mRNA 疫苗通过非常规途径启动 CD8+T 细胞免疫

mRNA vaccines engage unconventional pathwaysinCD8+ Tcell priming

摘要

由 mRNA 与脂质纳米颗粒（LNP）组成的疫苗，通过在体内诱导特异性蛋白抗原的合成，激活 B 细胞与 T 细胞。B 细胞可被抗原直接激活，而 T 细胞的活化则需要专职抗原呈递细胞（APC）上的主要组织相容性复合体（MHC）分子对抗原进行加工与呈递。在应对病毒感染、肿瘤以及基于蛋白和 cDNA 的疫苗时，向 CD8+T 细胞呈递抗原尤其依赖 1 型常规树突状细胞（cDC1）—— 这类细胞擅长高效交叉呈递外源性抗原。但 mRNA–LNP 疫苗是否遵循相同机制，目前尚不明确。

本文研究发现：mRNA–LNP 疫苗启动 CD8+T 细胞免疫不依赖 cDC1 细胞，也不依赖 WDFY4 介导的交叉呈递通路，而是cDC1 与 cDC2 细胞可冗余代偿完成启动。仅由 cDC1 或仅由 cDC2 细胞启动的 CD8+T 细胞虽存在表型差异，但二者均能介导抗肿瘤应答与记忆形成。尤为关键的是，常规树突状细胞（cDC）可从非造血细胞获取肽–MHC‑I 复合物（这一过程称为交叉着装），并以I 型干扰素依赖的方式，成为 CD8+T 细胞启动的重要组成部分。mRNA–LNP 诱导的交叉着装，或许能解释其为何能激活针对疫苗未编码抗原的 CD8+T 细胞。

1 引言

脂质纳米颗粒递送的 mRNA 疫苗，在新冠疫情期间被广泛应用。mRNA 可直接进入细胞并翻译为蛋白，这一特性最早在体外通过脂质体得到证实；后续研究又证明 mRNA 可在体内递送并具备疫苗潜力。编码流感血凝素（HA）的 mRNA 疫苗可在小鼠中诱导保护性抗体应答，也能在小鼠与非人灵长类中激活 CD4 + 与 CD8+T 细胞；新冠 mRNA 疫苗同样在人体中诱导出具有保护作用的 CD8+T 细胞应答。

凭借新冠疫苗的成功，mRNA 疫苗正被探索用于诱导人体抗肿瘤 CD8+T 细胞应答。疫情前的小鼠研究已表明，mRNA 疫苗可诱导针对肿瘤模式抗原的 CD8+T 细胞应答；目前多项临床试验正测试其在胰腺癌新抗原免疫中的价值。

外源抗原的 CD8+T 细胞启动可通过多条抗原加工通路完成，并涉及不同类型的 APC，其具体方式受抗原递送形式影响。但这些机制在 mRNA 疫苗中尚未被系统研究。

常规树突状细胞（cDC）是启动初始 T 细胞的主要 APC，分为 cDC1 与 cDC2 两个亚群。cDC1 是捕获并呈递细胞相关抗原的核心 APC，在肿瘤、病毒感染与移植排斥中发挥关键作用；cDNA 与蛋白疫苗也严格依赖 cDC1 启动 CD8+T 细胞。然而，mRNA 疫苗是否遵循这一规律仍未明确。

APC 的类型会显著影响疫苗应答效果。例如，有效剂量下 cDC1 负责呈递新抗原肽以诱导小鼠纤维肉瘤 T3 细胞排斥；但高剂量 MHC‑II 限制性肽会被 cDC2 呈递，诱导 CD4+T 细胞向抑制性 1 型调节表型分化，最终导致肿瘤免疫失败。因此，阐明 mRNA 疫苗诱导 CD8+T 细胞应答的机制具有重要意义。

近期正电子发射断层显像–计算机断层扫描（PET‑CT）与生物发光成像研究显示，mRNA–LNP 疫苗的 mRNA 与蛋白表达主要集中在注射部位与引流淋巴结（dLN），脾脏、肝脏等远端器官表达水平极低，提示免疫启动可能仅发生在局部。但这些研究未评估远端低水平抗原的免疫原性，因此有必要开展功能层面的组织分布分析，明确 mRNA 疫苗接种后抗原转运的免疫学效应。

本研究利用 cDC 亚群缺陷的小鼠模型，探究 cDC1、cDC2 与交叉呈递在 mRNA–LNP 疫苗诱导 CD8+T 细胞应答中的作用。结果显示，mRNA 疫苗通过多条互补的抗原呈递通路激活 CD8+T 细胞：与严格依赖 cDC1 的 cDNA / 蛋白疫苗不同，mRNA 疫苗可不依赖 cDC1诱导全身性 CD8+T 细胞应答，cDC2 在体内外均发挥更突出的启动作用。

值得注意的是，mRNA 疫苗激活 cDC 的方式不依赖自身 MHC‑I 表达，cDC 可从非造血细胞获取非自身 MHC‑I 复合物（即交叉着装）。单细胞多组学分析显示，cDC1 与 cDC2 分别启动的抗原特异性 CD8+T 细胞，克隆增殖存在差异，但效应分化整体相似，这与两种缺陷小鼠均能通过 mRNA 疫苗实现肿瘤排斥的结果一致。

2 结果

2.1 mRNA 疫苗可全身性启动 CD8+T 细胞

既往研究显示，肌肉注射 mRNA–LNP 后，抗原主要在注射部位肌肉与引流淋巴结表达，远端器官几乎检测不到。但 CD4 + 与 CD8+T 细胞仅需数百个肽–MHC 复合物即可被激活，因此本研究检测了 mRNA 疫苗诱导抗原的功能分布。

研究向小鼠肌肉注射 10 μg 卵清蛋白（OVA）mRNA–LNP，并检测初始 OT‑I 细胞（OVA 特异性 CD8+T 细胞）在全身淋巴组织的增殖情况。结果显示：

初始 OT‑I 细胞过继转输后 24 小时内全身分布；
免疫后第 2 天，抗原特异性淋巴细胞快速聚集到抗原接触部位，血液中 OT‑I 细胞暂时消失；
第 3 天，增殖的 OT‑I 细胞重新出现在血液，且在脾脏、血液与淋巴结中分裂程度相当；
即使剂量降低 100 倍（0.1 μg），远端淋巴组织仍能诱导与引流淋巴结相当的 OT‑I 增殖；
免疫后第 1 天，所有检测的淋巴组织中 OT‑I 细胞均上调 CD69，证实CD8+T 细胞启动发生在全身。

为排除远端增殖是由注射部位活化的 T 细胞迁移而来，研究用 FTY720 阻断淋巴细胞迁出。结果显示，尽管血液中增殖 OT‑I 细胞被阻断，但脾脏与淋巴结中的增殖不受影响，证明远端 T 细胞活化由局部抗原呈递直接触发。

进一步验证注射部位细胞（肌肉细胞、巨噬细胞）能否直接作为 APC 启动 CD8+T 细胞：通过脾切除联合 CD62L 阻断，限制初始 T 细胞进入淋巴器官。结果显示，OT‑I 扩增显著降低，且注射部位的 OT‑I 聚集被完全消除，证明注射部位细胞无法直接启动 CD8+T 细胞，启动必须发生在次级淋巴器官内。

2.2 cDC1 与 cDC2 均可启动 CD8+T 细胞

为鉴定 mRNA 疫苗后启动 T 细胞的 APC，研究在免疫后第 2 天，从引流淋巴结与对侧淋巴结（cLN）中分选 cDC1、cDC2 与 B 细胞，与初始 OT‑I 细胞共培养。结果显示：

未免疫小鼠的细胞无法诱导 OT‑I 增殖；
引流淋巴结的 cDC1 与 cDC2 均可诱导 OT‑I 增殖，B 细胞无此能力；
对侧淋巴结仅 cDC2 可诱导增殖，强度较弱，与远端抗原水平较低一致。

这一结果令人意外，因为 cDC1 通常被认为是启动 CD8+T 细胞的核心 APC。为在体内验证，研究使用cDC1 缺陷小鼠（Δ32）与cDC2 缺陷小鼠（Δ1+2+3）：

用 OVA cDNA 疫苗免疫时，野生型与 cDC2 缺陷小鼠产生强烈 CD8+T 细胞应答，cDC1 缺陷小鼠完全无应答，证实 cDNA 疫苗严格依赖 cDC1；
用 OVA mRNA–LNP 疫苗免疫时，cDC1 缺陷小鼠的 CD8+T 细胞应答与野生型相当，cDC2 缺陷小鼠应答降至野生型的约 60%，与体外 cDC2 呈递能力更强一致；
肿瘤新抗原 mLama4 mRNA 疫苗也得到相同结果，证明该结论不依赖 OVA 抗原。

为排除后期扩增、存活等因素干扰，研究直接检测早期 CD8+T 细胞启动与增殖：向三种基因型小鼠转输 CTV 标记的 OT‑I 细胞，免疫后第 2 天，所有基因型的 OT‑I 均以相似分裂次数增殖，证明mRNA 疫苗可通过 cDC1 与 cDC2 冗余启动 CD8+T 细胞。

cDC 是启动初始 T 细胞的主要 APC。为验证 cDC 的必要性，研究使用 CD11c‑DTR 小鼠，通过白喉毒素（DT）选择性清除 cDC：清除后，四聚体阳性 CD8+T 细胞扩增几乎完全消失，证明mRNA 疫苗启动 CD8+T 细胞必须依赖 cDC。

同时，cDC1 与 cDC2 双缺陷小鼠（Δ32 × Δ1+2+3）在 mRNA 疫苗免疫后，CD8+T 细胞四聚体应答正常，证明单核细胞及其衍生细胞不参与 cDC1 非依赖的 CD8+T 细胞启动。综上，cDC1 与 cDC2 是 mRNA 疫苗启动 CD8+T 细胞的主要 APC。

2.3 APC 自身 MHC‑I 并非 CD8+T 细胞启动必需

mRNA–LNP 编码的抗原肽，理论上可通过 APC 直接转染呈递或交叉呈递加载到 MHC‑I。已知 WDFY4 是细胞相关抗原交叉呈递的必需蛋白，但本研究发现，野生型与 Wdfy4 敲除小鼠在 mRNA 疫苗诱导的 CD8+T 细胞应答上无差异，证明交叉呈递并非 mRNA 疫苗激活 CD8+T 细胞的主要通路。

直接呈递与交叉呈递均要求 APC 表达 MHC‑I，而交叉着装（cDC 从供体细胞获取肽–MHC‑I 复合物后激活 T 细胞）可绕过这一要求。为验证交叉着装是否参与，研究构建 CD11c‑Cre 介导的 cDC 特异性 β2 微球蛋白（B2m）敲除小鼠（cDC 表面无 MHC‑I，其他细胞保留）：

该小鼠对依赖交叉呈递的 Abelson‑mOVA 肿瘤无法启动 OT‑I，与 MHC‑I 三敲除（TKO）小鼠一致；
但对 OVA mRNA–LNP 疫苗，仍能强烈启动 OT‑I，内源 T 细胞应答也正常，证明cDC 自身 MHC‑I 并非必需。

为彻底排除 APC 表达 MHC‑I，研究构建野生型或 MHC‑I TKO 供体骨髓嵌合小鼠：MHC‑I 完全缺失的 cDC 仍能诱导可观的 CD8+T 细胞应答，进一步证实cDC 无需自身 MHC‑I 即可启动 CD8+T 细胞。

为量化交叉着装的贡献，研究构建不同组合的骨髓嵌合小鼠：

野生型→MHC‑I TKO 嵌合小鼠（cDC 无法从非造血细胞获取 MHC‑I，仅保留直接呈递与交叉呈递），OT‑I 增殖显著降低；
cDC1 缺陷→MHC‑I TKO 嵌合小鼠（仅 cDC2 作为 APC），OT‑I 增殖大幅下降，证明交叉着装是 cDC2 启动 CD8+T 细胞的主要通路。

已知肿瘤中 cDC2 的交叉着装依赖 I 型干扰素信号，而 mRNA 疫苗可强烈激活该通路。阻断 I 型干扰素受体（IFNAR1）后，cDC1 缺陷小鼠的 CD8+T 细胞应答显著降低，且 cDC 表面 H‑2Kb 转移减少，证明mRNA 疫苗以 I 型干扰素依赖方式，诱导 cDC 从非造血细胞获取肽–MHC‑I 复合物，支持 CD8+T 细胞启动。

2.4 mRNA 疫苗触发交叉着装

上述结果提示，mRNA 疫苗免疫时 cDC 可从非造血细胞获取肽–MHC‑I 复合物。为直接验证，研究构建 B6（H‑2b）与 BALB/c（H‑2d）完全异基因骨髓嵌合小鼠，可在体内检测供体 cDC 上不同 H‑2K 等位基因：

免疫后 BALB/c→B6 嵌合小鼠的脾脏中，cDC1 与 cDC2 高表达 H‑2Kd，并低水平获取宿主的 H‑2Kb；
约 10% cDC1 与 20% cDC2 为 H‑2Kd 高表达、H‑2Kb 阳性，且仅获取宿主型 MHC‑I，供体同型嵌合小鼠无此现象。

完全异基因嵌合小鼠的 mRNA 疫苗免疫结果显示，交叉着装可功能性支持 CD8+T 细胞启动，与 MHC‑I TKO→SJL 嵌合小鼠的结论一致。

2.5 cDC2 启动的 CD8+T 细胞可介导抗肿瘤应答

正常情况下，cDC1 缺陷小鼠无法排斥肿瘤。由于 mRNA 疫苗可在 cDC1 缺陷小鼠中启动 CD8+T 细胞，研究检测这些 T 细胞是否具备功能：

用对照或 OVA mRNA–LNP 免疫野生型与 Δ32 小鼠，再接种表达膜结合 OVA 的 1956 纤维肉瘤（1956‑mOVA）；
对照 mRNA 免疫后，野生型小鼠排斥肿瘤，Δ32 小鼠失败，符合 cDC1 依赖的肿瘤排斥规律；
OVA mRNA–LNP 免疫后，野生型与 Δ32 小鼠均完全抑制肿瘤生长，证明 cDC2 启动的 CD8+T 细胞功能完整。

同时检测 cDC1 与 cDC2 启动的记忆 CD8+T 细胞：免疫后 5–6 周，三种基因型的四聚体阳性细胞比例相当；Δ32 小鼠的 CD127 + 记忆细胞比例更高，cDC2 缺陷小鼠杀伤效率略低，但整体均能形成功能性记忆 CD8+T 细胞。

2.6 cDC1/2 启动的 CD8+T 细胞具有独特表型

为明确启动 APC 对 CD8+T 细胞转录与克隆谱的影响，研究对野生型、Δ32、Δ1+2+3 小鼠免疫后的 Kb‑SIINFEKL 四聚体阳性 CD8+T 细胞，进行单细胞 RNA 测序（scRNA‑seq）与 T 细胞受体测序（TCR‑seq）：

降维与无监督聚类分出 11 个亚群，包括终末效应、IL‑7R + 效应、增殖期、干细胞样、耗竭样、IFN 信号相关、初始 / 中央记忆与记忆亚群；
cDC2 缺陷小鼠的循环效应细胞比例更高；
TCR 分析显示，野生型与 cDC1 缺陷小鼠以克隆扩增的终末效应细胞为主，cDC2 缺陷小鼠则偏向循环与干细胞样群体；
超大型克隆（克隆数 > 20）在 cDC2 缺陷小鼠中更具循环与干细胞样特征。

综上，mRNA 疫苗激活的抗原特异性 CD8+T 细胞具有表型异质性与克隆多样性：cDC2 缺陷小鼠以循环与干细胞样群体为主，野生型与 cDC1 缺陷小鼠则以终末效应细胞为主。

3 讨论

本研究揭示了 mRNA–LNP 疫苗启动 CD8+T 细胞的多项关键机制：

cDC1 与 cDC2 冗余启动：注射部位的巨噬细胞、单核系与体细胞不直接参与，仅 cDC 迁移至淋巴器官完成启动；
全身性免疫启动：尽管疫苗局部注射，但 CD8+T 细胞在全身淋巴组织被激活，扩大了应答的 T 细胞库；
非常规呈递通路：除直接呈递与交叉呈递外，交叉着装是重要组成部分，且不依赖 WDFY4 介导的经典交叉呈递；
I 型干扰素依赖：交叉着装受 I 型干扰素调控，这也解释了新冠 mRNA 疫苗可增强肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的现象。

与蛋白、cDNA、病毒载体疫苗及肿瘤免疫严格依赖 cDC1 不同，mRNA 疫苗可灵活利用 cDC1 与 cDC2，这一差异可能与递送途径、LNP 脂质组成、炎症强度相关。静脉注射 mRNA 疫苗的研究显示其依赖 cDC1，提示递送方式会改变 APC 偏好。

交叉着装获取肽–MHC‑I 复合物无抗原特异性，因此 mRNA 疫苗可能诱导 cDC 从肿瘤等细胞获取广谱抗原肽，扩大呈递抗原谱，这对疫苗效力与潜在免疫病理均有重要意义。

cDC1 与 cDC2 启动的 CD8+T 细胞存在表型差异：cDC1 倾向诱导高增殖能力的大型克隆，cDC2 倾向诱导高 IL‑7R 表达的记忆细胞，但二者均能介导抗肿瘤与记忆形成。其在慢性应答中的效果仍需进一步研究。

4 方法（精简）

4.1 小鼠

野生型 C57BL/6J、OT‑I、CD11c‑DTR、Wdfy4−/−、SJL、BALB/c 小鼠购自 Jackson 实验室；cDC1 缺陷（Δ32）、cDC2 缺陷（Δ1+2+3）、双缺陷、cDC 特异性 B2m 敲除、MHC‑I TKO 小鼠为本实验室构建 / 提供。所有小鼠饲养于无特定病原体（SPF）环境，遵循动物伦理规范。

4.2 骨髓嵌合小鼠

受体小鼠经致死剂量照射后，过继转输供体骨髓细胞，重建≥7 周后用于实验；异基因嵌合小鼠需清除供体骨髓 T 细胞。

4.3 流式细胞术与细胞分选

使用 Cytek Aurora 与 BD FACSAria Fusion 流式仪，FlowJo v10 分析；表面染色含 Fc 阻断，按预设门控策略分选 cDC1、cDC2、B 细胞与 OT‑I 细胞。

4.4 免疫方案

mRNA–LNP：肌肉注射 10 μg OVA/mLama4 mRNA–LNP，第 0、7 天免疫，第 11 天检测；
cDNA 疫苗：基因枪注射 4 μg OVA cDNA，第 0、3、6 天免疫；
蛋白疫苗：AddaVax 佐剂乳化 OVA，肌肉注射；
肿瘤抗原：冻融 Abelson‑mOVA 细胞免疫。

4.5 体外 / 体内 OT‑I 启动实验

CTV 标记初始 OT‑I 细胞过继转输，免疫后检测增殖与 CD44 表达；FTY720 阻断淋巴细胞迁出，CD62L 阻断 + 脾切除限制 T 细胞进入淋巴器官。

4.6 四聚体染色与 ELISpot

SIINFEKL‑Kb 四聚体染色检测抗原特异性 CD8+T 细胞；IFNγ ELISpot 检测细胞因子分泌。

4.7 肿瘤实验

皮下接种 1956‑mOVA 纤维肉瘤，定期测量肿瘤面积，遵循伦理上限。

4.8 体内杀伤实验

转输 SIINFEKL 肽负载与无关肽负载的靶细胞，检测记忆 CD8+T 细胞杀伤效率。

4.9 单细胞测序

分选四聚体阳性 CD8+T 细胞，构建 scRNA‑seq 与 TCR‑seq 文库，Illumina 测序；使用 Seurat 包分析聚类、差异基因与克隆型。

4.10 统计分析

GraphPad Prism 10 分析，数据以均值 ± 标准差表示，采用 t 检验、方差分析（ANOVA）等，P<0.05 为差异显著。

数据获取

单细胞测序与 TCR 测序数据已上传至 NCBI GEO（登录号 GSE296093）；所有数据均在正文与补充信息中公开。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10353-6

摘要