人类莱姆病疫苗：预防之路上的两大进步

1.1. 莱姆病

根据基因组序列， 伯氏疏螺旋体复合群被分为不同的基因种，目前至少有 20 个公认的成员[13]。其中，只有一部分（ 伯氏疏螺旋体狭义种(ss)、 阿氏疏螺旋体 、 加氏疏螺旋体 、 巴伐利亚疏螺旋体 、 梅奥尼疏螺旋体、斯氏疏螺旋体、比塞特疏螺旋体和路斯疏螺旋体 ） 被认为是人类病原体[13,14]。莱姆病的负担受硬蜱分布范围的影响，在北半球赤道以北的广大地区广泛传播，是这些地区最常见的媒介传播疾病[15-17]。在北美，莱姆病主要由肩胛硬蜱（I. scapularis） 传播，集中在美国东北部和中西部北部地区，近年来已蔓延至加拿大东南部[15,18]。太平洋沿岸部分地区也存在莱姆病，但其流行病学负担较小， 太平洋硬蜱（I. pacificus） 是该地区的既定传播媒介[15,18,19]。伯氏疏螺旋体（ B. burgdorferi ss，以下简称伯氏疏螺旋体）几乎是北美所有莱姆病病例的病原体，其次是梅奥氏疏螺旋体（ B. mayonii ），后者在中西部北部地区引起的病例数量微乎其微[15]。其他莱姆疏螺旋体基因型也存在于太平洋硬蜱（I. pacificus）中（例如，比塞氏疏螺旋体（ B. bissettiae） 、 加州疏螺旋体（ B. californiensis ））。然而，它们的致病潜力尚不明确，也没有确凿的证据表明这些基因种会导致人类出现显著水平的莱姆病[19,20]。在欧洲，莱姆病螺旋体由伊蚊传播。 蓖麻蜱（I. persulcatus）和莱姆病广泛分布于东部、西部、中部和北部地区。伯氏疏螺旋体（B. afzelii） 是欧洲病例的主要病原体，其余病例主要由伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi）、加氏疏螺旋体（ B. garinii） 和巴伐利亚疏螺旋体（B. bavariensis） 引起[21]。莱姆病也存在于亚洲，其主要传播媒介是全沟硬蜱 （I. persulcatus） 。据报道， 巴伐利亚疏螺旋体 、 加氏疏螺旋体和伯氏疏螺旋体在亚洲呈地方性流行；然而，这些基因种各自对疾病的贡献比例尚不清楚[22]。

1.2. 伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sl）的生活史和致病机制

硬蜱遵循三宿主生命周期。幼蜱孵化后，依次发育为若蜱和成蜱，每次蜕皮进入下一生命阶段前都需要吸食一次血液[23]。雌性成蜱在产卵前还会吸食一次血液[24]。伯氏疏螺旋体 （B. burgdorferi sl）通过吸食受感染的宿主动物（通常是小鼠或鸟类，取决于基因型）的血液而被硬蜱感染，并在此基础上，蜱虫的感染会持续到其所有后续生命阶段[23]。媒介研究表明，硬蜱不会将伯氏疏螺旋体 （B. burgdorferi sl）传播给其卵（与回归热螺旋体不同），因此，新孵化的幼蜱不携带该细菌[23]。莱姆病具有季节性，其发病率在很大程度上与硬蜱生命阶段的进程相关[25]。与若蜱相比，成蜱携带伯氏疏螺旋体 （B. burgdorferi sl）的比例更高，这是因为成蜱在经历不同生命阶段后，有更多机会叮咬过感染的动物。然而，若蜱体型较小、数量更多且难以发现，因此大多数莱姆病病例是由若蜱叮咬引起的[26,27]。相应地，莱姆病的流行高峰出现在春末夏初，此时若蜱最为活跃；而夏末秋初则会出现第二波较小的流行高峰，主要由成蜱引起[27,28]。

伯氏疏螺旋体 （B. burgdorferi sl）在蜱虫吸血过程中传播给易感脊椎动物宿主。吸血开始后，血液进入蜱虫体内，为螺旋体提供化学信号，启动一个基因程序，该程序下调蜱虫阶段基因，上调脊椎动物宿主生存所需的基因[29]。莱姆疏螺旋体穿透蜱虫中肠基底膜，随后通过血淋巴迁移，侵入唾液腺，最终沉积在叮咬部位[30]。这一协调过程通常至少需要 36 小时才能完成[31]。虽然中肠内充满螺旋体，但只有一小部分到达唾液腺，因此感染剂量非常低[32]。感染后几天到一个月内，通常会出现特征性的游走性红斑（EM），这是由于伯氏疏螺旋体从蜱虫叮咬部位沿皮肤放射状迁移所致[33]。随后，螺旋体从皮肤迁移出来，并通过血行播散转移至远端部位。转移至心脏可导致莱姆心肌炎，这是莱姆病的一种严重并发症[25]。莱姆伯氏疏螺旋体也可感染周围和中枢神经系统组织，导致莱姆神经疏螺旋体病（LNB）。早期 LNB 的常见表现包括疼痛性神经根病、淋巴细胞性脑膜炎和颅神经麻痹（面瘫）[34]。迁移至周围关节的关节腔会导致局部炎症，并可导致莱姆关节炎（LA）[35]。早期治疗通常可以治愈，然而，在相当一部分病例中，游走性红斑（EM）可能未被识别或根本不存在[28]。 游走性红斑可能隐藏在咬伤的解剖位置（ 例如 ，发际线下方、背部），或者在某些情况下，被较深的肤色所掩盖；在其他情况下，非特异性症状和/或非典型游走性红斑的表现可能被误诊为其他感染[36]。早期漏诊或治疗延误可能导致疾病后期出现更严重的后遗症。此外，控制良好的研究表明，5%～10%的莱姆病患者在接受治疗后会发展为治疗后莱姆病综合征，其特征是长期且常导致残疾的后遗症，包括疼痛、疲劳和认知功能障碍[37-40]。此外，在莱姆病患者中，治疗失败的比例为 10%或更低，这些患者持续出现对抗生素治疗无反应的关节炎症状[41,42]。该综合征被命名为感染后 LA，据推测是由于自身免疫过程或残留脱落的伯氏疏螺旋体 sl 肽聚糖引起的持续性炎症所致，治疗方案包括抗风湿药物和/或关节镜滑膜切除术[6,43,44]。

伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi sl）是专性寄生菌，从宿主体内获取大量重要的营养物质和生物分子[30]。因此，它们无法在节肢动物或动物宿主之外的自然环境中生存。它们不表达任何已知的毒素或荚膜多糖，并且擅长在动物宿主体内长期存活。莱姆病螺旋体之所以能够持续存在，部分原因是其外膜蛋白组的抗原异质性和对补体系统的拮抗作用，从而逃避了宿主免疫系统的清除[45]。莱姆病的临床表现被认为主要由伯氏疏螺旋体成分（例如肽聚糖、DNA 基因组、外膜脂质）的产生和脱落介导，这些成分是高度炎症性的病原体相关分子模式（PAMP），可被宿主的先天免疫系统识别[43]。然而，不同伯氏疏螺旋体基因型引起的临床表现存在显著差异。虽然所有人类致病基因型的伯氏疏螺旋体都可能引起红斑性红斑、心肌炎、淋巴结炎、淋巴结炎和全身症状，但它们在后期症状模式上存在差异，部分原因是其组织归巢偏好不同[25,46]。伯氏疏螺旋体更常分布于关节，因此更容易引起关节炎[47,48]。 加氏疏螺旋体和巴伐利亚疏螺旋体优先迁移至神经组织，因此更常引起神经疏螺旋体病[49]。 阿氏疏螺旋体偏好皮肤组织，可引起一种称为慢性萎缩性肢端皮炎（ACA）的皮肤疾病，该疾病通常在感染后期出现[49]。

2.1. 北美疾病发病率

在美国，每年约有 47.6 万例莱姆病病例得到诊断和治疗[52]。该病的发病率持续上升，且地理分布不断扩大，尤其是在中西部北部、东北部和大西洋中部各州，这些地区被认为是高发病率地区。根据监测定义，这些州每 10 万人中确诊病例超过 10 例，部分州的发病率甚至超过每 10 万人 100 例[28]。与高发病率州相邻的州，例如俄亥俄州、密歇根州和爱荷华州，病例数也在持续增加。1996 年至 2017 年间，莱姆病报告病例数增加了一倍以上，高发病率州和县的数量也有所增加，尽管在此期间莱姆病的病例定义有所修订[53]。这些增长是由于土地利用和气候变化等因素造成的，导致莱姆病伯氏疏螺旋体感染蜱虫种群的地理扩张以及人类活动模式的改变[54-56]。

加拿大人类莱姆病病例的发生率显著上升[57]。2009 年和 2010 年，加拿大每年记录约 144 例病例，而到 2024 年，这一数字飙升至 5239 例[57]。这一增长主要归因于肩胛硬蜱 （Ixodes scapularis） 向北扩张，尤其是在加拿大东南部，安大略省、魁北克省、曼尼托巴省和新斯科舍省最为显著。莱姆病报告病例的分布范围持续扩大，不列颠哥伦比亚省、新不伦瑞克省以及纽芬兰和拉布拉多省等省份也已报告发现携带伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi） 的蜱虫[57,58]，这凸显了加拿大各地莱姆病风险的不断扩大。

2.2 欧洲疾病发病率

欧洲各国的国家公共卫生监测系统每年报告约13.2万例病例，这些病例覆盖了高发地区的2.23亿人口[17]。监测报告的发病率最高的是斯洛文尼亚、爱沙尼亚、瑞士和立陶宛，其次是法国、波兰、德国和芬兰[59-61]。流行病学研究和监测也指出，捷克、斯洛伐克、比利时、荷兰和拉脱维亚的疾病负担相当沉重[16,62]。与北美类似，每个国家内部都存在区域性流行。欧洲普通人群的血清阳性率估计值显示，西欧人的血清阳性率最高（13.6%），其次是东欧人（11.1%）、北欧人（4.2%）和南欧人（3.9%）[63]。

2.3. 莱姆病的临床表现、危险因素和诊断趋势

目前鲜有研究能充分估算莱姆病不同临床表现的发病率或比例。监测系统通常报告的是病情较重的病例，因此无法全面反映疾病负担。尽管如此，游走性红斑（EM）仍是最常见的临床表现，约占 70%的病例；然而，这可能被低估了，因为病变往往未被识别或报告[64,65]。淋巴结肿大（LNB）约占莱姆病病例的 10%[51]。淋巴结炎（LA）在美国的报告频率高于欧洲，这可能是由于伯氏疏螺旋体（ B. burgdorferi） 在美国占主导地位，而伯氏疏螺旋体具有更强的致关节炎倾向。因此，在美国，5-9 岁儿童中淋巴结炎的诊断率达到 10%或更高[28]。一项在挪威、芬兰和波兰进行的研究估计，所有就诊的莱姆病病例中，约有 7%出现播散性表现（淋巴结肿大、淋巴结炎或关节炎）[66]。莱姆病心肌炎是一种相对罕见的表现，据估计，在美国和欧洲，分别有 1-2% 和 0.3-4.0% 的莱姆病患者发生莱姆病心肌炎[28,67-70]。

莱姆病的风险因素是多方面的，包括昆虫学方面的风险，例如居住在伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi sl）感染蜱虫密度高的地区，以及人类行为方面的风险，例如在田野、森林或住宅庭院休闲娱乐、园艺或从事农业、园林绿化和林业等户外工作。此外，个体风险行为可能因居住环境（城市、郊区或乡村）而异，这会影响蜱虫暴露和后续感染的可能性[71]。年龄也是一个重要的风险因素；在大多数国家，莱姆病病例的年龄分布呈双峰分布，高峰出现在 50-74 岁人群中，5-14 岁儿童中也有一个较小的高峰[25,50,72]。在美国和加拿大，男性在向监测系统报告的病例中所占比例较高，但欧洲的情况则有所不同[50,72]。在法国，女性在基层医疗中心的诊断率更高，而男性住院率更高[73]。德国女性报告的游走性红斑（EM）病例多于男性，尽管男性报告的莱姆病神经系统疾病（LNB）和淋巴结肿大（LA）病例多于女性[74]。美国报告的绝大多数病例为白人[28]。然而，最近一项总结莱姆病流行病学的综述指出，少数族裔成人和儿童比白人更容易出现莱姆病的播散性表现，而较少出现游走性红斑，这可能是由于在肤色较深的人群中皮疹难以被发现所致[75]。

3.1. 外表面蛋白 A

OspA 是一种 N 端脂化的外膜蛋白，由伯氏疏螺旋体 sl 线性质粒 54 编码。OspA 的表达对于维持伯氏疏螺旋体在蜱虫媒介体内的持续存在至关重要，它是最早在伯氏疏螺旋体中发现的主要螺旋体外膜蛋白之一 [81,106–108]。Barbour 等人最初描述 OspA 的报告中有一段富有远见的论述，敏锐地指出研究伯氏疏螺旋体的外表面蛋白质组是合理的，因为它很可能是与宿主初始相互作用的位点 [106]。事实上，OspA 作为疫苗抗原的潜力在几年后得到了证实：首先是 Schaible 等人的一项研究，该研究记录了用 OspA 单克隆抗体治疗的 SCID 小鼠对莱姆病具有保护作用 [109]；随后是 Fikrig 等人的一篇里程碑式论文。 [76] 的研究表明，用 OspA 进行免疫接种可以保护小鼠免受皮内接种培养的伯氏疏螺旋体感染[106]。因此，OspA 成为疫苗研发的重点。最初，人们认为 OspA 疫苗的保护机制发生在接种者体内。然而，随后发现，在螺旋体离开蜱虫的过程中， ospA 基因的表达会下调，并且在动物宿主感染的初期阶段，细菌不再表达 OspA[110,111]。对蜱虫自然传播途径的保护作用进行研究发现，抗 OspA 抗体可以阻断伯氏疏螺旋体从蜱虫的转移，从而防止蜱虫叮咬过程中的传播[112]。 这种不寻常的作用机制发生在蜱虫体内而非动物宿主体内，其依赖于循环血清中抗 OspA 抗体达到临界水平，从而在叮咬时中和蜱虫体内的细菌。在具有保护性水平的抗 OspA 抗体存在的情况下 ，伯氏疏螺旋体无法逃逸出蜱虫中肠，并且在高抗体浓度下会被杀死[107,112]。然而，清除蜱虫体内细菌所需的抗体水平高于阻止传播所需的水平。先前的研究表明，感染所需的伯氏疏螺旋体数量可能低至 10 个螺旋体[113]。中肠内细菌的完全清除并非阻止传播的必要条件，因为中肠内螺旋体数量的减少也可能导致剩余螺旋体数量过少，无法完成到达唾液腺的旅程并最终引起感染[114]。进一步的证据表明，抗 OspA 抗体必须在蜱叮咬吸血时就已存在，因为若抗体延迟至吸血第二天才出现，则无法阻止传播[107]。尽管这一结果已被广泛接受，但抗 OspA 抗体阻止传播的分子机制的具体细节尚未完全阐明。潜在的功能机制包括：(i) 通过宿主补体直接杀灭细菌[115]；(ii) 通过促进细菌进入蜱肠道上皮细胞间接杀灭细菌[116]；(iii) 阻止细菌与蜱肠道配体相互作用[77]；(iv) 细菌凝集[117]；或(v) 抑制蜱的运动能力[118]。

不同基因型的伯氏疏螺旋体（ B. burgdorferi sl）表达独特的 OspA 变体，最初根据抗体反应性将其区分为血清型（ST），而最近则根据氨基酸序列相似性将其分为计算机模拟类型（IST）[119]，目前已据此分类出至少 23 种不同的 OspA IST [120,121]。 伯氏疏螺旋体是北美主要的莱姆病螺旋体基因型，仅表达 OspA ST1。在欧洲，常见的流行基因型表达更广泛的 OspA 血清型。 阿氏疏螺旋体（B. afzelii） 菌株编码 ST2，加氏疏螺旋体 （B. garinii） 分离株编码多种 ST，主要包括 3/5/6/7/8，而欧洲巴伐利亚疏螺旋体（B. bavariensis） 分离株的特征是 ST4。

3.2. 第一代 OspA 疫苗

1995 年至 1998 年间，两种脂化 OspA ST1 疫苗在美国东北部成年受试者中分别进行了 3 期临床试验：一种是由史克必成公司（后被葛兰素史克[GSK]收购）开发的 LYMErix 疫苗[122]，另一种是由康诺特实验室（后被赛诺菲收购）开发的 Immulyme 疫苗[123]。每项研究持续两年，均采用相同的 0、1、12 个月接种方案，每次肌注 30 µg OspA。LYMErix 疫苗添加了氢氧化铝佐剂，而 Immulyme 疫苗除 N 端脂化外未添加其他佐剂，其 N 端脂化通过 Toll 样受体 1/2 信号通路提供固有佐剂活性[124]。疫苗接种时间均安排在当年蜱虫活动季节开始前。两种候选疫苗均显示出疗效，在接种 12 个月加强针后的第二年（LYMErix 疫苗有效率=76% [95% CI 58–86]；Immulyme 疫苗有效率=92% [95% CI 69–97]）的保护效果优于接种 0.1 个月初次免疫针后的第一季（LYMErix 疫苗有效率=49% [95% CI 15–69]；Immulyme 疫苗有效率=68% [95% CI 36–85]）。LYMErix 最终获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的许可，而 Immulyme 则未申请注册。LYMErix 于 1998 年获批上市，并于 2002 年停止销售，之后由生产商主动撤回[125]。第一种人类莱姆病疫苗的批准和随后的市场撤回的历史已在其他地方进行了详细的论述[125-129]，这里仅作简要提及。 在 LYMErix 疫苗获批上市前后，一份报告提出，OspA ST1 蛋白中一个 6 个氨基酸的基序与人类白细胞抗原因子 1 (hLFA-1) 中一个类似的序列之间存在假定的分子模拟，这可能是携带特定人类白细胞抗原 (HLA) 等位基因的遗传易感人群感染莱姆病后出现耐药性莱姆关节炎的机制[130]。美国食品药品监督管理局 (FDA) 在接种超过一百万剂疫苗后，对疫苗不良事件报告系统 (VAERS) 数据库进行了审查，发现 OspA 疫苗接种与关节炎发病率增加之间并无关联[131]。然而，公众的反应以及由此产生的对该疫苗的负面看法最终导致了 LYMErix 疫苗的撤市。大约十年后，原文章的​​作者之一发表了一篇回顾性综述，总结了随后积累的证据，这些证据驳斥了 OspA 免疫接种是导致关节炎发生的原因这一观点[132]。 LYMErix 从市场上撤下后，OspA 抗原仍然作为兽医用蛋白质莱姆疫苗的主要成分继续使用 [133]。

3.3. 新一代 OspA 疫苗

自 LYMErix 疫苗撤市以来的二十年间，莱姆病的年发病率和地理分布范围显著增加，而诸如检查蜱虫叮咬和使用驱虫剂等标准预防措施收效甚微[28,134]。鉴于对人类莱姆病疫苗的持续医疗需求以及 OspA 作为保护性抗原的验证，新的疫苗研发项目已经启动。新一代 OspA 候选疫苗的一项关键改进是扩大了价数，以覆盖欧洲存在的其他 OspA 血清型。由于原有的单价 ST1 制剂对异源欧洲伯氏疏螺旋体 （B. burgdorferi） sl 型的交叉保护不足[135]，因此这些血清型未被覆盖。此外，为了解决分子模拟的理论担忧，OspA ST1 中假定的 hLFA-1 表位已被替换为来自 ST2 的同源序列，该序列不具有 hLFA-1 序列同源性，这一策略此后已被用于新的 OspA 血清型 1 构建体 [136,137]。Baxter BioScience 报告开发了一种 OspA 疫苗制剂，该制剂包含三种嵌合 OspA 蛋白，每种蛋白均由一个包含一种血清型 N 端、中央结构域和近端 C 端区域（1 ^st C 端环）的全长 OspA 蛋白与另一种血清型（ST1/ST2、ST5/ST3、ST6/ST4）的远端 C 端结构域（2 ^nd 和 3 ^rd C 端环）组成 [138]。该候选疫苗已在 1/2 期临床试验中测试，结果表明其安全且耐受性良好，并能诱导产生针对所有 6 种血清型的 IgG 抗体 [139,140]。然而，截至本文撰写之时，该疫苗已停止进一步研发，也未公布任何正在进行或即将开展的研究。 赛诺菲巴斯德的研究人员报告了一种基于 OspA ST1-5 和 ST7 与铁蛋白融合的制剂的临床前开发，以及一种 mRNA 编码的 OspA 疫苗[141,142]。Intravacc 公司报告了一种 OspA ST1 与脑膜炎奈瑟菌 H 因子结合蛋白 N 端区域融合的临床前研究，该融合蛋白在脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡中表达[143]。截至本文撰写之时，Intravacc 公司和赛诺菲的候选疫苗均未宣布进入临床研究阶段的计划。最近，Moderna 公司启动了一项 I/II 期临床研究，评估由修饰 RNA 表达的 OspA 单价（ST1）和七价（ST1-7）制剂（NCT05975099）。

3.4. VLA15

从结构上看，OspA 主要由反平行 β 片组成，其特征在于：N 端结构域包含脂质膜锚定结构，形成中心蛋白质结构域的折叠状 β 片结构，以及由相对的 β 片构成的 C 端结构域，其中 α 螺旋覆盖开放的中心空腔，外表面有三个延伸的环状结构（图 1 ）。

鉴于 OspA 蛋白锚定于细菌外膜时的空间取向，其 C 端结构域为抗体与细胞结合的 OspA 提供了最易接近的表面。OspA 的三个 C 端环形成的构象表位是 LA-2 单克隆抗体的靶点，该抗体与保护性抗体滴度的产生相关，并被认为是评估 OspA 疫苗接种后抗体反应的金标准（图 1 ）[144,145]。因此，C 端结构域被认为包含 OspA 上的关键保护性表位。基于此，Koide 等人设计并初步验证了一种包含 OspA C 端一半的疫苗构建体，旨在将免疫反应集中于该区域 [146]。随后，这一概念被应用于 VLA15 的设计中。VLA15 最初由 Valneva（原 Intercell）开发，后与辉瑞合作，截至本文撰写之时，它是目前临床开发中最先进的莱姆病候选疫苗。与 Baxter 的 OspA 候选疫苗侧重于单个全长 OspA 蛋白（每个蛋白包含两种不同 OspA 血清型的片段）不同，VLA15 由三个 N 端脂化的融合蛋白组成，每个融合蛋白通过一个短的连接序列整合了来自两种不同 OspA 血清型（ST1-ST2、ST4-ST3、ST5-ST6）的完整 C 端结构域，从而覆盖 ST1-6（图 2 ）[147]。 由于缺少蛋白质的 N 端半部分，分离的 C 端片段不稳定，因此，通过基于结构的构建设计，在每个构建体中引入二硫键对以稳定其天然构象[146,147]。每个 C 端结构域均基于代表相应血清型的序列。为了提高蛋白质溶解度和生产产量，ST3 组分通过引入来自非 ST3 型巴氏杆菌（B. valaisiana） OspA 的片段[119]进行了进一步改造，以稳定蛋白质表面电荷和相关的静电相互作用[148]。此外，为了解决先前关于安全性的担忧，ST1 中与 hLFA-1 具有假定分子模拟性的序列[130]被移除，并替换为 ST2 中类似的 OspA 片段，如文献[136]所述。这三种脂化融合蛋白在大肠杆菌中表达为重组蛋白，并采用标准方法进行纯化。然后将纯化的蛋白质按等比例配制成药物产品，并添加氢氧化铝作为佐剂。

小鼠临床前研究发现，VLA15 免疫可诱导产生针对疫苗所含六种血清型的 IgG 抗体 [147,149]。此外，在小鼠中，无论是主动免疫 VLA15 还是被动转移 VLA15 诱导的小鼠免疫血清，在用携带伯氏疏螺旋体 (ST1)、 阿氏疏螺旋体 (ST2) 或巴伐利亚疏螺旋体 (ST4) 的硬蜱进行攻击前，均可获得显著的保护作用 [149]。在小鼠中，被动给予 VLA15 二期疫苗接种者的免疫血清，随后用携带伯氏疏螺旋体或阿氏疏螺旋体的蜱进行攻击，也证实了保护作用 [150]。在这些研究中，还观察到从蜱虫媒介中清除伯氏疏螺旋体 sl 螺旋体的方式与转移后小鼠体内循环抗 OspA IgG 的水平呈正比。