平板，将豚鼠补体(Cedarlane)(用钙和镁稀释在1x PBS中)加入平板。将平板在37℃下培养，以700 rpm的速度摇动20分钟。用PBS中的15微米EDTA洗涤平板，并加入荧光素缀合的山羊IgG抗豚鼠补体C3检测抗体(MP Biomedicals #MP0855385)。荧光在Intelliflex (Luminex)上获得，数据以中值荧光强度(MFI)报告。分析重复进行，数据反映了重复的平均值。
抗体依赖性细胞吞噬作用
如前所述进行抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。20简而言之，将抗原生物素化并偶联至FluoSpheres NeutrAvidin标记的微球，1.0微米，黄绿色(Invitrogen)。通过将抗原偶联的珠子与稀释的血清混合形成免疫复合物，并在37℃下孵育2小时。孵育后，加入浓度为1.25×10的THP-1细胞(ATCC)5将细胞/孔和平板在37℃孵育18小时。过夜孵育后，用4%多聚甲醛(PFA)固定细胞。在iQue3 (Sartorius)上获得荧光。吞噬细胞计算如下:(%珠子+ THP1∗GeoMean珠+细胞)/100000。
抗体依赖性中性粒细胞吞噬作用
如前所述进行抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬作用(ADNP)。63从健康供体的新鲜外周全血中分离白细胞(研究血液成分)。所有的捐献者都在18岁以上，给予了知情同意并被确认身份。通过氯化铵-钾(ACK)裂解来分离白细胞。将抗原生物素化并偶联至FluoSpheres NeutrAvidin标记的微球，1.0微米，黄绿色(Invitrogen)。通过将抗原偶联珠与稀释的血清混合形成免疫复合物，并在37℃下孵育2小时。孵育后，加入浓度为2.5×10的中性粒细胞5将细胞/孔和平板在37℃孵育1小时。中性粒细胞通过抗CD66b PacBlue (Biolegend 305112)染色。细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定。在iQue3 (Sartorius)上获得荧光。吞噬细胞计算如下:(%珠子+嗜中性白细胞∗GeoMean珠+中性粒细胞)/100000。
抗体依赖性NK细胞激活
如前所述进行抗体依赖性NK细胞活化(ADNKA)。64使用RosetteSep(stem cell Technologies)通过阴性选择从血沉棕黄层中富集NK细胞，并使用Ficoll梯度分离NK细胞。血沉棕黄层从健康的、筛选的供体的BioIVT获得。NK细胞在37 ℃, 5% CO2，10%胎牛血清(FBS)和2 ng/mL IL-15的RPMI中静置过夜。ELISA板用抗原包被，用5% BSA封闭，加入稀释至预先确定的稀释度的血清，并在4℃孵育过夜。第二天，洗涤板，将NK细胞以5×10-6的浓度加入板中4在含有Brefeldin A(适马)、Golgistop (BD Biosciences)和抗CD107a BV605 (Biolegend，克隆H4A3，目录328634)的培养基中的细胞/mL。将平板在37℃、5% CO2下孵育5小时。孵育后，用抗CD56 APC (Biolegend，克隆MEM-188，目录304610)和抗CD3 APC-Cy7 (Biolegend，克隆UCHT1，目录300426)对细胞进行表面标记染色。用固定培养基A和B (Invitrogen)固定和透化细胞，并用抗MIP1b-BV421 (BD Biosciences，克隆D21-1351，cat 562900)和抗IFNg-PE (Biolegend，克隆B27，cat 506507)染色。在iQue3 (Sartorius)上获得荧光。NK细胞以CD56+/CD3-门控，活性以CD107a、IFN-g或MIP-1b阳性的NK细胞的百分比确定。
量化和统计分析
疫苗签名的无监督聚类
首先对主成分分析(PCA)的数据进行对数化和z评分。PCA对投射到前两个主成分(PC)上的数据点(动物)进行聚类。PC是通过整体抗体特征的高维缩减生成的，其中每个PC代表特征的线性组合，并保持与其他PC正交，但尽可能多地保留特征数据集中的差异。还计算了每个特征对标准正交主成分系数的贡献程度。使用R prcomp函数进行主成分分析。
相关分析
使用有监督的机器学习方法——最小绝对收缩和选择算子(LASSO ),然后是偏最小二乘回归分析(PLSR ),确定了疫苗结果的最小抗体相关性。首先对数据进行对数运算和z评分。然后在重复交叉验证框架中执行LASSO，并且在超过60%的重复模型中识别的特征被设置为选择的特征。特征选择后，使用PLSR来定义作为所选特征的线性组合的输入和疫苗结果(病毒载量或损伤数量)之间的关系。具体来说，PLSR寻找潜在变量，这些变量线性地组合了特征，解释了结果的最大方差。使用方差和、可预测结果的方差以及平均误差估计的平方根来评估模型解释和预测能力指标。为了估计最终模型的统计显著性，进行了置换测试，以在样本间混洗结果标签。然后，随机混洗的数据集用于测试偶然获得模型预测准确性的可能性。每个排列测试执行10，000次，以生成经验零分布和精确的p值。实际检验和两种排列检验之间小于0.001的p值导致无效假设的拒绝，并被认为具有统计学显著性，为模型的稳健性和确定的相关性提供了信心。使用R版本4.3.0 (2023-04-21)进行分析。套索是使用glmnet R包版本4.1.4进行的。使用ropls R软件包版本1.30.0进行偏最小二乘回归(PLSR)和模型诊断。
相关网络分析
相关网络探究了拉索-PLSR模型选择的相关因子和其他抗体特征之间的相关性，可能提供对抗体相关免疫的进一步机制理解。为此，基于任何成对的个体特征之间的Spearman相关系数(rho)来构建网络。只有Benjamini-Hochberg调整的p < 0.01和绝对ρ> 0.7的相关性将保留在相关性网络中。
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