急性感染和慢性感染导致人类记忆性 CD4 + T 细胞形成轨迹截然不同

介绍

持续性感染，例如人类免疫缺陷病毒 (HIV)、乙型肝炎病毒 (HBV) 和丙型肝炎病毒 (HCV) 感染，以及肿瘤，都构成重大的健康负担。T 细胞是这些疾病预后和发病机制的关键决定因素，也是极具潜力的治疗靶点，例如免疫检查点阻断疗法。与持续性感染和肿瘤相关的慢性抗原暴露和刺激会驱动 T 细胞分化和效应功能的重定向和适应。 ¹ T 细胞对慢性抗原暴露的适应性研究主要集中在 CD8 ⁺ T 细胞上，通常被称为 T 细胞耗竭。 ^2 3 耗竭的 CD8 ⁺ T (TEX) 细胞的特征是效应功能降低，例如 IFNγ 和 TNF 的产生减少；抑制性受体（例如 PD-1 和 LAG3）的表达保留；代谢改变；以及独特的转录程序和表观遗传图谱。 ^4 5 虽然 TEX 细胞功能受限有利于病毒持续感染和肿瘤进展，但这种对持续抗原暴露的功能性适应也限制了过度免疫病理反应，并确保了残余 T 细胞免疫的维持。 ^2 6 然而，TEX 细胞免疫的协调机制尚未完全阐明。

CD4⁰ T 细胞在协调 CD8¹ T 细胞反应中起着核心作用。实验模型，例如小鼠慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 感染模型，表明 CD4² T 细胞的耗竭会导致病毒血症失控和 TEX 细胞分化改变 ^{3,4。CD45 T 细胞的重建可增强 TEX 细胞的效应功能并降低病毒载量 6。同样，在人类中，CD47 T 细胞的丢失与 HIV 疾病进展相关，而病毒特异性 CD48 T 细胞频率的降低与慢性 HCV 感染相关 9。这些观察结果强调了 CD410 T 细胞在持续抗原暴露期间 TEX 细胞免疫中的关键作用，并支持增强 CD411 T 细胞作为一种有前景的慢性感染和肿瘤免疫治疗策略。虽然已知慢性抗原刺激会改变 CD4 + T 细胞反应的细胞因子谱 3 ，并诱导一种独特的分子特征，该特征与 CD8 + TEX 细胞的部分分子特征重叠， 11 ，但我们对 CD4 + T 细胞的相关分化和维持的理解仍然有限，尤其是在人类中。}

对慢性抗原暴露期间 T 细胞免疫的认识主要建立在 LCMV 感染的小鼠模型之上。然而，对人类慢性感染中 T 细胞反应的研究也表明，LCMV 模型低估了临床环境中观察到的特殊性和异质性。HCV 是研究人类 T 细胞免疫的宝贵模型，因为其结果具有二元性——自发清除或（大多数情况下）慢性感染。如果未诊断或未治疗，慢性 HCV 感染可能导致进行性肝病、肝硬化和肝细胞癌。慢性感染可以通过直接抗病毒药物（DAA）治愈，这些药物干扰病毒的复制机制，从而实现病毒学上的完全治愈。疾病进展或病毒清除受到 HCV 特异性 T 细胞反应的关键影响，众多研究（例如 T 细胞耗竭和 MHC 等位基因的影响）证实了这一点。 ^18 19 尽管 HCV 特异性 CD4 ⁺ T 细胞在协调急性和慢性 HCV 感染的抗病毒免疫中发挥着关键作用，但人们对它们的转录异质性、发育轨迹和记忆形成知之甚少。

本文旨在解决 HCV 特异性 CD4⁰ T 细胞生物学研究中的关键挑战，例如其在慢性感染中的低频率以及 MHC II 类分子的多样性 ¹⁰

^{2020.Zoldan, K. ∙ Ehrlich, S. ∙ Killmer, S. …Th1-Biased Hepatitis C Virus-Specific Follicular T Helper-Like Cells Effectively Support B Cells After Antiviral TherapyFront. Immunol. 2021; 12, 742061Google Scholar} 。据我们所知，本文首次整合了人类病毒特异性 CD43 T 细胞的表型和功能分析的单细胞 RNA 测序数据集。我们利用肽负载的 MHC II 类四聚体，直接从急性、慢性、DAA 治愈和自发清除 HCV 感染患者的体内分离鉴定出这些细胞，从而能够确定其异质性，并绘制其在急性及慢性抗原暴露下的分化轨迹和记忆形成过程。这些发现对于理解 CD44 T 细胞在急性及慢性抗原刺激下的免疫反应具有广泛的意义，其应用范围不仅限于 HCV 治疗，还包括疫苗接种和癌症治疗等领域。

结果

感染结果影响 HCV 特异性 CD4⁰ T 细胞反应

为了研究急性感染和自发清除感染与慢性感染和治疗治愈的病毒感染中病毒特异性 CD4⁰ T 细胞亚群的多样性（ 图 1A ； 表 S1 ），我们采用肽负载的 MHC II 类分子（pMHCII）四聚体技术，在体外分析了未经刺激的 HCV 特异性 CD4¹ T 细胞（ 数据 S1 ）。我们纳入了靶向 DRB1⁵15:01 呈递的 NS3³ 和 NS3⁴ 表位以及 DRB1⁷01:01 呈递的 NS4B⁶ 表位的 CD4² T 细胞（ 表 S2 ）。 MHC II 类等位基因 DRB1 ^∗ 01:01 和 DRB1 ^∗ 15:01 在全球范围内普遍表达，在我们生物样本库中纳入的 HCV 感染献血者中，分别有 14.4%和 9.7%的人检测到这些等位基因（ n 分别为 201 和 135，总共 1395 人； 图 S1 A）。HCV 特异性 CD4 ⁺ T 细胞在急性感染和自发清除感染中很容易检测到（90%），但在慢性感染中则较少检测到，在基于 pMHCII 四聚体的富集后，慢性感染患者的检测率仅为 48%（ 图 1 B）。与慢性感染、治愈感染和自发清除感染相比，急性感染中可检测到的病毒特异性 CD4 ⁺ T 细胞群的频率显著增加（ 图 1 C）。表型分析显示，大多数 HCV 特异性 CD4^+ + T 细胞表达 CXCR3，表明其具有 Th1 分化特征。部分 HCV 特异性 CD4⁺ + T 细胞也表达 CXCR5，CXCR5 是 Tfh 细胞的常用标志物。根据目前的命名法，共表达 CXCR3 和 CXCR5 的 2121.Eisenbarth, S.C. ∙ Baumjohann, D. ∙ Craft, J. …CD4(+) T cells that help B cells – a proposal for uniform nomenclatureTrends Immunol. 2021; 42:658-669Google Scholar 循环细胞被标记为 cTfh1 样细胞，而 CXCR3+/CXCR5− 细胞则被命名为 Th1 样细胞（ 图 1D ）。 病毒特异性 CD4 + T 细胞中 cTfh1 样细胞的比例在治愈后并未显著增加，但在自发清除后与病毒血症期相比显著升高（ 图 1D ，中位数：急性期 19.5%，慢性期 22.1%，随访期 34.6%，清除期 73%， 图 S1B ）。接下来，为了更全面地评估慢性感染与清除期病毒特异性 CD4 + T 细胞的辅助性 T 细胞极化特征，我们进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析（ 数据 S2 ； 表 S3 ）。我们分析了慢性 HCV 感染后治愈的患者（ n = 5）的非初始 HCV 特异性 CD4 + T 细胞，并与急性 HCV 感染患者（ n = 3；均为急性自愈）和自发清除 HCV 的患者（ n = 4）进行了比较。对辅助性 T 细胞极化特征进行比较基因集富集分析（GSEA）发现，尽管不同感染时间点获得的 HCV 特异性 CD4 + T 细胞在基于 CXCR3/CXCR5 蛋白表达的表型上基本相似，但它们的辅助性 T 细胞极化存在差异（ 图 1E 、 S1C 和 S1D； 表 S4 ）。更具体地说，病毒特异性 CD4 + T 细胞在急性及慢性 HCV 感染中表现出以促炎性 Th1 和 Th17 特征为主，而真正的记忆性 HCV 特异性 CD4 + T 细胞在自发清除后则表现出平衡的辅助性 T 细胞极化，这可能反映了它们能够分化为性质不同的辅助性 T 细胞亚群。 相比之下，慢性 HCV 感染和治愈的 HCV 感染中的病毒特异性 CD4 + T 细胞偏向于 Tfh 特征，其中 HCV 治愈后的细胞没有表现出伴随的 Th1 或 Th17 特征。 这一观察结果表明，在慢性丙型肝炎治愈期间和治愈后检测到的 cTfh1 样病毒特异性 CD4 + T 细胞，以及自发清除后的情况，经典的 Tfh/Th1 极化并不能充分代表这些情况。

活化和静息的 CD4 ⁺ T 细胞状态根据 HCV 感染阶段而分离

为了更客观地确定急性期和自发清除期感染与慢性期和治疗治愈期感染中病毒特异性 CD4⁰ T 细胞的异质性，我们分析了从 510 个（急性期）、344 个（慢性期）、370 个（治愈期）和 530 个（清除期）HCV 特异性 CD4¹ T 细胞中获得的单细胞转录组。Leiden 聚类分析揭示了 5 个不同的簇（ 图 2A 、 S2A 和 S2B）。比较这 5 个簇，差异表达基因 (DEG) 包括 TOX、PRDM1、MKI67、CD38、MYC、TBX21、ZEB2、LAG3、CD52、PTGER2 和 CCR7 ，涵盖了表观遗传重塑、激活、效应细胞调控和迁移特征（ 图 2B 、 S2C 和 S2D）。更准确地说，观察到了具有聚类特征的基因表达，例如， PTPN13 和 CTLA4 （聚类 1）； NR4A3、CREM 和 IGF2R （聚类 2）； TBX21 、 ZEB2 、 PRDM1、STAT1 和 PDCD1 （聚类 3）； SELL、CCR7、IL7R、LEF1 和 TCF7 （聚类 4）；以及 CXCL13、NKG7、LAG3、CD52 和 GNG4 （聚类 5）。根据各种免疫相关通路的富集分析（ 图 2C ）和人 T 细胞活化图谱，聚类 1、2 和 4 处于更接近静息状态，而聚类 3 和 5 则代表活化/效应细胞簇（ 图 2D ）。单细胞数据显示，Th1、Th2 和 Th17 特征重叠，集中于簇 3 和簇 5，反映的是标记基因重叠有限的激活状态，而非真正的谱系状态（ 图 S2 E–S2G）。Tfh 特征富集于簇 1、簇 2 和簇 4，与静息/维持状态的特征重叠（ 图 2 C 和 S2 E）。 这一观察结果进一步支持了经典极化模型并不能完全重现慢性病毒感染中 CD4³ T 细胞分化的观点。通过绘制感染时间点和结果图，我们发现，从病毒血症患者（急性期和慢性期）获得的 HCV 特异性 CD4⁴ T 细胞比从病毒清除期（治愈期和清除期）获得的细胞表现出更强的激活特征（ 图 2E ）。相应地，HCV 特异性 CD4⁵ T 细胞的异质性呈现出不同的模式，不同的细胞簇在特定的感染时间点占主导地位（ 图 2F ）。事实上，从病毒血症期（急性期和慢性期）获得的 HCV 特异性 CD4⁶ T 细胞主要属于 Leiden 簇 3 和 5，而从病毒清除期（治愈期或清除期）患者获得的细胞则主要位于簇 1、2 和 4 中（ 图 2G ）。更确切地说，来自慢性感染患者的病毒特异性 CD4⁷ T 细胞在第 5 簇中占主导地位，而第 3 簇主要代表来自急性感染患者的 HCV 特异性 CD4⁸ T 细胞，这些细胞中转录因子 ZEB2、TBX21、PRDM1 和 STAT1 的表达增加，表明其被强制分化为效应细胞。相比之下，第 1 簇主要由来自治疗治愈患者的 HCV 特异性 CD4⁹ T 细胞组成，仅有少量细胞来源于其他感染阶段。第 2 簇和第 4 簇则主要由自发清除感染的细胞组成。 通过对串联流式细胞术表达数据进行无监督的 FlowSOM/ConsensusClusterPlus 分析，在蛋白质水平上重现了这些发现，并识别出五个簇：簇 1 和簇 2 主要由来自治愈或清除感染的细胞组成，这些细胞具有更静息的 Bcl-2+表型；而簇 3-5 包含表达 CD38、ICOS 和/或 T-bet 的活化细胞，这些细胞在病毒血症状态下富集（ 图 2H 和 S2H ）。因此，HCV 特异性 CD4¹⁰ T 细胞的异质性在慢性感染和治愈感染与急性感染和自发清除感染中存在显著差异，前者包含静息细胞和活化细胞。

在慢性丙型肝炎病毒感染中，干细胞样和效应 CD4 ⁺ T 细胞轴得以维持。

为了更详细地研究慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染中病毒特异性 CD4⁰ T 细胞亚群的特征，我们使用 Leiden 算法对来自 5 名慢性感染患者的 344 个单细胞转录组进行了亚聚类分析（ 图 3A 和 S3A ）。我们鉴定了两个簇，这两个簇在与激活、效应调控、增殖能力和迁移特征相关的基因表达上存在差异，例如 HLA-DRA、CD74、CD52、TCF7、SELL 和 CCR7 （ 图 3B 和 S3B ）。两个簇的转录因子活性也存在差异，簇 1 中 TCF7 和 NKFB1 等转录因子活性更高，提示存在干细胞样/存活程序（ 图 3C ）。簇 2 的特征是 STAT1 和 PRMD1 活性更高，表明这些 HCV 特异性 CD4² T 细胞已被激活并分化为效应细胞。因此，GSEA 分析显示，簇 2 富集了与激活和效应细胞分化相关的基因；由此可见，簇 2 似乎代表了慢性病毒感染中的效应 CD4³ T 细胞。相比之下，簇 1 则表现出静息细胞的特征，并富集了干性和静止状态的标志物（ 图 3D ）。从慢性感染患者中获得的 HCV 特异性 CD4⁴ T 细胞亚群的干细胞样与效应细胞样分化在蛋白水平上得到了证实（包括 TOX、T-bet、Bcl-2、PD-1、LAG3、ICOS 和 CD38 等标志物）。 事实上，FlowSOM-cluster 2 的特征是表达 T-bet、Ki-67、CD38 和 ICOS，代表效应细胞；而 FlowSOM-cluster 1 则以 Bcl-2 表达为主，反映出细胞具有更多干细胞样特征（ 图 3E 和 S3C ）。此外，在蛋白水平上对 T-bet 和 Bcl-2 进行共表达分析，可以区分干细胞样细胞亚群和效应细胞亚群，这与上述无监督聚类分析所识别的簇 1 和簇 2 的结果基本一致（ 图 3F ）。值得注意的是，Bcl-2 与 Ki-67、CD38 或 ICOS 的共表达分析也揭示了类似的干细胞样细胞亚群与效应细胞亚群（ 图 S3D ）。基于 Bcl-2/T-bet 共表达的干细胞样和效应 CD4 ⁺ T 细胞亚群分析表明，这两个细胞群均表达 TOX 和 PD-1，但效应细胞的表达水平高于干细胞样亚群（ 图 S3 E 和 S3F）。相反，干细胞样细胞上 ICOS 等激活标志物的表达降低（ 图 S3 E 和 S3F）。为了推断慢性感染中已鉴定的干细胞样和效应亚群的谱系关系，我们使用 Monocle3 结合轨迹图学习和相应的 scRNA-seq 数据的伪时间测量。轨迹分析表明，在 HCV 特异性 CD4 ⁺ T 细胞中，干细胞样和效应亚群之间存在祖细胞-子细胞关系（ 图 3 G）。干细胞样细胞和效应细胞的祖细胞-子细胞关系通过个体患者的干细胞样细胞和效应细胞中共享的 TCR 克隆得到进一步证实（ 图 3 H 和 S3 G）。 此外，对具有共同 TCR 克隆的 HCV 特异性 CD4⁷ T 细胞进行转录组分析，揭示了干细胞样细胞和效应细胞之间基因表达模式的差异，这与合并数据集中观察到的结果一致（ 图 3 I）。香农指数分析显示效应细胞和干细胞样细胞之间具有相似的 TCR 多样性（ 图 S3 H）。为了分析慢性 HCV 感染与急性感染中 HCV 特异性 CD4⁸ T 细胞亚群的分化情况，我们使用 Leiden 算法对来自急性感染和慢性感染患者的 HCV 特异性 CD4⁹ T 细胞转录组进行了亚聚类分析。该分析揭示了 3 个聚类，其中聚类 1 和聚类 2 代表具有效应细胞样基因表达的细胞（ 图 3 J–3L 和 S3 I）。聚类 1 主要由来自急性感染的 HCV 特异性 CD4¹⁰ T 细胞构成，而聚类 2 则由来自急性感染和慢性感染的细胞组成。这一观察结果突显了急性与慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染中 CD411 效应 T 细胞反应的差异。第 3 簇细胞表现出干细胞样特征，由来自急性期和慢性期感染的 HCV 特异性 CD412T 细胞组成，提示在急性期可能预先形成了重叠的干细胞样细胞。在比较急性期和慢性期感染的 HCV 特异性 CD413T 细胞时，在蛋白水平上也获得了类似的结果（ 图 S4 A–S4E）。 综合这些数据表明，在慢性丙型肝炎病毒感染期间，病毒特异性 CD4 + T 细胞由干细胞样细胞组成，可产生与急性感染不同的效应亚群。

干细胞样 CD4 ⁺ T 细胞在慢性感染治愈后形成长效记忆。

为了确定慢性抗原暴露后 CD4⁰ T 细胞的寿命和记忆潜能，我们对慢性感染期间以及随后接受 DAA 治疗治愈后 HCV 特异性 CD4¹ T 细胞群进行了纵向追踪（ n = 8， 图 4A 和 4B）。DAA 治疗后病毒血症迅速下降。根据临床实践，持续病毒学应答（即慢性 HCV 感染的治愈）定义为治疗结束后 3 个月 HCV-RNA 检测不到（ 图 S5A ）。在 HCV 治愈后 3 至 8 年（中位数为 5 年， 图 4A 和 4B）的分析时间段内，均可检测到 HCV 特异性 CD4³ T 细胞。因此，从慢性感染后治愈的患者中获得的病毒特异性 CD4⁴ T 细胞具有长寿命，扩展了先前报道的 HCV 治愈后不久 HCV 特异性 CD4^{5 T 细胞应答的评估。 2525.Smits, M. ∙ Zoldan, K. ∙ Ishaque, N. …Follicular T helper cells shape the HCV-specific CD4+ T cell repertoire after virus eliminationJ. Clin. Investig. 2020; 130:998-1009Google Scholar 此外，抑制病毒复制和去除病毒抗原导致 HCV 特异性 CD4 + T 细胞群内亚群分布发生显著变化（ 图 4C ）。特别是，Bcl-2/T-bet 共表达分析表明，治愈后效应细胞几乎完全减少（ 图 4C 和 4D）。尽管干细胞样亚群的频率发生变化，但其表型随时间推移保持稳定，这由其 TOX、PD-1 和 CCR7 的标志物表达模式所支持（ 图 4E 和 S5B ）。 同样，基于 UMAP 的降维方法对慢性感染和治愈患者的 HCV 特异性 CD4 + T 细胞的 scRNA-seq 数据进行分析，结果显示治愈后 HCV 特异性 CD4 + T 细胞占优势，且与慢性感染期间鉴定的干细胞样亚群重叠，提示干细胞样病毒特异性 CD4 + T 细胞得以维持（ 图 4F 和 S5C ）。此外，慢性感染期间和治愈后干细胞样 HCV 特异性 CD4 + T 细胞的这种重叠也体现在差异表达基因（DEGs）数量较少，仅有 8 个；而通过比较慢性感染的效应细胞和治愈后的 HCV 特异性 CD4 + T 细胞群，则检测到 103 个 DEGs（ 图 4G ）。此外，我们在慢性 HCV 感染期间和随后的治愈后均检测到干细胞样细胞，这些细胞在个体患者中具有相同的 TCR 克隆型，从而反映了单个 HCV 特异性 CD4 + T 细胞克隆的维持（ 图 4H ）。对具有共享克隆的 HCV 特异性 CD4 + T 细胞进行转录组分析，证实了保守的基因表达模式和保守的 TCR 多样性（ 图 4 I–4J）。 因此，在慢性感染期间出现的干细胞样病毒特异性 CD4 + T 细胞很可能在治愈后得以维持，而效应细胞在慢性抗原刺激停止后逐渐减少，从而导致长寿命的记忆样病毒特异性 CD4 + T 细胞池。}

干细胞样 HCV 特异性 CD4⁰ T 细胞可激活再次感染。

接下来，我们评估了记忆样 HCV 特异性 CD4⁰ T 细胞的功能，发现 HCV 治愈后，这些细胞能产生大量 PMA/离子霉素诱导的细胞因子（IFN-γ、TNF、IL-2 和 IL-21），与慢性感染时的细胞因子谱相似（ 图 5A 和 5B）。记忆性 T 细胞的另一个功能特征是能够启动再次免疫应答。为了评估再次免疫应答能力，我们利用这一独特的机会，在首次抗病毒治疗 8 周后病毒复发时，对一种特定的 HCV 特异性 CD4¹ T 细胞群进行了纵向追踪（ 图 5C ）。在慢性感染期间，HCV 特异性 CD4² T 细胞表现出活化（CD38）和增殖（Ki67）的标志物。首次治疗后，病毒血症检测不到，表达 CD38 和 Ki67 的 HCV 特异性 CD4³ T 细胞消失，而干细胞样细胞则得以维持（ 图 5D 和 5E）。随后的病毒复发和抗原暴露增加导致 HCV 特异性 CD4⁴ T 细胞重新激活（即 CD38 表达），其增殖能力通过 Ki-67 表达反映，并分化为 T-bet⁺ 效应 T 细胞（ 图 5C -5E 和 S5D ）。在第二轮抗病毒治疗后，病毒学应答持续，我们观察到 CD38 和 Ki-67 表达消失，以及具有干细胞样表型的稳定且长寿的 HCV 特异性 CD4⁵ T 细胞库。HCV 特异性 CD4⁶ T 细胞应答的这些动态变化表明，干细胞样亚群在慢性 HCV 感染和治愈的 HCV 感染中维持病毒特异性 CD47 T 细胞库，并能够启动记忆激活，从而产生效应亚群，支持其功能记忆潜能。

慢性感染治愈后形成的 CD4 ⁺ T 细胞记忆与传统记忆不同

随后，我们比较了治愈慢性感染后与自发清除后病毒特异性 CD4⁰ T 细胞记忆。差异基因表达和多维尺度分析（MDS）显示，HCV 治愈后病毒特异性 CD4¹ T 细胞与慢性感染期间获得的病毒特异性 CD4² T 细胞高度相似，但与急性感染期间和自发清除后获得的细胞存在明显差异（ 图 6A 和 S6A ）。接下来，我们分析了不同感染时间点 HCV 特异性 CD4³ T 细胞在细胞因子产生能力方面是否存在功能差异。与慢性感染相比，急性感染期间 HCV 特异性 CD4⁵ T 细胞中具有分泌三种细胞因子（IFNγ、IL-2、IL-4、IL-17、IL-21 和 TNF）能力的多功能 HCV 特异性 CD4⁴ T 细胞显著增加。这一观察结果不仅限于病毒血症期，在自发清除后也观察到了类似的模式，与 HCV 治愈后的情况类似（ 图 6B -6C）。HCV 治愈后 HCV 特异性 CD4⁶ T 细胞胞内细胞因子产生受损，这与这些细胞富集 LAG3 介导的损伤特征相符（ 图 6D ）。此外，与自发清除感染的 HCV 特异性 CD4⁸ T 细胞相比，HCV 治愈后 HCV 特异性 CD4⁷ T 细胞中与 T 细胞耗竭、无伴侣 NFAT 通路使用和 Tfh 分化相关的基因表达特征也增加。相反，与干性和缺乏抑制信号相关的基因表达降低（ 图 S6B ）。 因此，在蛋白水平上，与常规记忆细胞相比，HCV 治愈后 HCV 特异性 CD4⁹ T 细胞中 PD-1 表达增加，而 CD45RA、CD127、CCR7、CD38 和 ICOS 表达降低（ 图 6E 和 S6C ）。值得注意的是，治愈后和自发清除后的 HCV 特异性 CD4¹⁰ T 细胞均位于干细胞样区域，且 TOX 表达水平相似且较高（ 图 6E 和 S6D ）。然而，通过 scMINER 进行基因表达和基因调控网络推断发现，治愈后和自发清除后的 HCV 特异性 CD4¹¹ T 细胞中 TOX 和 TOX2 的活性存在差异（ 图 6F -6G）。更确切地说，TOX 相关的调控模块在两种情况下存在差异，例如，在治愈感染中， TCF7、ETS1 和 NFKBIA 相互关联，而在病毒清除后， FOXN2 、 FOXP1 和 STAT4 相互关联，这突显了慢性治愈感染与急性清除感染中记忆样病毒特异性 CD4 + T 细胞转录重编程的差异（ 图 6H ）。此外，scMINER 分析显示， RUNX3、STAT4、BATF、ZEB1 和 ID3 以及 FOXO3、LEF1 和 MYC 的差异活性表征了治愈感染与自发清除感染中 HCV 特异性 CD4 + T 细胞的不同程序（ 图 6G 和 S6E ）。因此，慢性感染治愈后形成的病毒特异性 CD4 + T 细胞记忆与自发清除后形成的常规记忆不同，并保留了慢性感染的分子和功能特征。

讨论

与先前在人类、猕猴和小鼠病毒感染中的研究结果一致， ^{20 26 27 28} 我们观察到在急性及慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染中均出现了具有循环 Tfh1（cTfh1）表型的病毒特异性 CD4⁴ T 细胞。这些 cTfh1 细胞表现出 Tfh 和 Th1 谱系的重叠特征，包括 CXCR5、PD-1 和 CXCR3 的表达。在非病毒血症感染阶段，无论病毒清除是自发发生还是在直接抗病毒治疗后发生，cTfh1 表型均占 CD4⁵ T 细胞的主导地位。然而，转录组分析显示，cTfh1 表型细胞的基因表达特征会根据感染进程而有所不同。事实上，与自发病毒清除后平衡的 CD4⁶ 辅助性 T 细胞极化谱相比，慢性感染中出现的 cTfh1 表型细胞具有更显著的 Tfh 样基因特征。这一观察结果表明，在急性清除感染中，CXCR5 表达与 Tfh 细胞分化存在解耦现象，这与可塑性相关；而在慢性治愈感染中，分化动力学则发生改变。然而，这种分化偏好是否与慢性炎症环境下的可塑性受限有关，仍有待阐明。在慢性治愈的 HCV 感染背景下观察到的 HCV 特异性 CD4⁷ T 细胞的 Tfh 偏好，可能反映了 T 细胞免疫的协调程序受到持续抗原暴露的挑战，因为 Tfh 细胞在 B 细胞辅助和维持病毒特异性 CD8⁸ T 细胞方面也起着关键作用，即使在慢性感染中也是如此。 ^29 30 我们的研究结果共同支持了这样一种观点，即基于互斥的 Th1、Th2、Th17 和 Tfh 谱系的经典 CD4 ⁺ T 细胞极化范式不足以描述慢性病毒感染期间观察到的复杂转录和功能状态，这凸显了在慢性疾病中重新定义 CD4 ⁺ T 细胞命运模型的必要性。 ³¹

本研究表明，慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染中观察到的 CD4⁰ T 细胞反应并非由单一分化的细胞群组成，而是由干细胞样亚群和效应亚群构成，分别以 Bcl-2 和 T-bet/ICOS 的表达为特征。效应亚群的功能和转录谱与急性诱导的 HCV 特异性 CD4¹ 效应 T 细胞不同。慢性效应 CD4² T 细胞的特征是细胞因子产生减少，同时效应功能负调控因子（如 GNG4 和 CD52）的表达增加， 表明其功能受到抑制 ^{3,4。这与先前在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠模型中的研究结果一致，该模型中病毒特异性 CD45 T 细胞表现出类似耗竭的特征 6。在抗原刺激下，HCV 特异性 CD47 T 细胞中存在一个离散的干细胞样细胞群，该细胞群维持着慢性效应细胞库。这些干细胞样 CD4+ + T 细胞在急性感染早期出现，与疾病结局无关，并表达 CCR7 和 SELL ，提示其具有先发制人般的形成 34 和淋巴组织监视能力。 35 值得注意的是，即使在治疗治愈后，它们仍然存在，并伴随抗原撤离，这凸显了它们的持久性并支持了其干性潜能。对 HCV 特异性干细胞样 CD4+ + T 细胞的转录组分析显示，其基因表达谱与先前在慢性 LCMV 感染 36 和肿瘤小鼠模型中描述的祖细胞/干细胞样 CD4+ + T 细胞一致。 37}

^{此外，从慢性感染中获得的病毒特异性干细胞样 CD4 + T 细胞也与小鼠和人类慢性感染及癌症中的祖细胞耗竭的 CD8 + T 细胞具有共同的关键特征（例如，TOX、PD-1 和 CXCR5 的表达）。 34}

^{3838.Lan, X. ∙ Mi, T. ∙ Alli, S. …Antitumor progenitor exhausted CD8+ T cells are sustained by TCR engagementNat. Immunol. 2024; 25:1046-1058Google Scholar 3939.Zehn, D. ∙ Thimme, R. ∙ Lugli, E. …‘Stem-like’ precursors are the fount to sustain persistent CD8+ T cell responsesNat. Immunol. 2022; 23:836-847Google Scholar 4040.Cai, C. ∙ Samir, J. ∙ Pirozyan, M.R. …Identification of human progenitors of exhausted CD8+ T cells associated with elevated IFN-γ response in early phase of viral infectionNat. Commun. 2022; 13, 7543Google Scholar 综上所述，这些观察结果突显了 T 细胞谱系、物种和疾病背景下保守的分化轨迹和概念命运框架。}

此外，我们的数据表明，干细胞样 CD4⁰ T 细胞在慢性 HCV 感染治愈后仍然存在，形成持久稳定的记忆细胞库，从而成为 HCV 特异性 CD4¹ T 细胞应答长期维持的关键命运决定点。HCV 治愈后的这种记忆样 CD4² T 细胞库表现出适应性免疫记忆的典型特征，包括长期持续存在和再次激活的能力。^{3 慢性 HCV 感染经治疗治愈后，HCV 特异性 CD44 T 细胞的细胞因子产生量低于自发清除病毒后的常规记忆 CD45 T 细胞。这表明，在慢性感染期间建立的病毒特异性 CD46 T 细胞的功能适应性即使在抗原撤离后也能维持。相应地，HCV 治愈后，HCV 特异性 CD47 T 细胞中也印记了慢性感染的转录谱，类似于在耗竭的病毒特异性 CD88 T 细胞中观察到的慢性瘢痕。 42 43 44 45 治愈后 HCV 特异性 CD4 + T 细胞的慢性瘢痕形成，与 CD8 + T 细胞类似，也体现在无伴侣 NFAT 特征、LAG3 相关损伤特征以及其他 T 细胞耗竭转录标志的富集表达上。 46 47 48 值得注意的是，CD4 + T 细胞的瘢痕转录程序在慢性期和治愈后均得以保留，其倾向于静止和维持状态，包括 BCL2 和 IL7R 的高表达，而非效应分化。 因此，这种功能适应可能确保在慢性抗原暴露的情况下病毒特异性 CD4 + T 细胞的持续存在和记忆形成，但与急性暴露相比，其分化轨迹截然不同。感染自行清除。}

维持耗竭 T 细胞状态的重要调控因子是转录调控因子 TOX。 ^49 50 51 与 CD8 ⁺ T 细胞中已充分表征的 TOX 引导的耗竭轨迹类似，我们观察到 CD4 ⁺ T 细胞的慢性抗原暴露可诱导 TOX 和 PD-1 的持续表达，且这些特征在治愈后仍然存在。然而，与 CD8 ⁺ T 细胞不同， ^49 50 51 在自发清除病毒后，病毒特异性 CD4 ⁺ T 细胞中 TOX 也高表达，这表明在 CD4 ⁺ T 细胞中，TOX 可能标志着更广泛的维持程序。尽管 TOX 的表达水平同样很高，但其转录活性却有所不同，涉及的基因也不同，例如，在 HCV 治愈和自发清除中，分别涉及 TCF7 、 NFKBIA 和 IFITM1 以及 FOXP1 、 IL2RG 和 STAT4 。这一观察结果表明，TOX 调控着多种 T 细胞维持程序，因此可能代表着建立依赖于抗原暴露动态的 CD4 ⁺ T 细胞记忆的关键枢纽。与 TOX 作用后自发清除的 HCV 特异性 CD4 ⁺ T 细胞相比，治愈后 HCV 特异性 CD4 ^{+ T 细胞中也检测到了不同的转录网络，这表明 T 细胞会根据不同的刺激环境进行适应性调整。这种转录因子网络的重塑已被报道为 T 细胞灵活应对各种炎症和环境信号的标志性特征 52}

^{5353.Doering, T.A. ∙ Crawford, A. ∙ Angelosanto, J.M. …Network analysis reveals centrally connected genes and pathways involved in CD8+ T cell exhaustion versus memoryImmunity. 2012; 37:1130-1144Google Scholar ，并且正如本研究所示，它也成为塑造不同感染过程中 CD4 + T 细胞命运的关键机制。}

总之，我们的研究结果阐明了人类病毒感染不同阶段中抗原特异性 CD4⁰ T 细胞的命运，将干细胞样亚群鉴定为潜在的免疫治疗靶点，并强调了制定针对性策略以重新定向或增强 CD4¹ T 细胞反应的必要性。因此，这些发现对癌症免疫治疗和疫苗接种策略也具有更广泛的意义。

资源可用性

致谢

作者贡献

利益声明

写作过程中生成式人工智能和人工智能辅助技术的声明

STAR★方法

补充信息（3）

参考

急性感染和慢性感染导致人类记忆性 CD4+ T 细胞形成轨迹截然不同：免疫学 — Acute and chronic infections drive distinct trajectories in human memory CD4+ T cell formation: Immunity