新方法学如何重塑病毒学研究

动物模型是基础与转化病毒学研究的基石，广泛用于研究病毒致病机制、评估疫苗与治疗药物。然而，日益凸显的伦理与科学层面的担忧，加之美国国立卫生研究院（NIH）与美国食品药品监督管理局（FDA）近期推出的相关举措，正加速研究向非动物、人源化替代模型转型。先进的细胞与组织培养体系已为模拟人类疾病提供了强有力的研究平台。本文概述了新兴研究工具，并强调其在监管与技术快速变革的背景下，对病毒学研究的重要价值。

关键词：新方法学（NAMs）；模型系统；转化病毒学；病毒 – 宿主相互作用

2025 年，美国两大最具影响力的研究机构在生物医学研究领域迎来转折点，正式将资助重点从依赖动物模型转向基于人类的研究方法。美国国立卫生研究院（NIH）终止了仅限动物研究的资助申请，并计划设立新的研究创新、验证与应用办公室（ORIVA），以加速人源化替代模型的研发与应用。与此同时，美国食品药品监督管理局（FDA）发布路线图，鼓励药物研发人员采用人源化技术与先进计算模型替代动物安全性评价研究，这类技术与模型统称为 “新方法学”（NAMs）。作为科研共同体，我们应尽可能采纳这些新兴技术，以减少对动物研究的依赖。同时也需认识到，完整生物体模型对于理解复杂生理过程、免疫应答与疾病动态变化仍不可或缺，这些过程目前尚无法通过计算机模拟或体外模型完全复现。本文将聚焦病毒学研究前沿的人源化研究方法，同时阐述动物模型在生物医学科学中持续发挥的关键作用。

尽管科研界数十年来恪守 “3R 原则”（替代、减少、优化），动物模型仍是临床前研究的核心。但从动物实验到人体有效治疗的转化失败率居高不下，引发了对传统模型预测价值的质疑，也凸显了研发新策略以提升转化成功率的必要性。在此背景下，科研界愈发重视开发无需依赖完整动物体系、可模拟人类生物学与疾病的新方法学（NAMs）。NAMs 并非单一技术，而是一套在生物医学领域具有广泛应用价值的标准化检测体系（图 1）。下文将详细介绍发展最为成熟的呼吸系统 NAMs，再拓展至其他可体现 NAMs 在病毒学研究中广泛应用价值的模型体系。

基于原代细胞与组织培养的 NAMs，是直接从生物体分离活细胞或组织片段，在接近生理状态的条件下进行培养。在呼吸道病毒研究中，气液界面（ALI）培养是应用最广泛的人源化模型体系。ALI 体系通过从供体组织分离人气道上皮干细胞，在 Transwell 培养皿中培养构建：基底侧接触富含营养的培养基，顶侧暴露于空气中，该条件可精准模拟人类呼吸道的结构与微环境。在此培养条件下，气道细胞分化为包含纤毛柱状细胞、无纤毛柱状细胞、杯状细胞与基底细胞的复层上皮，重现人类气道黏膜表面的形态与功能复杂性。人源原代 ALI 培养已广泛应用于多种 DNA 与 RNA 呼吸道病毒的生物学研究，为病毒机制研究与转化研究提供了关键依据。根据研究需求，可分离鼻腔、气管或支气管上皮细胞，在 ALI 条件下分化以模拟呼吸道不同区域。重要的是，ALI 培养保留了上皮极性，可实现病毒顶侧接种，高度模拟完整黏膜表面的自然感染过程。

尽管 ALI 培养可有效重现呼吸道上皮的核心特征，但其缺乏模拟肺微环境中病毒 – 宿主相互作用所必需的多细胞复杂结构与免疫组分。与此同时，供体来源的肺组织外植体与精密切割肺切片（PCLS）已被用于研究仅上皮细胞模型无法覆盖的病毒感染相关过程。尽管这类模型在标准化与实验操作上存在挑战，但自动化 PCLS 制备技术的进步，相较组织外植体培养提升了实验一致性。鉴于其互补性应用价值，PCLS 模型近年来的应用显著增加。

PCLS 通过液态琼脂糖充盈肺组织、冰上固化、按预设厚度切片制备。通过可重复选取切割组织区域、保持切片厚度一致、均匀打孔实现标准化，确保实验间的稳定性。病毒感染实验通过将切片与病毒接种液共孵育，洗涤后长期监测病毒复制。Pechous 等人近期的研究完美印证了 PCLS 模型的优势：该研究显示严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）在人肺组织中快速复制，并诱导出 2019 冠状病毒病（COVID-19）典型的促炎反应。值得注意的是，抗病毒治疗可缓解上述效应，凸显该平台在治疗药物筛选中的价值。总体而言，PCLS 具有高度通用性，可用于研究宿主对新型流感病毒株的易感性、溶瘤病毒疗法评估，以及识别影响感染结局的宿主因子。最后，低温保存技术的进步实现了 PCLS 的长期储存与按需使用。展望未来，构建覆盖多样供体与器官系统的新一代精密切割组织生物样本库，将推动研究脱离动物模型，加速基于人源化体系的转化病毒学研究。

原代细胞与组织培养虽具备关键的生理优势，但人类呼吸道组织的获取受供体来源限制。此外，即便获得组织，供体临床背景（如吸烟史、慢性阻塞性肺疾病 [COPD]、潜在感染）与捐赠期管理（如用药情况）的差异，会影响实验可重复性，尤其对大规模研究而言。这些限制推动了可再生细胞培养体系的发展，该体系可为实验提供稳定、可扩增的人源化功能细胞。

可再生 NAMs 技术的核心是诱导多能干细胞（iPSCs），其可无限扩增并定向分化为多种呼吸谱系细胞。该技术结合单株 iPSC 系近乎无限的扩增潜力，可稳定、可持续地获取先进肺组织 NAMs。此外，iPSC 体系具备基因可编辑性，可在分化前修饰宿主基因，实现对病毒感染与宿主易感性分子决定因素的靶向研究。

人源 iPSC 诱导的肺类器官是已被领域广泛应用的 NAMs 之一。2017 年，Chen 等人首次报道从 iPSC 构建肺芽类器官，该类器官经异种移植与三维（3D）培养后，可重现分支气道与肺泡结构特征。研究进一步证实，该类器官感染呼吸道合胞病毒（RSV，儿童呼吸道疾病主要病原体）后，可产生与婴儿肺部相似的病理特征。该团队后续研究将该体系拓展至副黏病毒科相关病毒，包括人副流感病毒 3 型（HPIV3）与麻疹病毒（MeV），证实该模型是研究发育中肺组织病毒致病机制的重要平台。此外，原代组织干细胞来源的类器官作为互补模型，可支持更多临床重要呼吸道病毒感染，如人鼻病毒 C（HRV-C）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）与 SARS-CoV-2。综上，这些发现证实 iPSC 与原代组织来源的肺类器官体系在呼吸道病毒生物学研究中的通用性。

与所有 3D 类器官体系相同，该技术仍存在实际应用限制。3D 类器官培养的核心局限是依赖包绕并支撑类器官结构的细胞外基质（ECM）组分。尽管 ECM 对类器官生长与分化必不可少，但其会形成物理屏障，限制病毒或药物进入内部细胞层，通常需显微注射或机械破碎以暴露顶侧完成接种。为解决部分局限，肺芯片模型在传统类器官基础上整合微流控技术与机械力，更真实地模拟肺生理功能。该平台持续发展，整合高度分化的呼吸道上皮与内皮细胞，可反映呼吸道病毒感染的关键细胞靶点，还可进一步植入组织驻留与循环免疫细胞。本团队与其他研究者证实，iPSC 可大规模生产巨噬细胞，并可进一步分化为组织驻留型肺泡巨噬细胞样表型。由于 iPSC 可从单一供体产生多种相关细胞类型（如巨噬细胞与肺类器官）且遗传背景一致，为模拟复杂病毒 – 宿主相互作用提供了有力条件，避免了原代供体组织的干扰。最终，这些进展预示着个性化器官芯片系统未来可指导个体化治疗选择，但当前平台仍无法完全反映个体生理差异，包括性别相关差异。

除推动呼吸道病毒研究外，NAMs 正改变多种人类器官系统病毒病的研究模式。例如，人源 iPSC 诱导的心肌细胞等可扩展平台，让此前难以获取的细胞类型可便捷用于研究。其在 SARS-CoV-2 感染模型中的应用，证实 NAMs 可捕捉人类特异性疾病机制并支持治疗药物测试。同样，中枢神经系统模型（包括脑类器官、精密切割组织切片、原代神经免疫培养）可实现对人兽共患脑炎虫媒病毒与长期持续性感染人类病毒的嗜神经性与神经毒力的可控评估，拓展了针对这类重要病原体的治疗药物测试机会。总体而言，胃肠道、皮肤、生殖、肝脏、肾脏与免疫 compartment 的生理相关体外与离体模型，可实现多组织病毒 – 宿主相互作用研究。随着这些平台的不断成熟，必将弥合临床前研究与成功药物研发之间长期存在的鸿沟。

计算方法已成为 NAMs 的核心支柱。在当下的多组学时代，海量基因组、转录组与蛋白质组数据集，结合可检索的蛋白质结构与药物化学文库，可在开展生物样本实验前快速完成计算机虚拟筛选与科学假设构建。此外，随着机器学习与人工智能的快速发展，这类计算机工具可广泛应用于多种病毒学问题，包括但不限于治疗药物研发、流行病学建模与计算类器官模型。

在新发病毒病领域，计算建模为快速筛选治疗与预防候选药物提供了路径。分子对接与分子动力学模拟可评估病毒蛋白与潜在抑制剂的结合亲和力与相互作用动力学，支持早期药物研发，无需传统实验流程的成本与动物使用。预测毒理学工具可在生物实验前完成潜在人体不良反应的预筛选。分子建模已用于预测 SARS-CoV-2 刺突蛋白 – ACE2 在不同物种间的结合以评估病毒储存库潜力，并通过识别疫苗设计相关的高风险突变预测免疫逃逸。除疫苗研发外，计算机模型还可通过疾病监测与传播的流行病学建模，为疫苗部署策略提供依据。多种传播模型在 COVID-19 大流行早期助力理解检测、隔离与社交隔离策略，并为公共卫生部门在疫苗供应有限时的人群优先接种提供指导。除群体水平应用外，计算机工具在感染机制研究中的相关性日益提升。计算类器官模型的最新进展可实现肠道、肺、胰腺等复杂组织的模拟。随着体外类器官 NAMs 的优化，将其研究结果（如信号通路动态、基因表达反馈、细胞因子释放谱等）整合至计算类器官模型，将提升模型对早期治疗药物筛选的支持能力。

与所有建模方法相同，计算 NAMs 的可靠性取决于支撑其的数据、假设与机制认知。此外，研究者的参数选择等主观决策（如 COVID-19 大流行早期的流行病学模型）可能影响模型性能并导致误导性解读。新机制的发现要求研究者基于新信息更新模型，如 Montes-Olivas 等人在肠道类器官模型研究中的实践。类器官生化诱导信号认知与检测算法的进步，推动了更精准、更具洞察力的系统模型构建。计算 NAMs 的理论基础仍需持续的实验验证。未来研究应聚焦整合基因组、结构与表型数据的复合模型，以更精准模拟复杂的病毒 – 宿主动态变化。

尽管人源化体外与计算 NAMs 快速发展，部分生物学问题仍需完整生物体环境。线虫（秀丽隐杆线虫）、斑马鱼（斑马鱼）等非哺乳动物脊椎动物提供了理想的折中方案，其具备稳定、伦理友好、可扩展的体内研究平台优势，可减少对传统哺乳动物模型的依赖。这类方法的重要性在 COVID-19 大流行期间尤为凸显：多种靶向 SARS-CoV-2 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）的核苷类似物抑制剂展现出治疗潜力，但因胎儿毒性风险无法用于孕妇。Shiraki 等人近期利用秀丽隐杆线虫体系筛选 RdRp 抑制剂的生殖毒性，结果与动物模型中观察到的不良反应高度一致。该成果印证了线虫模型具备与哺乳动物系统保守的细胞与发育通路。但由于秀丽隐杆线虫对人类病毒病原体无天然易感性，其在病毒学中的应用主要局限于毒性筛选与基因通路分析。

相比之下，斑马鱼可支持多种人类病原体感染，实现完整生物体环境下病毒 – 宿主相互作用的直接可视化观察。例如，斑马鱼已用于构建 1 型单纯疱疹病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、人诺如病毒等感染模型。此外，Gabor 等人的研究证实神经氨酸酶抑制剂扎那米韦在斑马鱼体内保留抗甲型流感病毒活性，凸显该模型在抗病毒药效与筛选研究中的潜力。尽管具备上述优势，斑马鱼并非适用于所有人类病毒病原体，最适复制温度、宿主范围、病毒受体保守性的差异可能限制其感染性。明确这些局限，可确保斑马鱼在能提供最大生物学价值的场景中应用，作为其他核心模型体系的补充而非替代。

尽管 NAMs 不断进步，动物模型对于研究当前体外与计算机模型无法完全复现的复杂生理过程仍不可或缺。关键的多细胞相互作用（如免疫细胞迁移、内分泌与代谢信号、血管应答、微生物组动态、器官间通讯）依赖完整生物体生物学，现有 NAMs 平台无法模拟。这些整合过程对宿主感染结局至关重要，尤其在慢性或进展性疾病中。例如，多数致癌病毒的感染本身不足以引发癌变，人乳头瘤病毒（HPV）是典型案例：几乎所有性活跃成年人都可能感染该病毒，但仅少数个体进展为癌症，该过程可长达数十年。因此，明确导致恶性进展的因素至关重要，多项研究提示微生物组可能发挥潜在作用。综上，动物模型对于解析病毒、宿主与微生物组之间的复杂相互作用具有不可替代的价值。例如，Spurgeon 等人利用新发现的小鼠乳头瘤病毒 MmuPV1，证实病毒感染可改变雌性生殖道微生物组并影响疾病进展。这类研究是理解疾病进展、构建临床前治疗药物研发稳健模型的关键第一步。

同样重要的是，动物模型可让研究者考量宿主水平的异质性，包括性别相关生理、营养状况、昼夜节律、体力活动与环境暴露，这些因素均可影响病毒致病机制与疾病结局。例如，Chuong 等人利用小鼠模型证实营养状况可调节登革病毒感染后的疾病严重程度。当前 NAMs 平台难以模拟宿主生物学的这些维度，而动物模型可实现对依赖整合性、动态宿主生理过程的科学问题的探究。体内对这些重要生物学因素的深入研究，有望揭示病毒病机制的关键见解，识别此前未被发现的致病决定因素。

动物模型尤其适用于研究长期病毒感染与评估治疗策略。例如，人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）、人类 T 细胞白血病病毒 1 型（HTLV-1）等逆转录病毒，以及水痘 – 带状疱疹病毒（VZV）等持续性疱疹病毒，可潜伏数十年无明显症状。根除持续性感染的核心挑战是靶向潜伏状态并增强免疫介导清除的策略。尽管体外细胞模型可探究部分过程，但潜伏感染细胞主要定位于特定组织与解剖区域，药物穿透性与免疫可及性存在差异。因此，靶向潜伏干预的疗效仅能通过动物模型完整评估。骨髓 – 肝 – 胸腺（BLT）人源化小鼠是有效评估 HIV-1 潜伏库清除策略的模型之一。

除病毒潜伏外，动物模型对于理解感染对宿主长期生理的影响及感染后远期后遗症至关重要。慢性感染相关疾病常伴随年龄相关的免疫、代谢、组织修复改变，影响疾病进展与治疗应答。例如，VZV 初次感染后在感觉神经元中建立终身潜伏，数十年后因年龄或其他慢性应激激活可引发带状疱疹，有时伴随神经或全身并发症。通过捕捉这些全身与时间依赖性效应，动物模型为研究感染自然史、抗病毒或免疫调节干预的长期安全性与疗效提供了核心平台。

最后，抗病毒药物与疫苗的安全性、有效性、药代动力学的诸多方面仅能在完整动物体系中完整评估。明确药物的吸收、代谢、清除方式，以及免疫记忆的形成与持续机制，是 NAMs 无法完全预测的挑战。例如，瑞德西韦在恒河猴 SARS-CoV-2 研究中明确了体内代谢与剂量限制性肺毒性。奥司他韦耐药的 2009 年甲型 H1N1 流感大流行病毒（“猪流感”）的传播性在雪貂中研究，雪貂的类人呼吸道生理可捕捉传播相关的选择压力。完整生物体模型还可揭示未预期的脱靶效应与组织特异性应答。腺病毒载体疫苗在小鼠与非人灵长类中出现罕见但临床相关的肝脏与血栓并发症，这些效应无法通过细胞培养或计算平台预测。此外，治疗效果通常依赖细胞因子信号、免疫细胞迁移、血管通透性、器官间通讯等动态过程。例如，HIV-1 人源化小鼠模型证实淋巴组织结构与微生物组依赖的免疫激活如何影响病毒库与持续性。因此，动物模型仍是验证抗病毒药物与疫苗实际应用效果、确保其在真实生理条件下安全性与有效性的金标准。

随着人源化技术的进步，动物模型的作用应是转型而非消失。生物医学研究的未来将依赖整合策略，将 NAMs 与靶向、合理使用的动物模型结合，以解答非动物体系无法解决的问题。

新兴研究框架聚焦三大相互关联的核心方向。第一，在 NAMs 具备明确优势的领域优先应用，包括临床前研发、高通量筛选、可控环境下的机制评估（表 1）。动物研究仅用于 NAMs 无法单独解答的科学问题。第二，减少动物使用的持续进展需强化 NAMs 自身发展。当前 NAMs 构建流程差异较大，影响可重复性与研究间可比性。通过提升 NAMs 构建的一致性、建立领域内 NAMs 验证标准，研究者可增强实验可重复性，推动新技术的广泛应用。第三，将 NAMs 纳入分层研究流程（从计算机建模开始，进阶至体外 / 离体体系，必要时针对复杂生理问题开展动物研究），为整合研究设计提供了实用路径。

在这种混合研究范式中，NAMs 与动物模型并非相互竞争的替代方案，而是统一实验策略中互补的组成部分。重要的是，实施这类整合框架需要不同实验室的协同努力，整合多元技术专长与合作研究设计。整体应用这些方法，将为推进病毒学研究提供稳健、伦理友好、转化相关的研究基础，实现 NAMs 与动物模型单独无法达成的科学突破。