开发传染病疫苗的先进技术

新出现和重新出现的传染病对全球公共卫生构成重大威胁，因为它们有可能迅速演变成大流行病。城市化、全球旅行增加和环境变化等因素加速了这些病原体的传播。历史事件，包括1918年西班牙流感和新冠肺炎疫情，以及黄热病、西尼罗河病毒和多重耐药细菌等疾病的爆发，表明这些感染可以迅速升级为全球健康危机。此外，在过去50年中，新的病毒病原体不断出现，包括埃博拉病毒、人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)和最近的冠状病毒，这突出表明迫切需要不断开发疫苗¹。疫苗的发现和临床应用被广泛认为是现代医学最伟大的成就之一。疫苗接种现在是控制和预防由传染病病原体引起的疾病暴发的基石。成功的大规模疫苗接种运动彻底根除了威胁生命的疾病，如天花和几乎根除了小儿麻痹症，并大大减轻了许多其他病原体造成的全球发病率和死亡率负担。世界卫生组织(世卫组织)的报告估计，疫苗每年可防止约200万至300万人死亡，并减少疾病和住院治疗的经济影响超过5000亿美元^2,3.

目前用于对抗传染病的大多数疫苗可以大致分为三类:减毒活病毒、灭活病毒和蛋白质亚单位/多糖。尽管这些已建立的疫苗平台取得了成功，但它们未能抵抗免疫逃避病原体，如艾滋病毒、疟疾和结核病。在流感等其他情况下，疫苗需要每年更新，以应对快速出现的变异，并且效力每年都有很大差异⁴。最后，这些疫苗模式需要几年到几十年的时间来开发，从而限制了它们应对快速出现和重新出现的病原体引起的疫情的能力。需要克服传统疫苗平台的这些局限性，这促使人们对开发针对传染病的新型疫苗技术越来越感兴趣^5,6.

与任何药物一样，安全性和有效性对于新型传染病疫苗平台的成功至关重要。疫苗应能有效诱导长期细胞/体液免疫，副作用最小(反应原性)并且在随后的感染中不诱导疫苗相关的增强疾病⁷(方框1)。值得注意的是，更高的反应原性可以减少疫苗的使用，从而降低疫苗接种活动对公共卫生的整体影响。平衡免疫后的炎症事件以最大化免疫反应，同时保持临床上可接受的反应原性是疫苗成功的关键。理想情况下，应设计和施用疫苗来控制抗原呈递动力学和组织分布，以提高适应性免疫反应的质量⁸。例如，剂量计时可用于增强抗体亲和力成熟，而接种途径可用于诱导增强的全身性或粘膜适应性免疫^9,10,11。疫苗还必须应对免疫逃避突变，这种突变会迅速降低疫苗的效力，流感和新型冠状病毒就是明证^12,13.

基因组学、生物技术和工程领域的进步推动了疫苗平台的发展，这些平台整合了新的和现有的病原体信息，以促进疫苗的快速开发。例如，对病毒蛋白的深入表征已经提供了分子和机制上的理解，使得能够设计针对特别困难的靶标的免疫原性抗原^14,15。蛋白质表达和核酸疗法(如DNA和体外转录的mRNA)的进展为使用这些抗原快速开发有效疫苗提供了多功能平台¹⁶。此外，对宿主-病原体相互作用的重要见解已经确定了疫苗生物分布、药代动力学和先天免疫激活的最佳参数¹⁷。这些见解已被用于开发工程材料，使这些复杂抗原能够在淋巴管中受控传播并增加抗原呈递细胞(APC)摄取，同时充当辅助者来触发关键的免疫信号通路^18,19.

这篇综述简要概述了疫苗诱导免疫的机制和不良事件的途径。通过对该领域关键研究的评估，阐明了新兴合成疫苗平台不同组成部分的设计考虑。提供了这些疫苗的下一代递送平台的详细讨论，特别强调已经进展到临床试验或临床前评估的后期阶段的材料。基于当前最先进的平台，当前的挑战和传染病疫苗发展的未来方向被考虑。

疫苗接种涉及免疫系统的先天和适应性途径，以诱导病原体特异性免疫反应。先天免疫系统通过以下方式对病原体或疫苗接种做出快速反应模式识别受体，已经发展到检测高度保守的病原体相关分子模式和损伤相关分子模式。这些途径在几分钟内触发初步的、相对非特异性的免疫反应²⁰。最常见的PRRs包括toll样受体(TLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体(NLRs)和视黄酸诱导基因I (RIG-I)样受体，它们在先天免疫细胞中启动信号传导。先天免疫细胞如自然杀伤细胞有助于识别和清除病毒感染的细胞，而吞噬细胞如单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞在这些PRRs激活时可以摄取细菌、病毒和其他外来物质^20,21,22。除了这种细胞成分，补体途径和一系列不同的细胞因子和防御素形成了先天免疫反应的体液系统^23,24。先天免疫反应的典型特征在于这些途径的激活，这导致炎症、致热因子的产生和APCs向感染/注射部位的迁移，从而有助于启动适应性免疫反应和潜在的局部/全身不良反应^25,26。APCs和疫苗成分可以迁移到局部引流淋巴结，在那里它们向适应性免疫反应的关键介质B和T细胞呈递抗原(图。1)。在局部引流淋巴结内，病原体特异性B细胞被呈递的抗原激活，并通过基因重组提高它们对病原体的识别。在方框中更详细地讨论了体液/细胞免疫的发展和相关的疫苗反应原性1和2.

mRNA/DNA/蛋白质亚单位疫苗通过胞吞作用被抗原呈递细胞摄取(1)。一旦进入细胞，这些抗原(mRNA/DNA/重组蛋白)就会逃离内体，进入胞质溶胶(2)。DNA被运输到细胞核，在那里它被转录成mRNA，然后mRNA离开细胞核进入细胞质(3)。在胞质溶胶中，mRNA被核糖体翻译成病毒抗原蛋白(4)。抗原可以通过几种方式进行加工，以刺激免疫系统。在细胞内，抗原被蛋白酶体复合物分解成更小的片段(5)。然后这些片段通过主要组织相容性复合体I类(MHC岛)蛋白质。活化的细胞毒性T细胞通过释放细胞溶解分子杀死受感染的细胞(6)。此外，分泌的或膜锚定的抗原可被其他细胞吸收，在内体内降解，并通过主要组织相容性复合体II类(MHC二号)蛋白质(7)。辅助性T细胞通过刺激B细胞产生中和抗体来帮助清除循环病原体(8)。B细胞可以直接内化和加工膜锚定或分泌的抗原(9)。一旦从CD4⁺T细胞接收到辅助信号、B细胞可以增殖分化成记忆B细胞和浆细胞分泌抗体。VLP，病毒样粒子。

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接种途径

接种途径在赋予强而持久的保护性免疫中起主要作用。接种部位决定了首先接触疫苗的免疫细胞亚型，然后影响产生的适应性免疫反应²⁷。大多数临床批准的疫苗是肌内或皮下接种的，因为这些注射途径是成熟的，并且这些组织含有大量的先天免疫细胞。然而，其他接种途径正在出现，它们可以提供针对感兴趣的病原体的更好的保护。例如，皮内和呼吸道接种途径使疫苗分别暴露于皮肤和粘膜中比肌内接种途径更多的先天免疫细胞²⁸。鼻内接种可以诱导粘膜IgA抗体的产生和肺组织驻留记忆T (T_RM)细胞，对肠胃外接种的制剂提供了较好的保护反应^{29,30,31,32,33}.

最近，通过粘膜途径施用的多种基于载体和基于mRNA的疫苗已证明对新型冠状病毒有效，表明这些平台对其他呼吸系统疾病的潜力²⁹。在一种混合疫苗接种方法中，研究人员通过鼻内施用无佐剂刺突蛋白或聚合物复合mRNA来利用预先存在的免疫力。鼻内加强诱导了强有力的粘膜IgA和IgG，并建立了组织驻留记忆CD8⁺T，CD4⁺T和B细胞³⁴。有趣的是，这种策略诱导了仓鼠对致命病毒攻击的保护性免疫，与其他疫苗方案相比，显示出减轻传播的巨大希望。或者，用两亲性部分修饰的免疫原已显示结合白蛋白，这有助于通过Fc受体(FcRn)介导的胞转作用穿过粘膜屏障。鼻内接种后，这些工程免疫原扩增生发中心鼻相关淋巴组织的反应，产生更强的全身和粘膜免疫³⁵。在另一项研究中，静脉注射的mRNA疫苗表现出对肝脏和脾脏的递送增加，这可以诱导更强的肝脏驻留T_RM细胞通过招募I型自然杀伤T细胞。这种策略可以控制疟疾感染的肝脏阶段，并在小鼠中提供有效的保护³⁶。或者，静脉注射卡介苗(BCG)疫苗保护猕猴免受结核感染，并诱导血液、脾脏和所有肺实质组织中高频率的抗原反应性T细胞³⁷。然而，对不同组织施用疫苗也可能影响疫苗的反应原性和安全性。例如，在一项评估针对流感的mRNA疫苗的临床研究中，皮内接种产生了优于肌内接种的免疫力。然而，皮内途径也与较高的不良事件发生率相关³⁸。最近的一项临床研究报道，与肌内接种相比，皮内接种mRNA-1273提供了剂量节省和增强的安全性，同时仍然引发保护性免疫，尽管产生较低的免疫应答中和抗体滴度³⁹。与此同时，皮下免疫已经证明比mRNA肌内免疫具有更低的促炎反应脂质纳米粒在小鼠中，没有前一种方法损害产生的体液反应⁴⁰。或者，口服疫苗提供了刺激粘膜免疫的有效平台，易于接种，并提高了接受度和依从性，使其非常适合大规模疫苗接种运动。利用减毒活疫苗或灭活疫苗平台，已经开发出了几种针对轮状病毒、霍乱和脊髓灰质炎等疾病的口服疫苗；然而，由于潜在的安全性问题，许多目前的佐剂和递送系统不适合口服或粘膜途径。因此，可能需要开发新的材料，并根据不同的疫苗接种途径进行定制⁴¹.

疫苗通常包含抗原、佐剂和递送组分。在接下来的章节中，我们将讨论设计每个组件所涉及的基本原则，并强调包含这些设计原则的临床和临床前研究。

抗原

抗原设计是疫苗设计最重要的方面，因为它指导中和抗体和细胞免疫的发展。在常规疫苗平台如减毒活疫苗或灭活疫苗中，整个病原体被用作抗原，没有抗原选择的余地。然而，新兴的疫苗平台，如蛋白质亚单位和核酸疫苗，允许精确的抗原选择和设计。与传统方法不同，这些平台根据中和病原体的有效性提供了特定抗原的选择，如包膜蛋白、毒素或多糖，从而促进了更合理的设计方法。在下面的章节中，我们阐述了利用基于蛋白质和基于核酸的疫苗平台的抗原设计领域的关键进展。

病毒抗原的结构修饰

病毒蛋白质的结构特征和蛋白质工程策略的进展使得工程抗原的开发能够将免疫反应集中于中和表位。工程抗原最成功的例子可能是用于新型冠状病毒疫苗的融合前稳定的β冠状病毒刺突蛋白和用于呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的融合前稳定的F蛋白。通过产生针对融合前形式的病毒抗原的抗体，这些稳定的结构比完全天然的序列产生更高的中和抗体滴度^42,43,44。随后的研究表明，额外的稳定突变可用于进一步增强新型冠状病毒刺突蛋白的免疫原性⁴²。这种稳定方法可广泛用于来自其他病毒的其他I类融合蛋白，如流感血凝素(HA)等⁴⁵.

尽管RSV和新型冠状病毒疫苗代表了抗原序列工程最成功的例子，但这些努力源于开发HIV疫苗的工作。针对裂解的HIV包膜(Env)蛋白(gp120)的有效中和免疫反应受到快速基因组突变和关键中和表位(如CD4结合位点)的聚糖屏蔽的阻碍。因此，精心设计抗原对于开发有效的HIV疫苗至关重要。在一项研究中，减少gp120上三聚体碱基和V3环表面暴露的序列修饰增加了相对于天然gp120的中和抗体滴度(参考。⁴⁶)。在另一项研究中，作者设计了高度稳定的gp 140(HIV Env的未裂解胞外域，gp160)三聚体BG505 SOSIP.664，它显示出与多种广泛中和抗体结合，同时避免与非中和抗体结合⁴⁷。不幸的是，这些稳定的结构似乎不能单独产生高效的中和反应。

由于这些更传统的亚单位抗原通常实现的有限的中和广度，最近的方法集中于工程化新的抗原，其可以诱导广泛中和抗体(bnAbs)以保护对抗广泛的病原体菌株⁴⁸。对于HIV，最近的工作集中在开发序列抗原，以引发针对Env蛋白的CD4结合位点的bnAbs的开发。在一项研究中，通过从BG505的特定位置去除聚糖，取代结合位点表位附近的残基，并改变环长度以指导体细胞向中和宽度过度突变，开发了加强免疫原⁴⁹。另一种方法利用一系列免疫原(Env三聚体),这些免疫原选择性地从近端N-聚糖去糖基化，以限制暴露于CD4结合位点，随后是异源加强免疫，Env免疫原中的聚糖逐渐恢复。这种用结构修饰的免疫原顺序免疫的过程导致产生交叉中和抗体，以及具有87%中和宽度的界面导向抗体^50,51。基于结构的抗原设计的类似方法已被用于开发靶向其它病原体进化保守区域的抗原，例如流感病毒的HA柄结构域^33,52。为此，将HA重新定向成颠倒的构型已经显示出引发针对HA柄的免疫反应⁵³。开发泛冠状病毒疫苗的努力已经利用了刺突蛋白的更保守的S2结构域来引发针对广泛的新型冠状病毒和祖先β冠状病毒的中和反应^54,55。抗原工程的进步为下一代疫苗提供了潜力，可以更好地对抗新出现的病原体变异，并最大限度地减少加强剂量的需求。然而，重要的是要认识到，这些创新的方法仍在临床试验中进行评估，尚未证明广泛的成功(图。2)。

不同的疫苗平台利用重组产生的蛋白质(部分a–c)或能编码所需病毒抗原的核酸(部分d,e)。基于蛋白质的疫苗平台利用多种方法来设计改进的免疫原，以引发所需的免疫反应。a抗原构象稳定性——呼吸道合胞病毒F蛋白(RSV-F)呈现两种不同的构象:融合前状态(左)和融合后状态(右)。稳定RSV-F融合前的构象增强了中和抗体的产生。b,c，多聚化抗原展示可提高B细胞识别，诱导强有力的B细胞活化以产生更强的体液反应(部分b)和使用生物信息学分析适当选择肽表位以鉴定免疫原性肽表位，从而引发偏向性(B或T细胞)或平衡的免疫反应(部分c)。 d同时，不同的核酸平台，如mRNA、自扩增RNA、环状RNA、质粒DNA和封闭DNA，已被用于生产病毒抗原，具有不同水平的抗原表达和对应于每个平台的免疫激活谱。e这些核酸平台可被进一步改造以产生融合抗原(靶向的、有佐剂的)或独特的抗原呈递方式(多价的、膜结合的或分泌的),用于引发更强的免疫反应。VLP，病毒样粒子。

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自组装抗原

通过在自组装病毒样颗粒(VLPs)或蛋白质纳米颗粒(PNPs)的表面上多价呈递抗原，可以提高对疫苗接种的免疫应答的质量。与单体抗原相比，这些多价结构增强了树突细胞的摄取，并促进了B细胞的活化^56,57,58。这种策略被越来越频繁地用于提高病原体特异性抗体滴度和中和范围。

用于疫苗开发的这些类型的多价PNP通常使用计算设计的或天然存在的与抗原亚单位融合的自组装多聚体蛋白质来产生。在计算设计的支架的一个例子中，蛋白质界面设计方法被用来产生两种自组装成呈现二十面体对称性的蛋白质纳米笼的同源寡聚体⁵⁹。使用这些双组分PNPs的研究表明，融合前稳定的RSV F糖蛋白三聚体和HIV BG505的抗原密度增加。SOSIP抗原产生的中和效价比它们的三聚体对应物产生的中和效价高10倍和40倍^60,61。使用类似的平台，来自四种不同流感毒株的HA胞外结构域被共展示以产生四价‘镶嵌’疫苗⁶²。这些计算设计的蛋白质I53_dn5A和I53_dn5B进一步融合到全长刺突或受体结合结构域(RBD)上，以产生镶嵌纳米颗粒，该镶嵌纳米颗粒在小鼠和猕猴中产生保护性免疫^63,64。I53-50蛋白纳米颗粒(由自组装工程蛋白I53-50A和I53-50B组成)用来自不同萨伯病毒的rbd功能化，目前正在临床试验中进行测试(NCT04742738和NCT04750343)，表明它们具有产生下一代泛萨伯病毒疫苗的潜力⁶⁵.

作为计算设计的自组装纳米粒子的替代物，天然存在的蛋白质，如铁蛋白、lumazine合酶和囊素，为开发PNPs提供了另一个平台^66,67。其中，铁蛋白使用最频繁，因为纳米颗粒的八面体对称性有利于病毒蛋白的三聚化和天然四级结构的呈现⁶⁸。在一项开创性的研究中，开发了基因融合的HA-铁蛋白纳米颗粒，其诱导的血凝抑制滴度比许可的灭活疫苗高10倍。此外，这些HA-铁蛋白纳米颗粒引发了针对茎上保守表位和头部受体结合位点的中和抗体滴度，表明该平台具有产生通用流感疫苗的潜力⁶⁹。随后，以融合到铁蛋白支架的HA茎为特征的纳米颗粒通过靶向HA茎的保守构象表位产生了广泛的保护性反应(NCT03186781)^70,71。类似地，蛋白质-抗原融合平台已被用于开发流感、新型冠状病毒、RSV和EP stein-Barr病毒纳米颗粒，分别呈递HA、spike、F和gp350蛋白质^72,73。此外，纳米颗粒上的异亚型抗原呈递可以通过优先与具有交叉反应潜力的B细胞结合来诱导更广泛的中和抗体反应，表明这些多价平台产生泛流感疫苗的潜力⁷⁴。除了全长病毒蛋白的多聚化之外，这些多价纳米颗粒可用于增强针对表位的抗原的免疫原性，这些抗原可能比全蛋白更小且免疫原性更低^75,76。例如，通过将来自gp120的工程CD4结合结构域融合到lumazine合酶，形成60-mer支架，开发了种系引发的HIV疫苗eOD-GT8⁷⁷。当与相同结构域的三聚体相比时，60聚体VLP诱导了非常优越的免疫引发。

产生铁蛋白多聚体的另一种模块化方法是用高亲和力基团功能化铁蛋白和抗原，所述高亲和力基团在混合时由于共价键形成或强超分子相互作用而结合。这种策略已被用于将HIV Env-三聚体与铁蛋白结合，这优先在猕猴和敲入小鼠中诱导不可能的突变，提高亲和力成熟，这对于bnAbs的发展是至关重要的⁶⁸。类似地，来自SARS-CoV刺突蛋白的不同RBDs与纳米颗粒结合，这产生了针对多种β冠状病毒的交叉中和滴度，包括不同的SARS-Cov-2变体^78,79。与PNP类似，VLP是重组或合成的纳米颗粒，类似于病毒，因为它们在其表面展示多种病原体蛋白。第一个批准的疟疾疫苗(RTS，S)利用重组表达的VLPs，其由乙型肝炎表面抗原(HbsAg，“S”)和S抗原的自组装混合物组成，该混合物与来自环子孢子蛋白(CSP)的重复序列(“R”)和T细胞表位结构域(“T”)遗传融合以形成“RTS”蛋白⁸⁰。R结构域诱导中和抗体，而T结构域诱导细胞免疫。通过将RTS和S蛋白以1:4的比例混合形成最终的VLP，产生大小约为22 nm的VLP。用辅以AS01的RTS，S进行的III期临床试验发现，接种四剂疫苗的幼儿和婴儿的临床疟疾发作分别减少了36%和26%⁸¹。随后，开发了R21重组蛋白，其将CSP片段和HbsAg抗原结合形成VLPs。在多个非洲国家进行的III期临床研究中，用Novavax的Matrix-M佐剂配制的R21 VLPs证明了75%的保护效力⁸².

尽管这些自组装支架可以增强对疫苗接种的免疫反应，但是在诱导针对载体支架的免疫反应方面存在潜在的问题。由于这些蛋白质通常是细菌衍生的，它们本身可以诱导强烈的免疫反应，并且通常观察到抗支架抗体。这些抗体的发展引起了对潜在宿主自身免疫的关注⁸³，因为一些VLP支架，如细菌铁蛋白，在细菌和人类之间是保守的。这在理论上可能会导致针对人体支架的中和反应，从而导致自身免疫。然而，临床前研究表明，用细菌铁蛋白接种不会诱导针对人铁蛋白的交叉反应性免疫反应。此外，抗支架抗体的存在可能影响用于靶向不同病原体的支架的再利用。如果这些抗体变得高度占优势，它们可能会干扰针对预期病原体的适应性免疫反应。然而，临床前研究已经在很大程度上解决了这些问题，证明了尽管存在抗支架抗体，但对各种抗原的有效免疫反应^69,84,85。也可以通过用抗原在空间上封闭支架或通过改变支架氨基酸序列使其免疫原性降低，来改造VLP支架以减少抗支架反应的顾虑⁸³。然而，还需要进一步的临床研究来充分理解PNP疫苗的支架导向免疫反应的影响。

肽抗原

基于肽的疫苗利用来自病原体的线性表位，这使得能够选择性靶向较小的表位以产生定向体液免疫应答。与更大的抗原相比，肽可能更容易大规模快速生产，并且可以选择仅包括预期给予中和免疫的基序。例如，利用计算策略设计来自RSV，FFL_001的线性肽表位。然后评估该支架是单体还是与乙型肝炎核心抗原VLP结合。用两种免疫原接种在非人灵长类动物(NHPs)中产生RSV结合和中和抗体⁸⁶。对基于肽的疫苗的其他研究试图引发针对高度保守抗原表位的中和抗体反应，例如流感HA蛋白的柄结构域⁸⁷丙型肝炎E2包膜蛋白的部分⁸⁸和CSP重复区恶性疟原虫⁸⁹。用基于肽的疫苗选择特定表位的能力可以通过选择性排除可能诱导疫苗相关疾病增强的表位来潜在地提高安全性^90,91。一项研究调查了SARS-CoV识别肽的肽表位，这些肽在NHPs中诱导保护性抗体滴度，而其他肽在NHPs中引起抗体依赖性感染增强⁹²。尽管本文描述了基于肽或表位的疫苗的优点，但它们的免疫原性可能不如它们的全蛋白对应物，并且线性表位可能不能完全再现抗原的天然构象，从而限制了中和抗体反应。

肽也可用于通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递产生CD8 T细胞疫苗。与诱导保护性抗体以防止感染的常规疫苗不同，T细胞疫苗旨在刺激广泛的T细胞反应，这已被证明在对抗病毒方面是有效的，尽管病毒具有快速改变表面抗原的能力。T细胞疫苗可以帮助控制和解决感染，即使它们主要不能完全预防感染。特别是，当病原体突变以逃避现有的体液免疫或在没有确定的体液抗原的情况下产生保护时，T细胞疫苗可用于提供第二道防线⁹³。肽特别适合于CD8 T细胞疫苗，因为MHC呈递仅是序列依赖性的，并且不受肽不能采用准确的抗原三级结构的限制。通常，通过从病毒基因组中选择肽表位来设计这些疫苗，所述肽表位(1)以高亲和力结合大部分人类MHC变体，和(2)在病原体祖先中高度保守。这种肽可以通过计算方法或通过结合物的实验鉴定来鉴定⁹⁴。随后，选择的表位可以通过酶切位点连接在一起，以便于作为单个分子递送，或者作为单独的肽递送。这些基于肽的T细胞疫苗现已被证明对多种感染性疾病具有临床前前景。例如，编码多个新型冠状病毒表位的mRNAs^95,96诱导的强大CD4⁺和CD8⁺T细胞反应，在病毒攻击时引发对严重疾病的保护。另一项研究选择了保守的冠状病毒表位来产生泛冠状病毒T细胞疫苗，该疫苗比迄今为止在疫苗中使用的刺突蛋白具有更少的突变⁹⁷。这种方法可以用来生产一种疫苗，即使在病原体变异时也能提供长期保护。在另一项研究中，开发了一种由EP stein-Barr病毒的gp350蛋白组成的联合疫苗，这是一种含有20个CD8的“多表位蛋白”⁺T细胞表位和两亲性CpG佐剂。该疫苗在过继转移实验中产生了强大的体液和细胞免疫反应，并对EP stein–Barr病毒诱导的B细胞淋巴瘤产生了保护作用，突出了这些类型的组合疫苗的效用⁹⁸。另一个令人感兴趣的新兴领域是使用这些类型的T细胞疫苗来诱导控制或消除HIV感染。这些努力受到了HIV“精英控制者”的启发，由于CD8强，这些人在较长时间内病毒血症水平较低⁺感染细胞的T细胞中和⁹⁹。在一项诱导抗HIV T细胞反应的努力中，测试了聚乙烯亚胺(PEI)纳米颗粒诱导HIV免疫的能力，该纳米颗粒含有两个互补的镶嵌自扩增RNA (saRNA)序列，每个序列编码HIV-1 Gag和Pol蛋白的六个高度保守区域。这些疫苗诱导了强CD4⁺和CD8⁺接种疫苗后至少维持22周的T细胞反应。此外，T细胞显示了具有高效应子和中枢记忆亚型的结构记忆亚群，表明了这些saRNA多复合体的治疗潜力¹⁰⁰。目前，多种基于肽的疫苗正在几个临床试验中进行探索，以产生细胞和体液反应¹⁰¹.

核酸编码的抗原

设计和合成核酸能力的进步使得利用核酸货物如mRNA开发多种下一代疫苗成为可能¹⁰²，saRNA¹⁰³，环状RNA (circRNA)¹⁰⁴，质粒DNA¹⁰⁵，和封闭DNA¹⁰⁶来编码抗原。与基于病毒或蛋白质的疫苗相比，核酸疫苗能够实现更灵活的抗原设计。它们能够编码难以表达的复杂构建体，这些构建体可以被分泌和多聚化，或者是跨膜抗原。产生膜锚定抗原的能力是核酸疫苗的独特优势，因为与分泌型或细胞外抗原相比，核酸疫苗已显示出增强免疫原性^107,108。例如，FDA批准的新冠肺炎疫苗在其融合前构象中利用编码膜锚定的两个脯氨酸取代的全长刺突蛋白的mRNA。类似地，Moderna的RSV mRNA疫苗(mRNA-1345)编码跨膜融合F三聚体。核酸疫苗也可用于接种独特的融合或多聚体抗原，否则这些抗原可能难以表达和纯化¹⁰⁹。例如，这种用途已被用于融合补体裂解产物C3d，该产物与新型冠状病毒的RBD和刺突蛋白抗原融合。这种方法通过抗原与B细胞和滤泡树突细胞上存在的补体受体CD21的结合，大大增强了抗原特异性抗体的产生，从而增强了适应性免疫激活¹¹⁰。在另一项研究中，mRNA被用于表达膜锚定的HIV Env和SIV-Gag (SIV，猿猴免疫缺陷病毒)蛋白，以形成自我组装的VLP，更接近于自然感染过程中产生的病毒颗粒。用这些疫苗免疫诱导了广泛的中和滴度和强有力的抗包膜CD4⁺T细胞反应，降低恒河猴感染的风险¹¹¹。类似地，在人源化小鼠模型中，在铁蛋白纳米颗粒上表达HIV-Env三聚体的mRNA用于种系靶向和顺序加强诱导自体第2层中和抗体¹¹²。最近，通过在新型冠状病毒刺突蛋白(S-EABR)的C末端插入一个ESCRT结合区和ALIX结合区(EABR ), mRNA被用于开发一种新的VLP系统。S-EABR构建体引发的结合抗体滴度比传统的刺突蛋白mRNA疫苗高约100倍¹¹³。这些研究突出了核酸疫苗在容易产生不同的和新的抗原方面的效用，所述抗原增强了免疫反应的质量。

除了灵活的抗原设计，mRNA疫苗还能够靶向多种病毒抗原，这对于开发针对高度变异病原体的通用疫苗来说是一个关键因素。例如，相对于编码两种或三种抗原的疫苗，编码四种不同高度保守的Mpox病毒抗原的mRNA产生了更好的中和反应¹¹⁴。最近的一项研究开发了mRNA疫苗，在单一配方中编码20种HA蛋白，每种蛋白代表不同的甲型、乙型流感病毒谱系。在异源流感病毒攻击研究中，通过主要依赖于B细胞的机制，免疫的小鼠和雪貂免于严重疾病和死亡，几乎不涉及细胞免疫¹¹⁵。或者，可以设计mRNA来编码来自不同病毒株的关键免疫原性亚单位，以装配成单一嵌合免疫原。编码来自多种SARS样冠状病毒和新型冠状病毒变异体的RBD、N-末端结构域和S2亚单位的不同组合的mRNA产生了更广泛的交叉变异体中和滴度¹¹⁶。值得注意的是，Moderna开发了第二代mRNA疫苗(mRNA-1283)，它编码与刺突蛋白RBD相连的N-末端结构域。这种新的抗原设计产生了比临床使用的mRNA-1273更强的抗体反应，加强免疫在较低剂量(0.1 μg)下表现出更明显的效果¹¹⁷。在I期临床试验(NCT04813796)中，mRNA-1283以十分之一的低剂量引发了与临床使用的mRNA-1273相似的抗体滴度，表明这种策略具有节省剂量和降低反应原性的潜力，而不会损害诱导的保护作用¹¹⁸.

还需要仔细设计核酸序列以最大化抗原表达、免疫原性和稳定性。例如，密码子优化和生发中心富集等序列工程方法可能通过增强抗原呈递和生发中心应答来提高抗原表达水平，从而提高免疫应答的质量^119,120。更先进的优化技术，除了密码子使用外还考虑mRNA二级结构，可以进一步提高免疫原性和mRNA稳定性。据报道，一种考虑密码子使用和mRNA结构的优化算法显示，与未优化的mRNA序列相比，通过IgG滴度测定，蛋白质表达提高了128倍，免疫原性提高了100倍。此外，该算法可用于提高mRNA的化学稳定性¹²¹。除了优化抗原编码序列，还可以优化基因启动子和5’/3’非翻译区，这可以进一步将抗原表达增加几倍¹²²。最后，诸如优化抗原以减少流感病毒神经氨酸酶催化域的策略可能会降低反应原性¹²³。核酸设计的巨大潜在优化空间通常要求在疫苗开发过程中筛选几种核酸序列。

延长抗原表达是增强免疫反应的另一种方法，它有可能消除加强剂量的需要。延长的抗原表达和呈递促进了延长的生发中心反应，导致改善的抗体亲和力成熟、类别转换和中和广度¹²⁴。例如，saRNA编码疫苗抗原和病毒RNA复制机制的开放阅读框，这促进了RNA复制和抗原表达的指数级级联。已经显示saRNA比常规mRNA诱导更长时间的表达。据报道，在小鼠中，saRNA的表达峰值出现在大约9天后，而mRNA的表达峰值出现在大约6小时后¹²⁵。saRNA曲线下的所得表达面积比mRNA的高约300倍。saRNA现已在日本获得临床批准，用于ARCT-154新冠肺炎疫苗。ARCT-154仅使用5 μg的saRNA剂量就显示出对新冠肺炎的强保护作用，这相对于其他批准的mRNA疫苗是低的¹²⁶。增强和延长RNA翻译的替代方法包括合成修饰，如环化^127,128、或合成寡核苷酸的缀合，以通过防止胞质降解来提高RNA半衰期¹²⁹。与传统mRNA相比，这些方法中的每一种都显示出体内表达延长长达7天，传统mRNA的表达在第3天基本上检测不到。与RNA不同，DNA可以诱导多周抗原表达^130,131。然而，DNA递送更具挑战性，因为它需要用于功能表达的核递送，并且可能诱导更高的先天免疫激活，如下所述。诸如喷射注射的技术目前用于临床，但是疫苗的免疫原性仍然有限¹³²。可能需要用于高水平核DNA递送的改进方法来诱导延长的抗原表达和增强免疫反应。

除了编码感兴趣的抗原，核酸疫苗是“自佐剂的”，因为核酸和纳米颗粒递送系统可以激活增强疫苗应答的先天免疫途径。在mRNA疫苗中，mRNA和来自mRNA转录的双链RNA副产物被内体中的TLR7/8和TLR3以及胞质溶胶中的RIG-I样受体如MDA5识别^133,134。MDA5还能感知不含内源性ADAR1肌苷编辑的外源RNA¹³⁵。含有5′-三磷酸的未加帽的mRNA杂质也结合并激活RIG-I¹³⁶。这些RNA感应途径的激活产生I型干扰素，如IFN-α，并增强APC的激活。机制研究表明，特别是MDA5的识别在小鼠对BNT162b2疫苗接种的应答中起着重要作用^137,138. Mda5^−/−和Ifnar1^−/−小鼠表现出显著降低的APC活化、CD8 T细胞启动和中和抗体生成。然而，过度的先天免疫激活也可能导致不期望的反应原性。RNA疫苗已被证明能激活致热信号通路，包括前列腺素E2的产生^137,139。此外，mRNA疫苗可以诱导IFN-γ，特别是在加强免疫剂量后。这导致募集先天免疫细胞并改善抗原特异性免疫反应，但它也可能使巨噬细胞对NLRP3炎症小体的激活和IL-1β的产生敏感，IL-1β被认为是疫苗反应原性的关键介质之一^138,140,141.

因此，在疫苗开发过程中，必须权衡疫苗的免疫刺激和潜在的反应原性。一种限制mRNA先天识别的策略是通过用尿苷类似物取代尿苷来阻止TLR7/8识别¹⁴²。尿苷修饰可以通过去除双链RNA杂质来进一步补充，这降低了TLR3、RIG-1和MDA5的识别。总之，这些策略减少了对疫苗接种的细胞因子产生，并提高了小鼠的抗体滴度¹⁴³。临床试验同样表明，尽管修饰和未修饰的RNA都能导致人类疫苗反应，但尿苷修饰始终能降低反应原性效应。Moderna的Spikevax和辉瑞-BioNTech的Comirnaty新冠肺炎疫苗利用N¹-甲基假哌啶修饰^107,108。然而，在某些情况下，未修饰RNA的额外先天免疫刺激也可能有利于产生更强的疫苗应答。据报道，未修饰的mRNA可诱导更强的CD8 T细胞反应，因此在临床上仍在继续探索，特别是用于癌症疫苗^144,145。此外，修饰核苷酸的一个意想不到的后果是它们可能影响翻译的保真度¹⁴⁶。最近的一项研究报告称N¹编码尖峰mRNA的-甲基假哌啶修饰的mRNA诱导+1核糖体移码和随后CD8的产生⁺T细胞对移码产物的反应，引起了对诱导自身反应性T细胞的潜在关注¹⁴⁷。然而，这种效应是由于mRNA中的特定序列，因此考虑这一因素有助于在未来设计更安全的mRNA疗法。总的来说，mRNA激活先天免疫的作用需要在保护性免疫和反应原性的背景下进一步描述。

DNA疫苗还可以激活TLRs和RIG-I样受体，这可能会影响疫苗接种的结果，尽管这在疫苗应答中的作用还没有得到很好的描述。DNA中的CpG基序(人类中的5′-GTC gtt-3′)可能是DNA中最著名的免疫激活成分，被内体中的TLR9识别。胞质DNA也通过STING途径激活先天传感器。最值得注意的是，STING激活通过cGAS的2′3′环GMP-AMP合成发生，尽管STING激活也可以通过DDX41、DAI和IFI16发生。除了STING激活，胞质DNA也可能通过MyD88依赖性途径和LRRFIP1/β-连环蛋白刺激1型干扰素的产生。胞质DNA也通过与AIM2的相互作用促进炎症体的激活和IL-1β的产生¹³⁴。最后，RNA Pol III对胞质DNA的转录可以通过上述RNA介导的途径导致免疫感应。

DNA的先天免疫激活在疫苗接种结果中的作用还没有像RNA疫苗那样被广泛研究，尽管它似乎在疫苗效力中起着关键作用。例如，CpG基序似乎能显著增强疫苗反应¹⁴⁸尽管有证据表明去除CpG基序以消除TLR9激活似乎增强了转基因表达^149,150。STING和AIM2在DNA疫苗反应中也起着至关重要的作用^151,152。然而，最近出现了新的DNA载体，如纳米质粒和封闭端DNA，它们具有较低的先天免疫激活，但仍能诱导强大的适应性免疫反应^153,154。此外，由DNA引起的先天免疫激活在疫苗反应原性中的作用尚未得到临床研究。随着DNA疫苗进一步进入临床，重点应该放在理解先天免疫感应、抗原表达、保护性适应性免疫和反应原性之间的相互作用上。

佐剂

疫苗的佐剂成分通过激活先天免疫细胞增强对抗原的免疫反应，先天免疫细胞反过来刺激适应性免疫反应。铝盐(明矾)和水包油乳剂是已批准疫苗中最常用的佐剂。这些佐剂通过在注射部位创造局部发炎的环境来招募免疫细胞¹⁵⁵。MF59是一种含有角鲨烯的水包油乳液，在免疫接种后3小时内启动细胞募集，并持续长达11天¹⁵⁶。然后，这种募集增强了抗原呈递和抗原向局部引流淋巴结的运输，从而增强了适应性免疫反应^157,158。然而，这些佐剂的先天免疫刺激可诱导炎症反应，从而导致局部和全身反应原性。某些溶细胞佐剂(如明矾)的免疫刺激是通过损伤相关分子模式激活的NLRP3炎症体途径介导的，该途径与接种部位的严重局部反应有关¹⁵⁹。因此，这些佐剂仅适用于肌内接种，因为当皮下或呼吸道接种时，它们会在接种部位引发过度炎症^17,160。因此，佐剂的使用必须与疫苗接种的潜在不良反应仔细权衡。

其他临床批准的佐剂通过模拟病原体相关分子模式，通过更明确的途径参与免疫系统，这些分子模式使细胞上的PRRs参与诱导更强的免疫反应。单链和双链寡核苷酸类似物如poly:IC、AS01/AS02/AS04、咪喹莫特、瑞西喹莫特和CpG分别激活TLR3、TLR4、TLR7、TLR7/8和TLR9途径^161,162。TLR激动剂在动物模型和人体中接种疫苗后都显示出保护性抗体滴度的提高¹⁶³。例如，FDA批准的乙型肝炎疫苗利用TLR9激动剂CpG-1018作为佐剂，与重组蛋白HBsAg共同递送¹⁶⁴。其他临床批准的TLR激活佐剂由在调节免疫反应中协同工作的成分组合而成。例如，葛兰素史克公司开发了被称为佐剂系统的复合佐剂。现在临床批准的疫苗中使用三种佐剂系统配方:AS01 (QS-21、单磷酰脂质A和脂质体)、AS03(油/水乳剂和维生素E)和AS04(被明矾吸收的单磷酰脂质A)。有趣的是，这些成分的变化可以针对感兴趣的病原体定制免疫反应。AS01和AS04产生T细胞偏向的免疫反应，而AS03增强抗体产生。然而，TLR信号有时会导致以亲和力成熟为代价产生高抗体滴度，导致较弱的保护性反应，正如在一些快速突变的病原体如HIV中观察到的那样^165,166。因此，佐剂对免疫反应质量的影响必须得到彻底和有力的表征^81,158.

另一项进展是确定了植物来源的化合物作为有效的佐剂。皂荚树(皂树)提取物是这类佐剂中最成熟的化合物，用于上述AS01和Novavax的Matrix-M。Matrix-M是一种专利佐剂，使用皂苷组分A和C与胆固醇和磷脂一起配制，生成笼状纳米颗粒。它激活注射部位和引流淋巴结中的先天免疫细胞，产生Th1细胞偏向的免疫反应。Matrix-M经FDA批准，用于抗新型冠状病毒的诺华疫苗(NVX-CoV2373)¹⁶⁷。另一种源自植物的多糖菊粉也被用于开发微粒，以增强多种传染病(包括艾滋病毒、流感和结核病)中抗原的免疫原性。Advax放大了抗原的先天佐剂性，并且不影响产生的Th1/Th2免疫应答。尽管Advax具有较好的免疫原性和耐受性，但其佐剂作用的机制尚不清楚¹⁶⁸.

除了增强免疫原性，一些佐剂已经被优化以最小化不期望的反应原性。例如，单磷酰脂质A诱导强有力的Th1-偏向性免疫，同时表现出比脂多糖低1000倍的反应原性¹⁶⁹。对于基于植物提取物的佐剂，将QS-21掺入脂质体(AS01)或混合不同的皂苷级分(Matrix-M)降低了反应原性，同时保持了佐剂性¹⁶²。类似地，早期流感疫苗中使用的油包水乳剂比新型MF59佐剂引起更高的反应原性。然而，考虑到已获许可的佐剂据报道比安慰剂或无佐剂对照组诱导更高的反应原性，仍有改进的机会¹⁷⁰。许可后监测报告也将这些佐剂与一些罕见的不良事件联系在一起，但涉及的全部因果关系和机制尚不清楚¹⁷¹。因此，需要继续努力开发新的佐剂并进一步优化其免疫原性和反应原性。

为此，已经开发了新的佐剂，其增强了向淋巴结的运输，或者甚至消除了对单独佐剂的需要。在一项这样的努力中，CpG与亲脂性脂肪酸分子结合，诱导白蛋白结合。这阻止了它在血液中的传播并增加了向淋巴结的转移¹⁷²。类似地，α-生育酚缀合的TLR9激动剂是根据白蛋白搭便车的类似原理设计的，并且产生了针对乙型肝炎病毒感染的增强的免疫反应¹⁷³。另一项研究检测了用聚乙二醇配制的聚丙交酯共轭TLR7b-聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)生成的TLR7纳米颗粒，具有增加的淋巴结引流，产生持久的免疫刺激作用¹⁷⁴。这些侧重于调节佐剂的理化性质的策略可以进一步扩展到多个不同的平台，为开发下一代佐剂提供新的途径。其他新型疫苗平台，如基于mRNA的疫苗，由于mRNA中外源模式和序列的存在，表现出自佐剂特性^6,102。此外，递送mRNA的LNP可以通过特异性相互作用或通过非特异性先天免疫细胞募集来刺激先天免疫系统(参见脂质纳米粒部分)。

递送系统

常规平台，如灭活和减毒活疫苗，不需要任何外部递送载体。然而，许多利用重组蛋白、DNA、mRNA或肽表位作为抗原的新兴疫苗平台被配制成纳米载体或合成支架。将制剂加入接种系统可保护活性成分不被酶降解，减少清除率，并改善货物向APCs的递送^{175,176,177,178,179}。除了提供稳定性之外，这些递送系统可以控制疫苗动力学、赋予佐剂性并防止佐剂的全身分布以限制毒性。这些递送材料也可以被工程化以控制抗原呈递，以及疫苗的细胞和亚细胞定位，这可以定制随后对不同病原体的免疫反应^180,181.

递送载体可以主要分为病毒载体和非病毒递送载体。病毒载体是由工程病毒开发的基因递送平台，而非病毒递送载体包括合成纳米载体，如LNPs、PNPs、聚合物和其他基于无机纳米粒子的载体^182,183,184。这些递送载体也可以被整合到更宏观的生物材料支架中，例如水凝胶、微粒、植入物和微针，它们可以通过提供抗原的持续释放来增强对疫苗的免疫应答^185,186。例如，在小鼠和灵长类动物中进行的研究表明，通过重复注射或控制释放延长抗原的产生将生发中心B细胞增强了三至五倍，并将抗体反应放大了十倍^124,187。通过调节疫苗治疗成分的时空递送，工程材料有可能在疫苗中发挥重要作用，从而改善其免疫原性并最小化相关的反应原性和毒性。在以下章节中，我们重点介绍了在临床前和临床研究中用于递送疫苗抗原和佐剂的不同非病毒递送载体，并讨论了它们的优势和局限性。

脂质纳米粒

迄今为止，LNP是FDA批准的基于mRNA的疫苗的唯一递送载体。辉瑞-BioNtech、Moderna和Arcturus新冠肺炎疫苗，以及临床试验中大多数基于mRNA的疫苗，在其配方中使用了LNP。临床批准的LNP由四种类型的脂质组成:可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇脂质¹⁸⁴(PEG =聚乙二醇)。可电离脂质促进内体逃逸，辅助脂质和胆固醇为脂质膜提供结构和流动性，PEG-脂质促进LNPs的胶体稳定性。

在mRNA疫苗中，LNP通过保护mRNA免受细胞外核酸酶降解、促进APCs中的表达和激活免疫刺激途径来增强疫苗的免疫原性。LNP通常是肌内接种，这导致局部抗原表达和先天免疫细胞(包括中性粒细胞、单核细胞、树突细胞和巨噬细胞)募集到注射部位¹⁸⁸。Moderna的研究表明，肌肉中mRNA LNP的摄取和表达主要发生在巨噬细胞、成纤维细胞和脂肪细胞中，而不是内皮细胞或肌肉纤维中，尽管后者构成了肌肉组织的大部分。抗原表达也发生在局部引流淋巴结中，推测是通过来自肌肉的LNPs的细胞运输。在淋巴结内，在巨噬细胞中mRNA表达最高，在经典单核细胞、常规树突细胞、浆细胞样树突细胞、T细胞和B细胞中观察到较低水平的表达^189,190。mRNA LNPs也可能以较小的程度到达体循环，并在其它器官如肝和脾中诱导表达。尽管在各种组织和细胞类型中LNP的大部分摄取是由ApoE/LDLR相互作用介导的，但这取决于LNP化学和配方，这种机制在疫苗接种的背景下还没有被广泛研究。虽然现有的LNP已被证明在诱导抗原表达和APC活化方面是成功的，但仍在努力寻求提高表达水平，调节LNP的免疫活化，并更具体地靶向APC。

设计更有效的LNP的许多创新源于优化可电离脂质的分子结构。辉瑞-BioNTech和Moderna的新冠肺炎疫苗(SM-102和ALC-0315)中使用的可电离脂质是数十年来脂质设计不断改进的结果。这些脂质主要通过静电相互作用与带负电荷的RNA结合，它们结合了结构特征，如分支尾和头基，这提高了RNA递送的效率(图。3b)。可电离脂质和RNA之间的超分子相互作用，如氢键，可以进一步提高mRNA转染能力^191,192。这些可电离的脂质还具有可生物降解的基团，如酯，通过快速清除脂质来提高疫苗的耐受性。在选定国家批准或处于临床试验中的疫苗LNP中使用的其他可电离脂质包括额外的结构多样性(图。3)。自扩增mRNA疫苗ARCT-154(表1)利用专有的LUNAR LNPs和可电离脂质ATX-100，其包含硫代氨基甲酸酯基团和分支尾部¹²⁶。Abogen的新冠肺炎疫苗使用一种专利配方，包括一种可电离的脂质，带有多种可电离的胺和分支的尾部^193,194,195。不包含分支尾部结构的多种其他可电离脂质已经证明了有效的mRNA递送。例如，Bionet-Asia和ChulaCov19利用Genevant的专利脂质10，它具有三个尾部，每个尾部有一个z-烯烃^196,197(图。3)。在另一项临床试验中，Translate Bio和赛诺菲使用了一种类似于cKK-E10的可电离脂质，它具有完全饱和的尾部，没有分支¹⁹⁸。有趣的是，这种脂质可以被认为是由两个通过二酮哌嗪二赖氨酸接头连接的可电离的小脂质组成^199,200。或者，已经开发了多种可电离脂质，它们不表现出上述化学特征，但保留了与最早一代可电离脂质如DODMA和DLin-DMA-MC3的结构相似性。第一三共的mRNA疫苗(表1)包含可电离的脂质，保留化学特征(两条尾巴z-链烯和二甲氨基丙基首基)从DLin-DMA-MC3(参考文献²⁰¹)。同样，默克公司具有不对称尾部结构的不可降解可电离脂质L-608在最近的RSV mRNA疫苗I期临床试验中得到了应用(表1)与Moderna合作，但该方案已经结束²⁰²。除了mRNA递送之外，在学术和商业风险中已经进行了许多努力，以使用其他核酸生物制剂如circRNA和DNA来开发下一代疫苗^127,203。开发新的可电离脂质以进一步增强基于核酸的疫苗的免疫原性仍然是主要关注的领域(图。4)。

纳米颗粒在疫苗设计中具有多重优势。抗原包裹保护货物免受核酸酶降解，并减少网状内皮系统的清除。NP封装进一步允许通过抗原呈递细胞(APCs)增强疫苗抗原的细胞摄取，并改善NP向淋巴结(LNs)的引流。纳米颗粒能够在其表面呈递多价抗原，增强免疫刺激。控制释放能够在注射后的不同时间点精确调节免疫原动力学和有效性。NPs的内源性特性可以通过靶向注射部位的特定受体或趋化因子梯度来影响免疫细胞的募集。这些因子单独或联合在产生增强的细胞和体液免疫中起着关键作用。LNP，脂质纳米粒；VLP，病毒样粒子。

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ALC-0315和SM-102分别用于由BioNTech/Pfizer和Moderna开发的FDA批准的新冠肺炎疫苗。MC3和Merck-32 (L608)被Merck和Moderna用于其RSV疫苗试验²⁰²。Bionet-Asia和ChulaCov19使用了Lipid 10。在其他已完成/正在进行的研究中使用的可电离脂质尚未公开披露，因此我们阐述了最接近的可能类似物的代表性结构。蓝色的氮原子代表可电离的胺。

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除了由mRNA激活的免疫感应途径(在前面的章节中讨论过)，LNP本身也可以诱导炎症信号的表达，而不依赖于它们的货物^20,204。LNP已被证明是佐剂蛋白亚单位疫苗，对编码相同抗原的mRNA产生相似的抗体滴度。免疫反应似乎也依赖于可电离脂质，其依赖方式并不总是与抗原表达水平直接相关。几项研究已经鉴定出比DLin-DMA-MC3 LNPs耐受性更好的可电离脂质，尽管其引起更高的mRNA表达和更强的疫苗反应^191,196,205。尽管LNPs的佐剂效应增强了保护性免疫反应，但它可能导致不希望的副作用。例如，一项研究表明，空的SM-102 LNP激活外周血单核细胞中的NLRP3炎症小体，刺激IL-1β的产生，这被认为是疫苗反应原性的原因¹³⁸。LNP激活炎症小体或其他促炎通路的确切机制仍在研究中。LNPs的佐剂效应已被证明依赖于可电离脂质的内含物，可电离脂质是负责内体逃逸的关键成分，这表明内体破坏可能是免疫激活的关键途径。事实上，巨噬细胞内内体运输的破坏已被证明诱导NLRP3炎症体激活²⁰⁶。内体膜破裂也招募半乳凝素，并标记破裂的膜进行自噬，然后释放炎症信号²⁰⁷。在病毒和脂质体的情况下，也已经证明膜融合可以诱导刺痛活化²⁰⁸。除了核内体破坏，LNP被认为直接与TLRs相互作用，尽管有结果表明LNP以不依赖于MyD88的方式起作用^20,209。PEG-脂质成分也可能通过募集预先存在的PEG抗体和潜在触发超敏反应(如补体激活相关的假过敏)而在反应原性中发挥作用²¹⁰。鉴于LNP可能引发各种炎症途径，在疫苗开发过程中必须考虑这些属性，以确保免疫原性和反应原性之间的平衡，并确保新制剂在临床转化前的耐受性。

最近的努力已经确定了新的LNP，其以更可控的方式刺激免疫系统，这可以防止系统性副作用。例如，含环胺或已知的带有首基的STING激动剂可有效地通过STING途径刺激1型干扰素并增强适应性免疫反应^211,212。在另一项最近的研究中，将TLR7/8激动剂引入可电离的脂质中，并作为第五种成分掺入LNPs中，与不含TLR激动剂的制剂相比，其诱导了更多抗原特异性CD4和CD8 T细胞，具有更强的Th1偏向性²¹³。针对新型冠状病毒刺突蛋白的RBD的抗体滴度也显著增加。另一个小组使用类似的方法进行癌症免疫治疗²¹⁴。TLR激动作用的一种对比方法是用短的3-mer寡核苷酸选择性阻断内体TLR7，以抑制mRNA-LNPs的一些反应原性反应²¹⁵。另一种方法是使用化学修饰的寡核苷酸选择性靶向激活TLR7而不激活TLR8，其诱导较少的炎性细胞因子，同时仍然促进有效的适应性免疫反应²¹⁶。Idera和Merck采用了类似的方法，开发了化学修饰的寡核苷酸，它们或者是TLR8选择性的，或者是TLR7/8激动剂。寡核苷酸被封装到LNP中，增强了对刺激先天免疫反应的控制^217,218。其他TLR如TLR9的竞争也已经被探索。例如，CpG脱氧寡核苷酸已被封装在LNP中，以增强对常规甲型流感裂解疫苗的免疫反应²¹⁹。这些靶向刺激策略为降低反应原性和改善佐剂性提供了潜在的解决方案，同时易于配制成LNPs。

除了受控的免疫刺激之外，还有致力于将LNP靶向特定组织和细胞以增强保护性免疫反应的努力。肌肉注射目前的LNPs导致相对非特异性的摄取，这可导致过度的免疫激活、B/T细胞启动不良以及最终需要更高的剂量。已经假设直接淋巴结靶向，或更具体地APC靶向可以导致更有效的抗原呈递，同时减少炎症^172,220。为此，最近的努力集中在树突细胞靶向mRNA-LNP的开发上。最近的一项研究利用唾液酸修饰的胆固醇作为制剂的一部分来靶向广泛表达于树突细胞表面的siglec-1受体²²¹。类似地，利用甘露糖化的PEG-脂质靶向树突细胞和巨噬细胞上的甘露糖受体以递送狂犬病病毒糖蛋白抗原circRNA，与它们的非靶向对应物相比，产生了更好的抗体滴度²²²。除了主动靶向外，还探索了粘膜施用LNPs来触发粘膜免疫以获得更强的保护性反应。例如，使用在传统Moderna疫苗制剂中掺入了额外的未公开脂质的优化鼻内LNP制剂的鼻内LNP接种被证明有效地保护了天真的仓鼠免受新型冠状病毒病毒感染³³。使用基于脂质缀合树突的纳米颗粒的肌内免疫和鼻内加强的组合已经在呼吸道中实现了高水平的循环记忆T细胞^223,224。然而，鼻内给予LNPs可诱导快速嗜中性粒细胞浸润，并通过RIG-I、NLR和TLR激活刺激炎症途径，导致严重的肺部炎症和较高剂量下动物模型的潜在死亡率^224,225。鉴于这些靶向LNP分娩方法相对较新，还需要更多的研究来确定其有效性和安全性。

基于聚合物的系统

聚合物是最早被鉴定用于有效细胞内核酸递送的材料之一，并且已经被广泛用于疫苗应用。像脂质一样，核酸与聚合物的复合主要由阳离子聚合物和阴离子核酸之间的静电相互作用驱动。已经利用不同的主链、单体和结合的额外功能，例如疏水性和生物可降解性，探索了用于核酸递送的聚合物的大量结构多样性²²⁶。PEI可能是用于DNA递送的最成熟的聚合物，并且继续被广泛使用。Pei表现出高的阳离子电荷密度，这使得强的核酸复合、摄取和随后的内体逃逸成为可能。已经提出PEI和其他聚合物通过质子海绵效应促进内体逃逸，这导致渗透梯度使内体破裂；然而，最近的研究对这一假设的真实性提出了质疑。BioNTech已经在临床前使用PEI来递送编码流感HA的mRNA和saRNA。他们的含有编码三种不同HA亚型的saRNA的三价纳米颗粒疫苗赋予了受到病毒攻击的小鼠保护性免疫力²²⁷。另一项调查结构-活性关系的研究显示，更高的电荷密度和增加的分子量增加了PEI复合物的saRNA递送功效²²⁸。或者，以环糊精部分为特征的PEI证明了在鼻内接种后，HIV编码mRNA有效递送至鼻淋巴组织，在小鼠中产生强烈的全身和粘膜免疫反应²²⁹。然而，PEI是不可降解的，并且由于高电荷密度而引起细胞毒性问题，限制了其临床转化的潜力。

因此，正在进行的努力集中于开发毒性降低的新型生物可降解聚合物。例如，以可还原二硫键为特征的阳离子聚酰胺胺(称为pABOL)表现出较低的细胞毒性。此外，这些可生物降解的类似物在用HA编码的saRNA免疫时诱导高结合和中和IgG滴度，其保护免于致死性流感攻击²³⁰。聚酰胺胺也已经用于产生脂质树枝状聚合物，其递送mRNA以诱导针对几种病原体的保护性免疫，包括H1N1流感，弓形虫和埃博拉病毒^224,231,232。此外，新的脂质聚酰胺-胺树枝状聚合物、组氨酸和赖氨酸承载多肽LNPs已被用于临床前研究，以开发针对几种感染性疾病的基于mRNA的疫苗²²³。另一类可生物降解的阳离子聚合物包括聚(胺-共-酯)(PACE)，其可以使用二酯与氨基取代的二醇的酶促共聚来合成²³³。可以通过改变单体和内酯含量的比例，以及通过用合适的端基进行聚合物后修饰来定制PACE聚合物，以获得高mRNA转染效率。90%端基修饰的PACE和10% PACE-PEG在肺中表现出高mRNA转染，特别是在上皮细胞和APCs中。该制剂被用于开发鼻内疫苗，其诱导全身性和肺驻留适应性免疫，保护小鼠免受致死性新型冠状病毒攻击²³⁴。脂质碳酸酯和α-氨基酯的嵌段共聚物被称为电荷改变可释放转运蛋白，已被用于递送环状RNA或mRNA形式的抗原^235,236.

除了核酸之外，聚合物还被用于递送蛋白质亚单位抗原和佐剂，用于有效的疫苗反应。聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)可能是在该应用中使用的最成熟的聚合物。PLGA是一种高度可降解、生物相容且经FDA批准的聚合物，可减少这些材料临床转化的障碍。PLGA纳米颗粒已被用于共包封佐剂和抗原，其协同增强了对疫苗接种的体液反应。包裹TLR4、TLR7/8激动剂和HA抗原的纳米颗粒诱导了极强的抗原特异性体液应答，这由持续的生发中心反应和长寿命的浆细胞所证实。这种增强的体液反应归因于多个树突细胞亚群中TLRs的激活和B细胞发育的直接触发²³⁷。已经研究了包封TLR7/8激动剂3M-052和gp140抗原的PLGA纳米颗粒在NHPs中的疫苗效力。与明矾佐剂抗原相比，用3M-052佐剂诱导了实质上更强(~100倍)的抗体反应，并且还导致了骨髓中抗原特异性长寿浆细胞的发展。这些长寿命的浆细胞持续到70周研究结束，表明该平台具有诱导终生免疫的潜力²³⁸。在另一项以艾滋病毒为重点的研究中，产生抗猴免疫缺陷病毒中和体液应答的PLGA亚单位疫苗与异源病毒载体疫苗相结合，产生CD8 T细胞应答。有趣的是，异源病毒载体疫苗产生的CD8 T细胞应答似乎增强了对NHPs中感染的保护，这产生了低中和抗体滴度，表明强的细胞应答对于HIV疫苗的开发可能是重要的⁴⁰。PLGA还具有粘膜穿透性，已被用于开发口服和鼻内接种的疫苗幽门螺杆菌和流行性感冒^239,240。其他聚合物如脱乙酰壳多糖和PEI也已用于抗原如新型冠状病毒刺突蛋白RBD的粘膜递送²⁴¹。虽然这些聚合物-PNP已经在临床前进行了广泛的评估，但它们还没有转化为临床应用。

聚合物也已经直接与佐剂和抗原结合，这提供了一种独特的方法来在空间上控制这些材料的生物分布，同时通过多价相互作用增强免疫反应。这种方法被用于将疟疾抗原通过自发连接物偶联到由带有甘露糖结合和TLR7佐剂功能的单体组成的无规共聚物上，p(Man-TLR7)。相对于单独的抗原，缀合的抗原表现出树突状细胞摄取增加，并诱导抗体滴度增加和寄生虫负荷减少²⁴²。在随后的工作中，新型冠状病毒与p(人-TLR7)结合，在小鼠中产生有效的体液和细胞反应²⁴³。TLR7/8激动剂也与超支化聚合物结合，然后与HIV gp120亚单位抗原共同接种。与传统的小分子佐剂相比，这导致了Th1-偏向性反应的改善，这通过更强的抗体滴度和Ig2c类型转换得以证明²⁴⁴。还研究了通过鼻内途径将RIG-1和TLR激动剂与可溶性和纳米颗粒缀合的刺突蛋白抗原联合共递送。佐剂共递送增强了整体免疫应答，其中刺突结合疫苗诱导Th1和T_空间细胞反应，而可溶性蛋白在肺中诱导局部IgA反应。然而，肌内施用掺入缀合的纳米颗粒未能诱导强烈的抗原特异性IgG反应，这可能是由于纳米颗粒的大尺寸(> 200 nm)，导致淋巴结引流不良并阻碍了与B细胞的相互作用²⁴⁵。类似地，鼻内注射与流感病毒核蛋白结合的pH响应性颗粒引起强烈的抗原特异性T_空间鼻腔气道和肺间质中的细胞反应，保护小鼠免受致命病毒攻击²⁴⁶。与抗原结合的生物聚合物已被用于增强免疫反应。例如，衍生自肺炎链球菌与刺突蛋白RBD结合，诱导针对所关注的不同变体的交叉反应中和抗体²⁴⁷。尽管这类佐剂聚合物似乎能有力地增强免疫反应，但还需要更多的研究来评估其潜在的反应原性。

生物灵感纳米粒子

通过与B细胞受体的多价相互作用，用多拷贝的病毒抗原设计支架的表面可以增强对疫苗接种的免疫反应^18,248。对多价抗原疫苗接种反应的生发中心动力学的研究表明，多价性增强了B细胞分裂和CD4⁺T细胞募集。基于这些结果，假设B细胞活化和分裂是体液疫苗反应发展的主要限制因素，突出了多价抗原的效用²⁴⁹。此外，VLP抗原可促进增加被聚糖屏蔽的亚优势区域的表位可及性，或降低非中和表位的可及性，从而扩大抗体中和^158,250。VLPs通常通过融合蛋白的重组表达或利用PNPs、VLPs、脂质体、外来体或胶束的合成制造来产生。

由流感病毒的HA、神经氨酸酶和基质1蛋白组成的重组VLPs也被用于开发新型流感疫苗。已经开发了HA、神经氨酸酶和基质1蛋白的多种组合，在临床前和临床研究中证明了高免疫原性^251,252,253。重组表达的VLPs也被Medicago用于开发新型冠状病毒疫苗，该疫苗利用了植物表达平台(本氏烟草)产生预融合稳定的刺突蛋白，该蛋白自组装成被称为CoVLPs的包膜囊泡。这些辅加ASO3的CoVLPs诱导了比2019恢复期血清高10倍的中和抗体滴度，具有平衡的Th1/Th2细胞反应(NCT04450004)²⁵⁴。这些临床成功证明了重组VLPs用于疫苗接种的效用。

VLP也已经被合成产生，以将抗原自组装成病毒样形态，从而产生具有增强的免疫原性的疫苗。例如，脂质体已被用于掺入或展示多种不同的抗原，以提高引流淋巴结中存在的免疫细胞对抗原的识别和摄取。例如，带有钴卟啉磷脂基团的脂质体用聚组氨酸标记的疟疾抗原(Pfs25)进行后功能化。这些具有稳定抗原呈递特性的纳米颗粒在小鼠和兔子中诱导了10倍强的功能性抗体产生²⁵⁵。其他工作通过磷酸丝氨酸接头将锚定部分与蛋白抗原结合，将成熟的佐剂明矾转化为VLP。与未锚定的抗体相比，锚定在明矾上的抗原通过增强APC摄取和B细胞活化，使抗体滴度提高了48倍¹⁵⁸。这些合成材料代表了重组表达的一种有吸引力的替代物，因为它们本身是模块化的，并且可能不需要针对每种抗原进行重新设计。

除了人造脂质体之外，从细胞中分泌的天然来源的膜结合囊泡，如外来体，已经成为一种新的递送平台。外来体可以固有地运输核酸，并且具有高稳定性、耐受性和组织穿透性，以及固有的辅助性。与新型冠状病毒刺突蛋白的RBD结合的肺源性外来体被用于开发可吸入疫苗，该疫苗在小鼠气道中产生强大的免疫²⁵⁶。这些肺来源的外来体随后通过干粉吸入用于mRNA递送，与它们的合成对应物相比，表现出更高的肺滞留和分布，以及更强的免疫反应²⁵⁷。非哺乳动物载体，如革兰氏阴性菌的外膜小泡，由于其内在的佐剂性，也已被利用²⁵⁸。与其他VLP平台相比，这些平台尚不成熟，需要进行更多的研究来确定其耐受性和免疫原性。

疫苗是现代医学开发的最重要的工具之一，在过去的一个世纪里，疫苗大大提高了预期寿命和生活质量。下一个世纪将需要疫苗技术的进步，以根除逃避免疫的疾病，包括艾滋病毒、疟疾、结核病、流感和新型冠状病毒病毒，所有这些疾病要么没有疫苗，要么需要经常加强剂量以对抗突变。此外，改善这些疫苗平台的热稳定性、制造和管理的策略对于满足发展中国家的需求至关重要。这些进展的重要性也许在新型冠状病毒疫情得到了最好的强调，其中一项新生的疫苗技术mRNA在疫苗开发竞赛中走在了前列。未来十年将需要重新关注疫苗研究，旨在改善疫苗平台，更好地了解我们的免疫系统对这些平台的反应。

最大化免疫反应并降低反应原性

为了确保疫苗开发过程中的公众依从性，最大限度地减少剂量和相关的反应原性至关重要。创新的抗原设计有助于实现这一目标¹¹⁸优化的免疫方案^11,259和先进的运载工具。扩展抗原可用性的有效递送系统可能有助于减少所需剂量。此外，通过优化mRNA设计或通过使用替代遗传平台如saRNA、circRNA和质粒DNA，可以获得增强的递送效率和延长的表达。此外，这些针对各种疫苗平台的剂量降低研究应该在多个物种中进行，包括小鼠、灵长类动物和人类，因为在物种之间观察到的递送和表达谱存在巨大差异。改进的体外筛选工具和人性化的动物模型可能有助于加速疫苗开发，增加临床试验中的有效性和安全性的可能性^260,261。例如，赛诺菲已经使用一种新的体外筛选平台“MIMIC”(模块化体外免疫构建物)来测试临床前候选疫苗^262,263。分析反应原性背后的潜在机制也很重要，以便更好地理解如何减轻反应原性。使用系统生物学或体外人类类器官/共培养筛选分析患者样本的方法可以在这方面提供重要的见解。尽管几项研究提供了对这种生物学机制的重要见解，但在理解疫苗成分中可能影响反应原性的化学/遗传因素方面，该领域仍有很大差距。

疫苗佐剂可以在节省剂量、扩大对不同抗原的免疫反应和增强具有独特免疫特征的脆弱人群的免疫原性方面发挥关键作用。尽管目前临床上使用的分子佐剂在增强随后的免疫应答方面表现出高效，但它们也表现出反应原性的发生率。在免疫细胞中发现能够控制免疫激活的新靶点，可能有助于开发能够引发有利的适应性免疫反应的佐剂。将这些佐剂整合到下一代疫苗中可以增强免疫原性并减少副作用，类似于细胞因子或免疫调节剂的共同接种已被证明可以提高基于mRNA的癌症疫苗的治疗效果。这种方法也为传染病带来了希望。或者，下一代疫苗可以设计为针对特定的免疫亚群，如树突细胞、巨噬细胞或B细胞，以促进更高质量的免疫反应。这可以通过使用靶向递送将抗原选择性递送至细胞或通过掺入促进所需免疫细胞募集的免疫刺激剂来实现。通过将APCs的募集引导至注射部位，而不是像嗜中性粒细胞那样的细胞(嗜中性粒细胞显著地导致炎症),可以选择性地增强疫苗效力。

实现广泛而持久的免疫反应

MMR、乙型肝炎、脊髓灰质炎和卡介苗等疫苗通过产生强大的记忆反应来有效对抗病原体的再次暴露，从而赋予长期免疫力。相比之下，由于免疫力下降，流感和新型冠状病毒疫苗需要每年加强免疫，因为保护性免疫力在大约8-10个月后开始下降。抗原漂移/转移和新变种的出现使得疫苗需要频繁更新，这也推动了对流感和新型冠状病毒等高度变异病原体的年度加强剂的需求。减少或消除对频繁加强剂的需要，可以大大提高公众的吸收和依从性，提高这些病原体的总体疫苗接种覆盖率²⁶⁴。在未来，这些新的疫苗策略也可能有助于创造不依赖毒株或“通用”疫苗。结构指导的抗原设计可用于产生人工构建体，该人工构建体引发针对多种病原体变体的广泛中和抗体。关于新型冠状病毒和流感的临床前工作已经证明了这种疫苗的可能性^74,79。如果成功，这将消除每年疫苗适应的需要，并可能减少必要的疫苗接种频率，潜在地减少季节性感染的整体医疗负担。尽管“反向疫苗学”方法旨在通过疫苗接种产生bnAbs来开发泛变异疫苗¹⁵T细胞疫苗为产生具有长期保护作用的通用疫苗提供了另一个令人兴奋的途径⁹⁴。这种疫苗将靶向保守表位以中和病毒感染。下一代疫苗的目标应该是在人群中提供广泛而持久的保护性免疫，减少频繁加强剂量的需要。

优化安全性、合规性和生产

确保疫苗安全需要严格的早期临床研究，包括各种人群，包括婴儿、老年人和患有各种基础疾病的个人。必须考虑年龄、健康状况和预先存在的免疫力等因素，以优化免疫反应并最大限度地减少不良事件，这可能导致剂量和疫苗接种策略的调整。应监测接受者在初次加强免疫接种后的短期和长期效果，重点是不良事件和免疫反应的质量。对于呼吸道疫苗，应特别注意潜在的肺部免疫病理学，以评估炎症风险。探索疫苗接种的替代途径，如鼻内和口服接种，提供了利用粘膜免疫的机会。这些途径不仅在公众依从性和易于接种方面提供了潜在的优势，而且它们也有希望在粘膜表面诱导强大的免疫反应，粘膜表面是对抗病原体的关键屏障。通过绕过注射(由于恐惧或不适，这对一些人来说可能是一种障碍)，鼻内和口服接种方法可以提高公众对疫苗接种计划的接受度和坚持度。然而，重要的是彻底调查这些接种途径的安全性和免疫原性，以应对任何相关的挑战，并确保它们在预防传染病方面的有效性。

疫苗的生产和分配也需要在开发过程中加以考虑。疫苗平台的类别、接种强度/调度和储存条件(表2和盒子3)在确定大规模生产和销售的可行性方面起着关键作用。因此，除了疫苗安全性和免疫原性之外，这些参数也是卫生管理委员会的重要考虑因素。开发在热带温度下具有更高热稳定性的疫苗平台对于确保全球疫苗的可用性至关重要。易于管理的工程材料，减少了冷链要求和一次性免疫接种，是确保全球疫苗供应的关键。

开发安全、保护性、快速适应、易于部署且成本效益高的疫苗需要跨学科团队的高效努力。例如，由于分子生物学、生物工程、化学等领域的进步，使用基于核酸或重组蛋白的平台，已经快速生成了使用结构生物学和生物信息学方法发现的独特病毒抗原。下一代疫苗平台将是复杂的系统，包含独特设计的抗原货物，通过递送载体以时空控制的方式递送，使用佐剂以仔细控制的方式刺激免疫系统。增强的抗原设计将引发免疫细胞识别必要的病毒表位，促进交叉反应和持久的记忆反应，这对于增强保护是必不可少的。随后，适当设计的佐剂将通过增强适应性免疫反应而不引起副作用，促进针对具有不同免疫特征和脆弱性的人群的精确疫苗的开发。用于时空控制递送的改进的递送系统能够节省剂量或增强免疫受损个体的疫苗效力。为了确保疫苗开发的有效性，必须考虑不同物种(如啮齿动物、灵长类动物和人类)之间受体表达和耐受性的巨大差异。评估这些物种的疫苗成分至关重要，因为它们在决定随后免疫反应的质量方面发挥着关键作用。面对新出现的病原体，能够快速生产大量疫苗的简化制造系统，加上疫苗热稳定性的提高，对于有效缓解全球健康威胁至关重要。这是一项艰巨的任务，但是新冠肺炎疫情已经证明这是可能的。