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Expert Review of Vaccines/疫苗专家评论

近年来，以高度减毒痘病毒为病毒载体平台的药物生产取得了显著进展

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林纳斯·G·韦伯生物工艺工程与制药技术研究所

 ORCID Icon & Michael W. Wolff 德国吉森米特尔黑森应用科技大学（THM）生物过程工程与制药技术研究所通讯作者michael.wolff@lse.thm.de https://orcid.org/0000-0001-7443-3122 贡献监督、撰写——审阅与编辑

文章编号：2689611 | 2025 年 12 月 17 日收到 ，2026 年 6 月 10 日接受 ， 作者最终发表版本于 2026 年 6 月 13 日在线发布 ，2026 年 6 月 18 日正式发表。

摘要

介绍

高度减毒的痘病毒可作为强效的病毒载体、溶瘤病毒和治疗性疫苗。它们能够容纳并稳定维持大量的外源插入基因组。由于其在人体细胞中的复制能力有限，因此具有极佳的安全性，但同时也意味着需要更高剂量的感染性病毒颗粒才能达到完全的治疗效果。

覆盖区域

本文综述了痘病毒载体药物生产生物工艺的最新进展，主要关注牛痘病毒和羊痘病毒。这些进展包括利用高容许性细胞底物的上游工艺、优化的补料策略以及有利于下游工艺的病毒表型。本研究探讨了当前面临的挑战，并提出了使下游工艺适应强化上游工艺的策略，以实现经济高效的端到端生产。

专家意见

为了显著提高病毒扩增后的产量（最高可达2个对数级），我们提出用一种连续的纯化平台取代传统的吸附色谱法，将病毒与工艺相关的杂质分离。过滤操作有助于工艺规模化，同时减少用量，这有利于通过流通式精制工艺达到药品质量标准。结合人工智能建模，这些进步将减轻医疗系统的财务压力，并加速新型候选疫苗的临床应用。

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1. 引言

痘病毒曾被成功用作天花疫苗，并促成了 1979 年天花在全球范围内的根除[1]。同时，它们在病毒疫苗和溶瘤病毒领域也发挥着关键作用[1-4]。现代载体疫苗，特别是针对传染病和癌症的疫苗，可以利用减毒痘病毒作为载体，将遗传物质转导至患者体内，靶向哺乳动物细胞[5]。重组 DNA 技术能够实现痘病毒基因的特异性插入和删除[6,7]。利用病毒载体系统转移异源基因，可诱导体内治疗性产物的合成（表达）[8,9]。经改造的病毒被认为是安全性高、效力强且具有相当免疫原性的载体平台，可用于开发医用疫苗[9-11]。痘病毒的复制能力各不相同，且在哺乳动物细胞中的宿主范围非常有限[12-14]。它们的减毒株，特别是改良痘苗病毒安卡拉株（MVA）和羊痘病毒（ORFV），由于缺乏负毒力因子，具有极佳的安全性[15]。此外，MVA 中和抗体似乎不会对加强剂量产生负面影响[16,17]。对于基于 ORFV 的疫苗，未观察到 ORFV 中和抗体的诱导，表明 MVA 和 ORFV 疫苗均具有重复接种的潜力[9]。

在研发新型疫苗的同时，需要合适的生产工艺来确保疫苗的广泛和快速供应（ ）[9,18,19]。这需要一个上游工艺来生成产品，以及一个下游工艺来纯化产品[20,21]。上游工艺必须保证高产品收率，因为下游工艺的效率主要取决于起始原料中的产品浓度[22,23]。另一方面，下游工艺必须最大限度地减少产品损失[20]。此类工艺的高效放大需要特性明确的工艺单元，以适应病毒基产品的复杂性[24]。成熟的生产平台可以利用新型载体技术支持病毒亚型的生产[13,25-27]。

图 1. MVA 和 ORFV 研发与生产的关键进展。数十年来对痘病毒生物学和载体潜力的研究，完善了合适的细胞底物、培养基以及可扩展的上游和下游工艺策略。图中按时间顺序列出了生物工艺开发中的历史里程碑。这些进展对基于痘病毒的基因疗法在多种人类疾病治疗中的成功临床试验和监管审批起到了关键作用。插图由 BioRender.com 制作。

Timeline of developments in MVA and ORFV research and manufacturing from 1979 to 2026.

 

本文重点介绍痘病毒疫苗候选药物生产的最新进展，尤其关注 MVA 和 ORFV 载体。上游工艺的强化得益于 DNA 工程改造的定制细胞系作为底物，并结合新型病毒株在强化培养模式下的应用[14,23]。此外，高滴度上游工艺需要采用相应的生产工艺来纯化载体[19,20]。本文根据现行药品生产质量管理规范（GMP）指南，回顾了可扩展疫苗生产的最新工艺进展。

2.痘病毒是有效的疫苗载体

研究最为广泛的病毒载体来自痘病毒科 （Poxviridiae ）。该科分为两个亚科：昆虫痘病毒亚科（Entomopoxvirinae ），以昆虫为宿主；以及脊索动物痘病毒亚科 （Chordopoxvirinae ） ，以脊椎动物为宿主。 脊索动物痘病毒亚科又进一步分为若干属。该亚科中一种著名的病毒是正痘病毒属的牛痘病毒（VACV）[28]。由于 VACV 的复制特性，其应用受到限制，这对免疫抑制患者构成不利影响。因此，人们开发了高度减毒且复制缺陷的衍生病毒——MVA。该病毒在鸡胚成纤维细胞中经过 500 多代传代后，丢失了 15%的原始病毒基因组[29]。因此，MVA 失去了在哺乳动物细胞中完成复制周期和释放感染性病毒颗粒的能力，从而提高了 MVA 的安全性[30]。该疫苗已证实对患有特应性皮炎和免疫缺陷的动物和人类安全[31-34]。尽管毒力有所减弱，但该载体的免疫原性与痘苗病毒(VACV)相似[8,35]。目前尚无强有力的证据表明，预先存在的或诱导产生的针对该载体的 MVA 特异性免疫会干扰其疫苗诱导的免疫反应[17,36]。该载体在免疫反应重新激活的情况下仍能保持功能，这使其在异源初免-加强免疫应用中具有灵活性[16,37]。

ORFV 是一种用途广泛的副痘病毒属载体平台[38]。野生型 ORFV 是一种人畜共患病原体，可自然感染绵羊和山羊，因此与兽医学密切相关[24,38,39]。该病毒从一只感染的羔羊中分离出来，并在绵羊胚肾细胞的二级培养物中连续传代 135 代以减弱病毒毒力。随后，该病毒经噬斑纯化后，在牛胚肺异源细胞培养物中进一步扩增。所得毒株 D1701 被批准作为兽用活疫苗[40]。ORFV 毒株经进一步减毒后，构建了 D1701-VrV 毒株，作为一种多抗原疫苗平台，并在 I 期临床研究中显示出良好的安全性[9,41-44]。 ORFV 具有多种有利于药物应用的特性，包括能够诱导强烈的体液和细胞免疫反应，对靶抗原产生长期保护性免疫而不攻击 ORFV 载体，宿主范围有限，不会全身扩散，以及短暂的 ORFV 特异性免疫，从而可以进行再次免疫 [6,44,45]。

痘病毒颗粒具有包膜，呈砖状结构[10,46,47]。牛痘病毒颗粒的宽度通常为 140–260 nm，长度为 220–450 nm，厚度为 140–260 nm[48]。牛痘病毒（ORFV）呈卵圆形管状结构，宽度为 140–200 nm，长度为 220–300 nm[24,49,50]。它们具有双链 DNA 基因组，使其能够携带大量的基因组有效载荷[8]。异源基因组包含 178–334 个开放阅读框，其中 90 个与感染脊椎动物的痘病毒共有。它还可以容纳超过 24 kb 的外源 DNA 序列插入[47,51,52]。新的遗传信息可以插入痘病毒基因组的非编码区，使其能够用于基因递送，同时保持病毒载体的安全性[15,53]。痘病毒已被研究作为有前景的免疫调节剂和溶瘤剂，用于针对多种传染病和肿瘤的初免-加强免疫方案，包括艾滋病[21]、埃博拉病毒病[54]、马尔堡热[55]、结核病[56]、乳腺癌[57]和转移性黑色素瘤[58]。最近，一种基于腺病毒和 MVA 载体的异源初免-加强免疫疫苗方案已被批准用于预防埃博拉病毒感染[37,59,60]。

天花疫苗的临床可行性和商业化生产面临的挑战之一是治疗所需的病毒滴度较高。目前，多项基于 MVA 载体的临床研究正在进行中，涵盖 I 期至 III 期。为达到有效接种，低剂量疫苗的推荐剂量为 1 × 10⁰ TCID₁，高剂量疫苗的推荐剂量为 1 × 10² TCID₃ [11,25]。在癌症研究中，研究人员测试了更高剂量（1 × 10⁴ IU）的 MVA，患者耐受性良好 [61]。感染单位的差异源于分析方法的不同，与文献报道的数值相符。然而，目前仅有一项 ORFV 疫苗的人体研究（PRIME-2-CoV_Beta 项目）进入了 I 期临床试验 [62]。 列出了过去 6 年启动的基于 MVA 和 ORFV 的候选疫苗的临床研究概况。

表 1. 使用改良痘苗病毒安卡拉株或羊痘病毒作为病毒载体平台的正在进行或已完成的 I 期、II 期和 III 期临床试验概述。数据来源： https ://clinicaltrials.gov 2026 年 5 月 14 日。

姓名赞助产品描述靶向疾病临床试验临床试验状态国家临床试验编号
MVA-BN-WEV巴伐利亚北欧用于疫苗接种的重组多价 MVA 载体脑炎II积极主动，而非招募NCT06899802
Ad26.ZEBOV，MVA-BN-Filo伦敦卫生与热带医学院使用腺病毒载体+MVA 载体进行疫苗接种埃博拉II完全的NCT05284097
Ad26.ZEBOV，MVA-BN-Filo伦敦卫生与热带医学院在 Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo 疫苗方案后接种 Ad26.ZEBOV 加强针埃博拉II完全的NCT05064956
Ad26.ZEBOV，MVA-BN-Filo伦敦卫生与热带医学院在接受 Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo 疫苗接种方案后的儿童中接种 Ad26.ZEBOV 加强针埃博拉II完全的NCT04711356
Ad26.ZEBOV，MVA-BN-Filo杨森疫苗与预防公司使用腺病毒载体+MVA 载体对健康孕妇进行疫苗接种埃博拉III完全的NCT04556526
Ad26.ZEBOV，MVA-BN-Filo杨森疫苗与预防公司使用腺病毒载体+MVA 载体进行疫苗接种埃博拉III完全的NCT04228783
MVA MERS S_DF-1汉堡-埃彭多夫大学医学中心MVA 疫苗编码 MERS-S 特异性抗体反应中东呼吸综合征I完全的NCT04119440
CMV-MVA美国国家过敏症和传染病研究所MVA 疫苗编码 CMV 抗原，适用于同时感染 HIV 和 CMV 的成人巨细胞病毒II完全的NCT05099965
CMV-MVA希望之城医疗中心MVA 疫苗可产生 CMV 特异性免疫力巨细胞病毒磅招聘NCT07020533
MVA-BN巴伐利亚北欧MVA 是在不同的生产单元中制造的。猴痘II积极主动，而非招募NCT07199569
MVA-BN美国国家过敏症和传染病研究所MVA 疫苗剂量减少策略猴痘II完全的NCT05512949
MVA-BN®-RSV巴伐利亚北欧多价 MVA 向量呼吸道合胞病毒IIa完全的NCT04752644
MVA-BN华盛顿大学医学院MVA 疫苗对人体免疫反应的持久性牛痘I积极主动，而非招募NCT06366672
CD19-CAR T 细胞 + CMV-MVA希望之城医疗中心同种异体 CMV 特异性 CD19-CAR T 细胞 + CMV-MVA 疫苗急性淋巴细胞白血病I招聘NCT06735690
CMV-MVA希望之城医疗中心MVA 疫苗用于造血干细胞移植患者的巨细胞病毒特异性免疫巨细胞病毒II招聘NCT06059391
MVA-HBVac迈克尔·霍尔舍异源蛋白启动/MVA 增强疗法乙型肝炎Ib/IIa通过邀请注册NCT06513286
MVA-HBV巴林图斯生物治疗公司腺病毒和 MVA 载体疫苗联合单克隆抗体乙型肝炎Ib/IIa完全的NCT04778904
Ad26.Mos4.HIV + VAT-BN-HIV鲍里斯·尤尔格使用腺病毒载体+MVA 载体作为疫苗加强剂抑制性抗逆转录病毒疗法I/IIa积极主动，而非招募NCT04983030
MVA-HPV巴林图斯生物治疗公司加强免疫疫苗 ChAdOx1-HPV 和 MVA-HPV人乳头状瘤病毒Ib/II完全的NCT04607850
MVA-BN-短尾巴伐利亚北欧静脉注射 MVA-BN-Brachyury 疫苗实体转移瘤I完全的NCT04134312
DNA/CN54gp140 + MVA/CN54gp140医学研究理事会/乌干达病毒研究所和伦敦卫生与热带医学院乌干达研究部使用 DNA-HIV-PT123 HIV 疫苗和 CN54gp140+MPLA-L + MVA 载体作为加强针，以及 CN54gp140+MPLA-LHIV-1II完全的NCT04066881
MVA ME-TRAP + ChAd63 ME-TRAP图宾根大学医院MVA 和腺病毒载体的初免-加强免疫接种方案疟疾一/二尚未开始招聘NCT05441410
MVA-BN让-皮埃尔·范·格特鲁伊登MVA 疫苗皮下注射给孕妇和产后妇女猴痘III积极主动，而非招募NCT06844500
MVA-BN巴伐利亚北欧儿童 MVA 疫苗猴痘II积极主动，而非招募NCT06549530
MVA-BN让-皮埃尔·范·格特鲁伊登基于 MVA 疫苗的婴儿安全性和免疫原性试验猴痘III积极主动，而非招募NCT06844487
MVA-BN比利时热带医学研究所用于预防感染艾滋病毒的成年人猴痘的 MVA 疫苗猴痘II招聘NCT06839989
CMV 特异性 CD19-CAR T 细胞+CMV-MVA希望之城医疗中心巨细胞病毒特异性 CD19-CAR T 细胞+MVA 三联疫苗淋巴瘤I招聘NCT05801913
CMV 特异性 CD19-CAR T 细胞+CMV-MVA希望之城医疗中心巨细胞病毒特异性 CD19-CAR T 细胞+MVA 三联疫苗淋巴瘤I招聘NCT05432635
MVA-SIBP上海生物制品研究所MVA 疫苗猴痘II尚未开始招聘。NCT07253675
MVA上海生物制品研究所MVA 株猴痘减毒活疫苗猴痘I招聘NCT06771479
GEO-CM04S1GeoVax用于疫苗接种的重组 MVA 载体SARS-CoV-2一/二完全的NCT04639466
MVA-SARS-2-ST汉堡-埃彭多夫大学医学中心用于疫苗接种的重组 MVA 载体SARS-CoV-2I完全的NCT04895449
MVA-SARS-2-S汉堡-埃彭多夫大学医学中心用于疫苗接种的重组 MVA 载体SARS-CoV-2I完全的NCT04569383
ChAdOx1 + MVA美国国家过敏症和传染病研究所采用腺病毒 ChAdOx1 和 MVA 载体的保守嵌合 T 细胞疫苗，与 Toll 样受体 7 激动剂 vesatolimod 和两种广谱中和抗体进行序贯治疗。HIV-1一/二招聘NCT06071767
增值税 HIV-BANRS，新发传染病HIV MVA 疫苗HIV-1II完全的NCT04120415
ChAdOx1 + MVA北卡罗来纳大学教堂山分校腺病毒 ChAdOx1 和 MVA 载体的初免-加强免疫方案HIV-1I完全的NCT05604209
ChAdOx1 + MVA牛津大学腺病毒 ChAdOx1 和 MVA 载体的初免-加强免疫方案HIV-1I完全的NCT04586673
MVA62B加州大学旧金山分校MVA 疫苗加强针HIV-1一/二积极主动，而非招募NCT04357821
MVA-CMDR亨利·M·杰克逊军事医学促进基金会Prime-boost HIVIS DNA 和 MVA-CMDR 方案HIV-1I完全的NCT04301154
Prime-2-CoV_Beta图宾根大学医院用于加强免疫的 ORFV 病毒载体SARS-CoV-2I招聘NCT05389319

缩写：CMV，巨细胞病毒；HIV，人类免疫缺陷病毒；MERS，中东呼吸综合征。

3. 合适的细胞基质

已建立的哺乳动物细胞系，例如永生化的幼仓鼠肾细胞（BHK-21），可用于扩增和构建重组 MVA 毒株或 ORFV[63,64]。然而，使用永生化的人类 HeLa 细胞系仅能扩增痘苗病毒[65]。因此，需要一种合适的细胞基质，该基质既能支持病毒复制，又具有较低的抗病毒防御机制。

3.1. 鸡细胞基质

源自鸡胚的原代鸡胚成纤维细胞 (CEF) 常用于实验室中 MVA 病毒的生产。然而，鸡胚原代材料中的内源性逆转录病毒颗粒可能会污染由鸡胚生产的疫苗 [66]。内源性逆转录病毒是整合到宿主生殖系中的前病毒。它们在脊椎动物中很常见，在鸡和人类中分别占宿主基因组的 3% 和 8% [67–70]。然而，尚未发现鸡逆转录病毒对人类受试者构成任何风险。世界卫生组织 (WHO) 于 1998 年建议继续使用鸡源材料生产疫苗，因为疫苗的可衡量益处大于与内源性鸡逆转录病毒相关的理论风险。由于宿主限制，目前用于临床研究的 MVA 载体疫苗的生产基于从鸡胚中收集的原代和贴壁 CEF 细胞 [11,36,71–73]。然而，使用原始材料进行大规模疫苗生产较为复杂，而且细胞寿命有限，需要定期更新每一批细胞[21,23]。永生化鸡细胞，例如 DF-1 细胞，已被用于改进生产工艺，但它们对贴壁细胞基质的依赖性导致大规模扩增需要付出大量努力[18,74]。

3.2. 禽类定制细胞

与鸡的基因组相比，鸭属 （Anas） 的基因组已完成测序[75]，结果显示其前病毒基因组含量约为 1%。因此，在对可能对某些感染鸡的病毒不敏感的物种的禽类细胞进行永生化时，鸭源材料有望完全避免内源性逆转录病毒颗粒的污染问题。番鸭（ Cairina moschata ）原代外植体细胞系允许痘病毒的生产，但并非所有来自同一供体物种的细胞系都能复制该病毒。视网膜（CR）原代细胞经腺病毒 pIX 基因转染后进一步改造，获得了 CR.pIX 细胞系[23]。一些病毒，即使是与腺病毒无关的病毒，也可能受益于腺病毒 pIX 蛋白的存在，该蛋白可以提高某些病毒感染性颗粒的产量[23,76]。为了生产疫苗，CR.pIX 细胞系通过用人腺病毒 5 的 E1 基因转化原代细胞而永生化 [23]。永生化使得建立独立于原代材料的无病原体包装线成为可能，并且对于疫苗株的生产具有多种优势，这些疫苗株通过突变毒力因子而减毒，从而逃避免疫攻击 [21,23,77–80]。

另一种适用于生产人类疫苗的禽类细胞系是 EB66，它源自专有的禽类胚胎干细胞平台[81]。EB66 细胞无需基因、病毒或化学修饰即可展现长期遗传稳定性，这是通过多步骤工艺实现的，该工艺保留了胚胎干细胞的一些独特生物学特性[82]。根据欧盟和美国现行的监管指南，EB66 细胞系已通过特性分析，可用于人类疫苗，并解决了所有安全问题。卫生分析证实不存在内源性或外源性逆转录病毒感染颗粒[83]。EB66 细胞对多种人类和动物病毒具有容许性，因此被用作平台技术，尤其适用于 MVA 疫苗[22]。

3.3. 正确Vero

Vero 细胞系是世界卫生组织（WHO）首个获准用于生产人类疫苗的连续细胞系，并遵循特定的监管指南[84]。WHO Vero 参考细胞库 10-87 已获准用于疫苗生产，是未来生物制品研发的独特资源，可通过向 WHO 申请获得，作为建立主细胞库的种子细胞[85]。Vero 细胞系源自雌性非洲绿猴（ Chlorocebus sabaeus ），于 1962 年首次分离得到[86]。Vero 细胞贴壁生长，但也可进行改造以适应无血清悬浮培养，从而便于规模化生产[87,88]。Vero 细胞易感痘病毒，例如痘苗病毒（VACV）、绵羊痘病毒（SPV）和羊痘病毒（ORFV）[84,89]。由于 MVA 在 Vero 宿主中的复制水平较低[23,27]，因此 Vero 细胞主要用于 MVA 的滴度测定。相比之下，基于 Vero (CCL-81) 细胞底物的 ORFV 扩增已成功实现了纯化工艺的研究 [7,24,90]。然而，最近有研究报道了在人胚肾 (HEK) 细胞中实现 ORFV 可扩展上游生产的创新方法。

3.4. HEK293

人源细胞系 HEK293 因其转染效率高、生长速度快，且能在无血清悬浮培养基和化学成分明确的培养基中生长，而被广泛用于病毒疫苗生产。自 2015 年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准多种生物制品使用 HEK293 细胞作为宿主进行生产[91]。目前已建立了稳定的病毒载体生产细胞系，实现了病毒载体的规模化生产[19,92]。例如，Gibco 公司提供的商业化载体生产平台，利用 HEK293F 衍生病毒生产细胞（VPC）和 VPC 2.0，在定制的化学成分明确的培养基中进行病毒生产[93-95]。VPC 可用于规模化、高滴度的 ORFV 生产，因此在工艺开发方面优于其他非人源绵羊皮成纤维细胞系[19,25]。然而，HEK293 细胞系中已发现抗病毒防御机制，ORFV 也针对这些机制采取了相应的策略[96,97]。通过基因工程改造 HEK293 细胞以抑制抗病毒反应，可以提高痘病毒的生产效率，从而获得比以往更高的病毒滴度[19]。

4. 生物工艺开发

痘病毒在细胞培养中的生产可分为上游和下游两个步骤[19,20]。由于痘病毒具有裂解性，细胞必须首先在生长阶段进行培养，以达到足够的细胞密度。一旦有足够的细胞底物用于病毒生产，即可感染细胞并开始病毒复制。当病毒滴度达到峰值时[19]，收集细胞，并通过下游工艺将病毒与工艺相关的杂质分离，得到最终制剂所需的最终产品[24,90]。这些杂质包括完整细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞 DNA 和培养基成分。从收集的细胞开始的病毒纯化过程总结于 中。

图 2. 痘病毒生产工艺流程图。下游工艺（DSP）分为三个部分：澄清、纯化和精制。病毒收获后，在澄清步骤中去除细胞和细胞碎片等大颗粒。纯化和精制步骤则去除与工艺相关的小杂质，例如宿主细胞蛋白和宿主细胞 DNA。根据产品应用和澄清单元的不同，可以引入可选的 DNA 降解步骤，以去除宿主 DNA 并降低进料流的粘度。切向流过滤（TFF）步骤可以集成在各个单元之间，用于浓缩产品或通过超滤和渗滤交换缓冲液，以进行后续单元操作。由于痘病毒的尺寸相对较大，孔径≤0.2 µm 的无菌过滤是一项重大挑战。对于制药级生产，整个工艺必须在无菌环境下进行。插图由 BioRender.com 制作。

Poxvirus production: upstream, clarification, purification, polishing, final product stages.

 

作为痘病毒载体上游的候选细胞系，悬浮细胞基质更有利于向工业化大规模生产转移。高产上游工艺的设计取决于痘病毒的复制机制。痘病毒完全在细胞质内被称为“工厂”的结构中复制，这些“工厂”编码用于 DNA 复制和基因表达的蛋白质[98,99]。复制过程基于细胞间接触或在宿主细胞上形成肌动蛋白尾[100]。这涉及产生细胞相关的包膜病毒和胞外病毒，这些病毒倾向于形成聚集体[14]。

4.1. 可扩展的 MVA 放大，适用于补料分批和连续模式

使细胞适应悬浮生长会造成细胞间隙增大，许多病毒在这种选择压力下无法传播[13,14,101]。在悬浮的 CR 和 CR.pIX 细胞中传代培养 MVA 病毒，产生了新的表型 MVA-CR19，这是因为在化学成分明确的悬浮液中的复制与在组织中的复制不同。使用添加了 2 mM GlutaMAX（Invitrogen）和 10 ng/mL −1 Long-R3IGF（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）的 CD-U3 培养基，在单细胞培养中增殖细胞。在感染阶段，加入等体积的 CD-VP4 病毒生产培养基（Biochrom，德国）以诱导悬浮细胞聚集。在分离得到新基因型的纯株后，与野生型对照相比，MVA-CR19 通过促进病毒从宿主细胞逃逸，在细胞外培养基中表现出更高的感染活性[14,21]。

尝试优化一种既能满足禽类细胞系传代又能满足病毒生产需求的培养基的努力均告失败[27]。由于 MVA 感染主要涉及细胞间接触，因此设计了一种化学成分明确的病毒生产培养基，以在感染阶段诱导细胞聚集。由此，开发了一种补料分批培养工艺，该工艺使用增殖培养基支持细胞生长，随后使用一种旨在增强 MVA 复制的二级病毒生产培养基。

在容量不超过 45 mL 的摇瓶小规模实验中，感染时细胞密度为 1–3 × 10⁰ 个细胞/mL 时，在 MOI 为 0.01–1 时，可获得超过 10² IU/mL 的稳定高产量 [27]。MVA 的生产也已在波浪式生物反应器中成功实现 [102]。CR.pIX 平台已被证明具有完全可扩展性，在 1 至 50 升的生物反应器规模下，重组和野生型 MVA 的病毒滴度范围为 2.95 × 10⁴ 至 2.60 × 10⁵ PFU/mL，在 200 升规模下，滴度超过 10⁷ PFU/mL [27,103]。采用 EB66 细胞系进行重组 MVA-GFP 生产的补料分批培养工艺也得到了优化，在感染期间添加了病毒生产培养基 [22,104]。该工艺已证明可从 0.1 L 搅拌烧瓶扩展到 20 L 生物反应器，可获得可重复的 MVA 滴度为 1 × 10 8 TCID 50 mL −1 [22]。

为了进一步提高病毒滴度，人们开发了高细胞密度培养工艺，但细胞特异性病毒产量通常会降低（细胞密度效应）或降低时空产量。为了克服这一限制，研究人员针对 CR.pIX 悬浮细胞培养中 MVA-CR19 的生产，开发了感染前后的优化补料策略。补料策略的比较表明，在每日更换培养基的延长病毒生产阶段，病毒滴度可达 1.0 × 10⁰ 病毒颗粒/mL，而分批补料策略仅能产生 3.7 × 10² 病毒颗粒/mL [105]。采用 MVA-CR19 病毒生产培养基，在细胞生长和感染后期阶段持续供应营养物质，进行混合补料分批/灌流培养，可获得 1.0 × 10⁴ IU/mL 的最大感染滴度 [106]。这证明，高效的病毒生产需要细胞获得充足的营养供应。

在病毒生产过程中，采用灌流模式和声波沉降器进行连续培养基交换，可使 CR.pIX 细胞密度达到 37–38 × 10⁰ 个细胞/mL。与分批处理相比，灌流工艺对 MVA-CR19 毒株的时空产率提高了 600% 以上（1.05 × 10² TCID₅₀/L/天）。由于有更高比例的 MVA-CR19 释放到上清液中，因此无需收集完整的细胞裂解液。只需通过声波室连续收集无细胞培养基，即可方便后续的下游处理 [20]。

4.2. ORFV 批量扩增

目前，ORFV 载体已成功在贴壁 Vero 细胞培养中生产，用于实验室应用[7]。然而，关于 ORFV 高效上游加工的公开数据有限。已有研究表明，利用 HEK293F 生产细胞系可以实现 ORFV 毒株 D1701-V-GFP 的规模化生产。在 10 L 搅拌釜式反应器中，以 1.5 × 10⁰个细胞/mL 的密度感染细胞，粗病毒收获滴度为 2 × 10² IU/mL。在相同条件下的另一批 ORFV 中，病毒滴度达到 6 × 10⁴ IU/mL，感染后 48-72 小时内，50%的病毒积累在上清液中[19]。 概述了上游加工工艺及其对应的 MVA 和 ORFV 产量， 则对各种工艺的优缺点进行了比较。

表 2. 痘病毒生产上游工艺概述。

中等的增长模式培养模式规模病毒病毒滴度最大值参考
Vero含 5% 胎牛血清、厄尔氏盐、非必需氨基酸和 L-谷氨酰胺的 MEM 培养基，10 μL 青霉素，100 mg/L 链霉素粘合剂T 型瓶175 厘米 2ORFV-GFP10 6 -10 7 PFU mL −1[Citation7]
HEK293F化学成分明确的培养基（LV-MAX 生产培养基）暂停生物反应器（批次式）10升ORFV-GFP1.88 × 10 7 IU mL −1[Citation19]
CEF含 10%乳清蛋白和 5% BMS 的 MEM 培养基粘合剂T 型瓶175 厘米 2MVA0.1 × 10 8 PFU mL −1[Citation101]
CEF超低蛋白无血清培养基（VP-SFM）粘合剂T 型瓶25 厘米 2MVA3.28 × 10 9 PFU mL −1[Citation107]
BHK-21含 2%胎牛血清的 EMEM 培养基粘合剂6孔组织培养nsMVA1 × 10 7 PFU mL −1[Citation63]
CR.pIX
CR		在添加了 4 mM 谷氨酰胺的无血清腺病毒表​​达培养基中进行增殖，并在 HyQSFM4MegaVir 中进行感染粘合剂
暂停		T 型瓶
波浪式生物反应器		25–300 厘米 2
1升		MVA3.2 × 10 8 PFU mL −1
2.5 × 10 7 PFU mL −1		[Citation102]
Vero，HeLaDMEM +10% 胎牛血清暂停滚珠瓶34,000 厘米 2牛痘病毒1 × 10 9 ip mL −1[Citation65]
EB66IA81981 培养基，含 2.5 mM L-谷氨酰胺和 1 倍浓度的化学成分明确的水解融合液，用 DMEM 稀释。暂停生物反应器（批次式）2升
20升		MVA-GFP1.0×10× 8 TCID 50 毫升 −1[Citation22]
CR.pIXCD-U2、CD-VP4（化学定义）暂停生物反应器（批次式）50升MVA-CR192.95 × 10 8 PFU mL −1[Citation27]
CR.pIXCD-U5（化学定义）暂停生物反应器（批次式）
生物反应器（灌注式）		1升MVA-CR19.GFP1.7 × 10 10 TCID 50 L bioreactor−1 天 −1
10.5 × 10 10 TCID 50 L bioreactor−1 天 −1		[Citation20]

缩写：BMS，基础培养基补充剂；DMEM，Dulbecco 改良 Eagle 培养基；EMEM，Eagle 最低必需培养基；FCS，胎牛血清；MEM，最低必需培养基；ns，未指定。

表 3. 基于痘病毒载体的不同上游策略的关键比较。其影响根据与制药相关的生产方面进行评估，从轻微正面（+）到强烈正面（++++）。

 

上游战略可扩展性过程稳健性监管复杂性低商品成本体积生产率低体力劳动无污染风险
批+++++++++++++++++++++++
补料分批+++++++++++++++++++++++++
灌注+++++++++++++++
高细胞密度++++++++++++++++++++++
工程细胞系++++++++++++++++++++++++

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4.3 痘病毒纯化

下游处理（将病毒与工艺相关杂质分离）通常在病毒滴度达到最高值或病毒释放到培养基中时开始[19,20]。痘病毒载体下游工艺的开发高度依赖于上游工艺、生产过程中产生的污染物以及特定病毒株的大小和电荷特性。病毒株的大小给最终的无菌过滤带来了挑战，因此无菌生产是目前最先进的技术。病毒的稳定性和感染性是关键的治疗质量属性，在设定所有工艺步骤的参数时必须考虑这些属性，尤其要注意缓冲液的组成[89,90]。

4.3.1. 预处理可提高工艺效率

宿主细胞内残留病毒滴度的比例决定了病毒收获前是否需要进行细胞裂解以提高后续下游操作的效率[22]。如果细胞裂解不适用，则细胞外感染性病毒颗粒的数量必须足够高，以确保即使在细胞去除过程中产量降低，该工艺仍具有经济可行性。由于大多数痘病毒的感染单位仍与细胞结合，因此需要制备完整的细胞裂解液以启动 MVA 和 ORFV 纯化的下游工艺[22,24]。可选的细胞裂解方法包括冻融循环或有限的、可扩展的机械方法，例如使用转子-定子混合器[22]。超声处理是 MVA 的常用方法，尤其适用于在滴定试验前分散聚集体[20]。收获无细胞上清液会导致细胞相关病毒的损失，但已有报道成功地使用声波沉降器进行灌注分离，无需细胞裂解即可分离 MVA-CR19[20]。因此，根据具体的细胞系、病毒株、上游操作模式和培养基，可以使用不同类型的起始材料。

4.3.2. 用于核酸酶处理的高盐环境

尽管 MVA-CR19 和 ORFV 组分会在上清液中积累，但这些颗粒仍然容易聚集或与宿主细胞染色质相互作用[14,19]。使用含有弱离液盐的缓冲液可以防止这种情况的发生[108,109]。例如，含有 20–50 mM Tris（pH 7.5–8.0）和 250–1000 mM NaCl 的缓冲体系已被用于收集产生 MVA-GFP 的 EB66 悬浮细胞[22]。在另一个案例中，向 MVA 收获物中添加了含有 NaCl、NaBr 和 KCl 的 700 mM 离液盐混合物，以防止包膜病毒颗粒与宿主细胞 DNA 形成稳定的结合[20]。

利用盐活性核酸酶降解 DNA 可降低进料粘度，并有助于将小 DNA 片段从病毒颗粒中分离出来。在生理盐条件下进行纯化而不进行核酸酶处理，会导致剩余 DNA 含量仅为起始原料的 13%，不符合监管要求[89]。强化上游工艺会导致颗粒数量增加，从而增加病毒非特异性结合的风险，并需要更高浓度的成本高昂的添加剂，例如核酸酶。为了克服高盐环境下的核酸酶抑制，人们开发了耐盐且药用级的核酸酶[19]。宿主细胞染色质的断裂可通过将病毒颗粒从表面结合的染色质上分散开来降低聚集效应。此外，DNA 片段化有助于分离，并使残留 DNA 无害化，从而满足监管机构要求的每剂疫苗中 DNA 含量低于 3-10 ng 的要求[24]。核酸酶处理通常在澄清步骤之前或之后进行。在澄清过滤之前使用核酸酶处理，可通过分散作用提高产品收率，并通过降低进料流粘度来提高过滤能力，从而降低背压。或者，在澄清之后进行核酸酶处理，可以利用病毒收获物中总颗粒含量降低的优势，从而降低非特异性核酸酶吸附的风险并减少所需的核酸酶浓度[19]。早期应用核酸酶处理可以减少所需的工艺步骤总数，因为核酸酶将被后续的切向流过滤 (TFF) 和色谱步骤去除。 在后期使用核酸酶步骤时，核酸酶受益于预纯化材料中底物结合效率的提高，但随后需要额外的去除步骤。

4.3.3. 说明

已有多种基于大小或密度将病毒与细胞和细胞碎片分离的单元操作被应用于天花病毒的分离[24,89]。对于大多数实验室应用而言，离心是一种简便的方法，可在后续纯化步骤之前降低收集的病毒材料的颗粒负荷，因为后续纯化步骤对浊度非常敏感。虽然小型离心机应用广泛，且使用蔗糖垫的超速离心法能够提供适合临床前研究的病毒浓度，但大型离心机价格昂贵，且限制了工艺的规模化应用。

过滤是一种可扩展且经济的基于尺寸的分离方法，可以轻松集成到任何工艺流程中。然而，由于 MVA 和 ORFV 在感染后期具有裂解特性，且部分病毒仍与细胞结合，因此澄清步骤尤其具有挑战性。在大规模生产天花病毒时，使用截留率小于 5 µm 的深度过滤器进行澄清过滤通常会导致整个回收过程中最高的产品损失[20,65]。已有文献描述了使用聚丙烯膜对 ORFV 进行澄清过滤的方法，该方法采用两级过滤级联，串联使用截留率分别为 5 µm 和 0.65 µm 的过滤器[24]。在其他工艺中，聚丙烯基过滤器对 ORFV 的回收率最高，达到 70-77%，对 MVA 的回收率达到 60-82%，而纤维素膜对 ORFV 的回收率仅为 20-31%[19,20,24]。纤维素表面略带正电荷，由于其表面带负电荷，可以在中性 pH 进料流中吸附包膜病毒。然而，纤维素也可能吸附工艺相关的杂质。产品回收率与污染物去除率的比值表明，聚丙烯基过滤器是最经济的选择。用于深度过滤的聚丙烯材料似乎非常适合澄清含病毒的上清液，并且相对惰性[110,111]。与常用的聚乙烯、聚砜和聚苯乙烯膜等材料相比，它的表面张力能更低[112,113]。此外，与硅藻土（一种标准的深度过滤材料）相比，这种材料在很大程度上可以防止与病毒颗粒的静电相互作用[110,111]。 调整合适盐的浓度也能提高深度过滤的产率[20]。

结合灌流发酵生产单分散 MVA，可使用 0.45 µm 深度的过滤器进行死端过滤澄清[20]。该过滤器的截留粒径接近 MVA 颗粒的粒径，进料在灌流模式下使用声波过滤器进行预纯化。此步骤可去除细胞、细胞碎片和较大的病毒聚集体，从而将澄清过滤的病毒回收率提高至 74%。值得注意的是，通过滤膜的病毒量与上清液中 MVA-CR19 的量相对应[21]。声波沉降器降低了 0.45 µm 过滤器上的颗粒负荷，使得灌流和分批处理工艺的过滤容量分别高达 290 L m⁻²和 175 L m⁻²。与分批处理相比，MVA 回收率下降了 50%。这可能是由于分批处理模式下感染阶段病毒在生理环境中的停留时间不足，无法有效抑制聚集效应。连续收集灌注后较高的病毒回收率也归功于声波沉降器在过滤前去除了病毒聚集体和细胞相关病毒。因此，进料中聚集体和细胞相关病毒含量减少，从而提高了澄清过程中的病毒回收率。此步骤之后，澄清后的物料将在后续步骤中进行纯化，以去除残留的关键宿主细胞 DNA 污染。

4.3.4. 过滤法中间体纯化

对于中间纯化，通常采用切向流过滤 (TFF) 超滤，其截留分子量小于病毒粒径，以将病毒颗粒保留在截留液中 [22]。TFF 在病毒滴度低于所需疫苗剂量的工艺中至关重要，因此必须将病毒浓缩至治疗浓度 [22,25]。该单元操作可整合到下游工艺的各个步骤中——既可作为澄清后的早期步骤以减少后续步骤的处理体积，也可作为色谱分离后的后期步骤以达到最终治疗剂量 [22]。在渗滤模式下，TFF 可同时进行缓冲液交换和去除病毒浓缩液中的小污染物，例如 DNA 片段。大孔径膜有利于小污染物的渗透。然而，使用小孔径膜会导致浓度极化加剧，进而促进污染物的共纯化。使用 300 kDa Centramate 盒浓缩每 50 孔板培养 5 × 10 9 PFU 的高 ORFV 滴度，然后用 5% 蔗糖磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 进行透析过滤 [25]。

MVA 常用的过滤截留孔径为 0.1 µm 的聚醚砜（PESU）膜微滤盒[22,27]。对于 MVA，在进行色谱步骤之前，采用切向流过滤（TFF）将澄清的滤液浓缩十倍。特别注意缓冲体系，在进行色谱步骤之前，先在 20 mM Tris 缓冲液（含 250 mM NaCl）和 50 mM Tris 缓冲液（pH 8.0，含 1 M NaCl）中进行两次透析[22]。由于病毒具有包膜结构，其颗粒似乎对剪切力敏感。为了保持病毒的感染性，应尽量减少泵循环次数和剪切速率[22]。

4.3.5.色谱法捕获和精制

基于膜的空间排阻色谱法 (SXC) 已被证实是一种可扩展的精制方法，适用于 MVA 和 ORFV [20,24,89]。对于 MVA，已开发出一种结合-洗脱系统，该系统使用终浓度为 700 mM 的 NaCl、NaBr 和 KCl 的 PBS 缓冲液作为洗脱缓冲液和平衡缓冲液，并将聚合物 PEG 6000 溶解于与平衡缓冲液具有相同盐组成的 PBS 缓冲液中。每四个纯化循环更换一次柱膜，可实现 67.5 mL h⁻¹ 的细胞培养上清液的纯化 [20]。SXC 可成功地将宿主细胞 DNA 浓度降低至 10 ng mL⁻¹ 以下 [1]。

在 ORFV 捕获步骤中，SXC 被用作一级色谱步骤。将澄清并经核酸酶处理的样品与 pH 7.4 的 20 mM Tris 缓冲溶液混合，该缓冲溶液含有 32% (w/v) PEG 8000 和 180 mM NaCl，最终 PEG 浓度为 8%。洗脱使用不含 PEG 的 20 mM Tris 缓冲液，并补充 400 mM NaCl，最终 ORFV 回收率为 3%~90%。膜面积为 13.3 cm²，每次纯化循环后必须更换[24]。SXC 是一种平台技术，因为它基于尺寸的物理分离机制，不会影响病毒颗粒[24,114,115]。然而，由于产品产量波动和背压限制，SXC 目前仅应用于临床前研究，这限制了其规模化应用。

为了利用离子交换剂捕获 MVA，人们探索了其他色谱技术。MVA 和 ORFV 的等电点在 pH 4.0–4.1 之间，这使得病毒表面的负电荷可以在中性 pH 条件下用于分离[89,116]。含肝素和硫酸纤维素的伪亲和膜吸附剂（MA）已被测试作为合适的膜吸附剂。硫酸纤维素膜可有效分离 DNA，产物中仅残留 10%的双链 DNA 和 65%的病毒[117]。肝素 MA 可使产物中 DNA 减少 32%。一种很有前景的组合是使用硫酸纤维素膜吸附剂，然后进行苯基疏水相互作用色谱，可获得 76–55%的病毒产量和 0.01–0.6%的残留 DNA。相比之下，阴离子交换膜吸附和强阳离子交换均无法从 MVA 颗粒中分离 DNA[117]。染色质 DNA 骨架上的负磷酸基团与膜的相互作用方式似乎与 MVA 的负表面电荷类似。能够从产品中分离并去除 DNA 的树脂对于捕获和精制步骤都特别有价值，以满足监管要求。然而，由于并非所有类型的纳米复合物都具有肝素亲和力，因此值得评估其他平台方法。

4.3.6. 流通式抛光

精制色谱技术用于将残留污染物降低至监管机构规定的水平。尺寸排阻色谱 (SEC) 通过将病毒和病毒聚集体排除在较小的孔隙之外，无需特定的吸附过程，从而最大限度地减少病毒损失。据报道，MVA 的精制过程中，平衡缓冲液中含有 1 M NaCl，最终工艺收率为 41% [22]。

多模式尺寸排阻色谱 (mmSEC) 结合了尺寸排阻和吸附机制，可增强杂质去除效果。它已被用作 ORFV 精制纯化的二级色谱步骤。色谱柱（CaptoCore 700，Cytiva）用 pH 7.4 的 20 mM Tris 缓冲液（含 180 mM NaCl）进行平衡，从而确保样品上样的生理条件。病毒产物位于穿透液中，两种不同的 ORFV 重组体的回收率分别为 99% 和 95% [24]。宿主细胞蛋白和宿主细胞 DNA 等小分子杂质会与树脂的内部配体结合。通过在 pH 7.4 的 20 mM Tris 缓冲液中加入 2 M NaCl 进行柱再生，可以洗脱结合的分子，从而使树脂能够多次使用。这导致 3% 至 99% 的宿主细胞蛋白和 98% 的宿主细胞 DNA 被去除。 mmSEC 的结合效率取决于负载物质的离子强度，必须针对预处理后的起始原料进行单独测试。 总结了用于天花疫苗生产的色谱和过滤技术，包括其放大生产的潜力。

表 4. 病毒纯化方法和回收率概述。

 
杂质去除
DSP 中的位置和注释纯化方法病毒起始材料DNA蛋白质每阶段收率[%]参考
澄清孔径为 0.45 µm 的 PP 深度过滤器MVA-CR19.GFP从批次中加入 0.05% (v/v) NaN3 3 、700 mM NaCl、NaBr 和 KCl 混合物后，粗提物收割。nsns59.8%[Citation20]
澄清孔径为 0.45 µm 的 PP 深度过滤器MVA-CR19.GFP在加入 0.05% (v/v) NaN₃ 3 、700 mM NaCl、NaBr 和 KCl 混合物后，通过声波沉降器灌注法粗提物。nsns81.6%[Citation20]
澄清PP3 深度过滤，孔径为 0.65 微米。ORFV-GFP孔径为 5 µm 的 PP3 深度过滤器53%20%70%[Citation24]
DNA 消化将 35 U mL −1 核酸酶（酶活性 > 250 U µL −1 ，20,804-100k，c-Lecta）与 3 mM MgCl₂ 2 混合，在 37°C 下孵育 4 小时，并以 100 rpm 的速度搅拌。MVA-CR19.GFP在加入 0.05% (v/v) NaN₃ 3 、700 mM NaCl、NaBr 和 KCl 混合物后，用声波沉降器灌注澄清收获物（PP 0.45 µm）。每剂<10 ngnsns[Citation20]
DNA 消化核酸酶浓度为 60–75 U/mL −1 ，37°C 反应 4 小时ORFV-GFP (D1701-V-GFP)从 HEK293F 细胞中提取的粗提物，在接种后 72 小时进行收集，并补充 10 mM MgCl 2<500 毫升 −1nsns[Citation19]
捕获SXCORFV-GFP
ORFV-mCherry		澄清（PP3 深度滤膜组合 5 和 0.65 µm 截留率）和 DNA 消化76%
81%		98%
98%		92%
86%		[Citation24]
捕获IEX（Q75-MA）
IEX（D75-MA）
IEX（C75-MA）
IEX（SC75-MA）
伪亲和力 MA（肝素-MA）
伪亲和力 MA（硫酸纤维素-MA）		MVA-BN从 CEF 细胞中提取的澄清提取物16%
30%
7%
0%
7%
0%		8%
7%
2%
12%
14%
0%		91%
89%
102%
95%
91%
96%		[Citation117]
纯化SXCMVA-CR19在加入 0.05% (v/v) NaN₃ 3 、700 mM NaCl、NaBr 和 KCl 混合物后，用声波沉降器灌注澄清收集物（PP 0.45 µm）。消化 DNA 并用 PP 0.45 µm 滤膜过滤。每剂<10 ng每剂11微克50.5%[Citation20]
纯化伪亲和力结合二级 HIC-MA
肝素-MA 联合二次 HIC-MA		MVA-BN从 CEF 细胞中提取的澄清提取物99.4%–99.99%
97.5%–99.96%		>99.9%55-76%
44%–50%		[Citation118]
纯化DNA 消化、澄清、初级切向流过滤、AEC、DNA 消化、二级切向流过滤、SECMVA-GFP原油收割每剂量 4.0 纳克每剂9.3纳克41%[Citation22]
纯化二级市场 IEX-Q
二级 IEX-耐盐聚酰胺
二级 IEX-S
含苯基配体的 HIC
CC700
硫酸化纤维素膜吸附器		ORFV-GFP澄清（离心），SXC（捕获）37%
37%
31%
8%
13%
30%		0%
0%
0%
0%
0%
0%		57%
48%
39%
64%
76%
45%		[Citation89]
抛光毫米秒ORFV-GFP
ORFV-mCherry		澄清（5 + 0.65 µm PP 深度过滤）、DNA 消化（250 U mL −1 核酸酶，室温孵育 1 小时）和 SXC 捕获98%
96%		>99%
>99%		91%
86%		[Citation24]

缩写：AEX，阴离子交换色谱；CEF，鸡胚成纤维细胞；IEX，离子交换色谱；MA，膜吸附器；mmSEC，多模式尺寸排阻色谱；ns，未指定（即未说明或未测试）；PP，聚丙烯；SEC，尺寸排阻色谱。

 展示了最近被确定为痘病毒生产中最有效的最先进方法，这些方法在可扩展的上游和下游工艺的结果中均有报道。

图 3. 按时间顺序展示了现代技术，以说明一个典型的痘病毒端到端生产流程。最先进的上游工艺采用搅拌釜式反应器。病毒收获物经核酸酶处理，该处理可与澄清过滤交替进行。SXC 同时纯化和浓缩目标产物。根据杂质含量，可能需要进行流通式精制以达到最终制剂所需的纯度水平 [19,20,24,74]。插图由 BioRender.com 制作。

A flowchart illustrating state-of-the-art processes in poxvirus production from upstream to formulation.

 

5. 人工智能增强型痘病毒生产

人工智能是一门基于计算机的科学，专注于创建能够根据预定义规则或数据中可识别模式自主做出决策的程序[119]。迄今为止，人工智能在痘病毒领域的应用尚未见报道。然而，它已成功应用于类似的病毒载体加工，以加速工艺开发并降低成本，从而提高载体的可及性和临床转化率[120]。人工智能和机器学习已在载体设计[121]、培养基优化、培养策略[122]、过程控制[123]以及后续下游工艺[120,124,125]等方面展现出显著优势，这些应用均有助于改进痘病毒的加工。

5.1. 人工智能从历史机动车估值流程发展中学习

近几十年来，MVA 工艺开发的历史数据已被用于人工智能工具，并优化上下游工艺的实时结果[13,20,21,23,27,74,126]。在智能过程分析之后，算法可用于模拟基于先前 MVA 研究结果的各种场景。它们已被用于预测生物工艺中深度过滤器的负载能力。在预测过滤器背压随时间的变化时，需要考虑多种因素，包括浊度、细胞计数和细胞活力[124]。如果需要转移此类工艺，人工智能可以提供进一步的优化方法来提高放大性能。根据质量源于设计（QbD）原则，将人工智能与过程分析技术相结合对生产具有重要价值[123,127]。

利用人工智能模型预测病毒载体的长期稳定性、保质期和基因毒性，是基因组载体设计中的一项有益工具[128]。已知转基因会影响重组病毒的物理特性，例如质量、形态和电荷[129,130​​]。人工智能可以基于载体修饰预测这些特性的潜在结果，并校准关键参数，例如捕获色谱法中使用的参数[121,131]。研究人员已证明，可以使用基于多目标的贝叶斯方法对蛋白 A 色谱法和阳离子交换色谱法进行建模，并优化纯化过程以获得稳定的产量[125]。美国食品药品监督管理局（FDA）已发布多份关于人工智能在制药行业应用的指导文件，并且正在制定良好机器学习实践（GMLP）原则。人工智能必须符合药品生产质量管理规范（GMP），提高所需产品的质量，并遵守药物评估中严格的验证、透明度和上市后监测标准[132,133]。为了满足监管和生产要求，人工智能可用于预测产品质量属性、产量和杂质、产品稳定性和聚集情况，并通过成本分析简化端到端生产。

5.2. 利用人工智能模拟加速 ORFV 生产

考虑到 ORFV 载体的生产，目前相关知识的匮乏是由于对其研究的时间相对较短。人工智能技术可以利用来自类似 MVA 优化研究的现有数据以及 ORFV 加工的现状，从而加速整个药物生产工艺的优化。人工智能可以对细胞或载体菌株库进行虚拟筛选，以确定最佳的细胞底物、载体菌株、培养基和加工模式，从而实现高生产率。因此，大量数据可供人工智能使用，以辅助其做出积极的决策[134]。

在纯化流程中，添加有益的添加剂至关重要，例如添加变性剂以防止聚集、提高载体稳定性，或添加核酸酶以提高 DNA 清除率[19,108,135]。因此，尽管已经开发出耐盐核酸酶，但它们也对处理系统提出了新的要求。人工智能是降低不确定性和风险的有效工具。例如，ORFV 载体的镁离子浓度，据报道，超过 2 mM 的 MgCl₂不利于其稳定性[90,136]。为了确保 DNA 清除，在高盐度条件下，耐盐核酸酶的使用需要更高的 MgCl₂浓度[19]，因此需要与高盐度工艺中的耐盐核酸酶竞争。此外，修饰核酸酶氨基酸序列的变化通常会导致分子特性的变化，例如等电点的移动[137]。因此，必须选择合适的后续分离方法来去除这些变化。在这些情况下，人工智能可以通过学习历史数据来支持这一过程，从而在问题升级之前发现问题。

6. 结论

高度减毒的痘病毒因其优异的安全性和较大的转基因容量而成为极具潜力的病毒载体。然而，实现规模化生产仍面临巨大挑战，因为高病毒滴度是成功治疗应用的必要条件。近年来，通过测试和设计新型细胞基质，例如支持高 MVA 滴度的禽类细胞系，特别是悬浮培养适应的 MVA-CR19 表型（该表型可在培养上清液中积累，便于下游加工），已取得了显著进展。化学成分明确的补料分批培养工艺通过诱导悬浮细胞聚集和提供高营养供应来促进 MVA 复制，例如灌注培养工艺可提供高达 1 × 10⁰ IU mL⁻¹的 MVA 滴度[106]。此外，还开发了一种用于 ORFV 的药用级工艺，在分批培养模式下可达到 6 × 10² IU mL⁻¹的滴度[19]。高滴度上游工艺具有更有利的产品与杂质比率，并且通过减少杂质负担，为 DSP 中的新方法提供了可能。

澄清步骤仍然是病毒损失最大的步骤，但可以通过使用非吸附性滤膜和裂解液作为进料来改善[19,20,25]。核酸酶处理和使用变性剂可以有效去除双链 DNA，每剂去除量可达 3-10 ng [20,24,109]。对于痘病毒纯化，硫酸纤维素 MA 结合后续的疏水相互作用色谱(HIC)有望有效地将 DNA 与产物分离[118]。然而，使用离子交换剂确实会共纯化带负电荷的 DNA[117]。使用非特异性吸附树脂（例如 SXC）不会导致步骤特异性产物损失[20]。当与微孔尺寸排阻色谱(mmSEC)联用时，据报道总产物收率高达 91%[24]。切向流过滤(TFF)已成功应用于孔径范围为 300 kDa 至 0.1 µm 的膜盒，用于浓缩和渗滤[22,25,27]。开发能够消除任何特定病毒结合的平台纯化工艺，将是提高整体工艺收率、减少杂质负担并促进生产药用级材料的一大进步。

7. 专家意见

MVA 上游工艺的改进，使其滴度达到 1 × 10⁰ IU mL⁻¹，提高了其经济可行性，使痘病毒疫苗的应用更加可行。尽管取得了这些进展，但目前仍缺乏经济、可扩展且符合制药标准的纯化策略来优化上游工艺，这阻碍了其在临床实践中的应用。考虑到成本，目前的生产工艺必须采用无菌操作。为了加速急需的传染病疫苗和癌症疫苗的临床试验，需要一个能够经济高效地提供高滴度痘病毒的稳健生产平台。

痘病毒纯化的关键挑战在于病毒颗粒易与宿主细胞染色质和其他颗粒物聚集。为克服这一挑战，在缓冲体系中添加温和的离液盐可最大限度地减少生产过程中的产品损失。此外，还需要进行核酸酶处理，以满足每剂残留宿主细胞 DNA 含量<10 ng且片段长度<200 bp的要求。耐盐核酸酶已应用于该工艺，并可通过切向流过滤(TFF)和结合色谱步骤去除。在超滤步骤中，还必须通过向监管机构提交加标实验来证明通过分离外源性物质清除病毒的效果。鉴于过滤器和树脂均有可扩展的药用级产品，本文概述了相关的技术和方法要求。监测残留杂质和产品质量的分析方法也已成熟，使得符合GMP规范的实施具有很高的可行性。为了实现经济高效的生产，应探索用于无菌过滤的膜设计方面的改进，以便在保持高痘病毒产量的同时去除细菌。

痘病毒生产研究的一个里程碑将是开发出一种能够提供令人满意的产品产量、缩短处理时间并在全球范围内提供价格合理的治疗性疫苗的工艺。人工智能有望通过优化宿主细胞感染、细胞内病毒扩增以及病毒从宿主细胞释放等过程来提高时空产量。此外，人工智能还可以在优化培养基以满足特定细胞需求方面发挥重要作用。然而，由于针对新发疾病开发痘病毒载体是一个持续的过程，因此无法为未来的研究设定明确的终点。病毒株、宿主或培养基的变化意味着平台工艺的局限性无法排除。未来，通过细胞系筛选和细胞工程，有望提高 ORFV 的产量，从而为下游纯化提供更优质的起始材料。对于溶瘤活性而言，ORFV 和 MVA 的治疗剂量预计需要比传染病疫苗更高的病毒滴度，经测试的滴度为每剂 10⁰-10¹ IU [2,3,25,61,138]。此类工艺可基于过滤技术，因为过滤技术不需要任何靶标特异性结合特性，因此当需要将工艺从模型病毒转移到单价或多价候选疫苗时，过滤技术是理想的平台。然而，基于过滤的纯化方法存在一些潜在风险，例如病毒聚集、膜批次间差异、膜污染以及对不同靶标的稳定性。 此外，还必须考虑根据 ICH Q7 活性药物成分良好生产规范和欧洲药品管理局 (EMA)/FDA 指南，主要基于过滤的工作流程中工艺验证的监管要求。

该领域一个极具前景的研究方向是通过连续生产强化工艺流程，这有望提高生产率并降低总体成本。在连续下游加工中，诸如单程切向流过滤 (TFF) 等新技术可用于最终浓缩步骤。据我们所知，迄今为止所有已发表的色谱步骤均以间歇或半连续模式进行。通过将模拟移动床色谱与结合特定产品的树脂或不结合产品的树脂（例如毫米级尺寸排阻色谱 (mmSEC)）相结合，可以进一步强化连续加工。将现有数据传输到人工智能模型进行工艺模拟，可以加速正在进行的优化工作。此外，它还有助于在符合良好生产规范 (GMP) 的环境中进行后续工艺转移和控制。

一个可行的未来里程碑是采用补料分批生产方式扩增痘病毒，并结合分批处理工艺，将其作为一种有前景的标准流程。分批生产可以降低整体工艺复杂性，并有助于 GMP 转移。在需要上游工艺高产率的疫情大流行情况下，可以扩大生产规模，或者循环运行多个分批反应器，为纯化工艺提供持续的原料供应。未来五年，我们预计对 ORFV 上游工艺的研究将更加深入，以提高产量。对于 ORFV 和 MVA，未来的工作重点将是通过连续生产来降低生产成本，从而开发出最先进的工艺。将这些生产工艺转移到符合 GMP 标准的环境中，将确保未来临床试验所需的疫苗供应。

文章亮点

  • 历史悠久的痘病毒、改良型安卡拉痘苗病毒和人畜共患的羊痘病毒都是安全有效的传染病和癌症候选疫苗。然而，由于治疗应用需要高病毒滴度，其生产过程面临诸多挑战；目前已在上游工艺中实施了有效的解决方案。

  • 随着新型疫苗在免疫学和药学领域的进步，生产工艺也必须同步发展，以确保疫苗在全球范围内的快速供应。上游工艺的最新进展虽然各不相同，但都体现在以下几个方面：(i) 人工设计的细胞系；(ii) 分离新型病毒表型，从而简化后续工艺步骤；(iii) 开发化学成分明确的培养基；(iv) 优化操作模式。

  • 纯化策略取决于上游工艺中的病毒滴度。对于低于疫苗剂量的产量，需要进行色谱捕获、浓缩和精制步骤。

  • 对于高于疫苗剂量的产量，基于过滤的纯化方法能够有效分离产品与关键的宿主细胞 DNA 杂质，从而带来潜在的经济优势。理想的产品杂质比是满足监管机构良好生产规范要求的关键因素。

  • 下一代痘病毒生产需要一个可扩展的平台工艺，以促进新型重组候选疫苗的转化。因此，过滤工艺可以通过避免任何靶向吸附过程，实现下游工艺的强化，从而使向连续生产的过渡成为可能。

全文：高减毒痘病毒作为病毒载体平台在药物生产方面的最新进展 — Full article: Recent advances for the pharmaceutical production of highly attenuated poxviruses as viral vector platforms

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