克氏锥虫慢性感染疫苗：进展、挑战和未来方向

2.1 疫苗平台

过去十年克氏锥虫疫苗研究的一个显著特点是所测试的疫苗平台、动物模型和实验设计的广泛性。近期的一些综述详细阐述了这些方面[19,21-24]，本文将对其进行简要更新。所测试的疫苗平台包括减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、核酸疫苗、细菌、病毒和藻类载体，靶向不同的寄生虫抗原，给药途径包括注射（主要为皮下注射）、鼻内或口服（表 1 ）。目前尚未对这些不同平台和给药途径下相同抗原的直接比较进行全面研究，因此，基于疫苗平台和免疫途径的免疫原性可能存在差异。与多次接种相同抗原制剂的同源疫苗相比，采用不同抗原制剂的异源初免-加强免疫策略可能具有优势，因为它能诱导更广泛的免疫反应。

大多数疫苗平台都基于寄生虫蛋白抗原，但如前所述[42]，目前评估的抗原种类有限。事实上，许多已评估的抗原属于寄生虫转唾液酸酶家族，该家族蛋白在感染过程中发挥关键作用，被认为是毒力因子[43-45]。转唾液酸酶的关键生物学功能、其庞大的基因拷贝数以及在不同寄生虫株系中的高度保守性，使其成为良好的候选疫苗[46]。

尽管如此，鉴定新的抗原或表位仍然具有重要意义，有助于找到最有效的抗原[47]。从这个意义上讲，融合蛋白[31]、多表位蛋白[48,49]或免疫肽组学筛选[50]是寻找最佳抗原以诱导针对多种寄生虫靶标的广泛免疫的有效策略。值得注意的是，非蛋白抗原，例如α-半乳糖糖表位，也可能是一种非常有效的候选疫苗，因为克氏锥虫表面高度糖基化，而α-半乳糖糖表位在人类中完全缺失。因此，用α-半乳糖糖缀合物免疫α-半乳糖缺陷小鼠可以有效预防实验性感染[40]（表 1 ）。

这些研究共同表明，免疫原性和疫苗效力似乎并不局限于特定的疫苗平台，这意味着任何疫苗平台都可用于后续研发。然而，不同类型的疫苗可能面临不同的监管问题，这会对临床开发的可行性产生重要影响，正如前文所述[24]。

2.2. 疫苗适应症

这些研究的第二个关键方面是，疫苗效力已在多种实验设计中得到评估，包括作为预防感染的疫苗或作为治疗感染宿主的疫苗。在这两种情况下，疫苗效力均针对急性感染和慢性感染进行了评估，并观察了寄生虫学和心脏方面的结局。例如，对未感染宿主进行免疫接种可以减轻感染的急性期，并显著降低寄生虫负荷以及心脏炎症和纤维化（表 1 ）。然而，由于大多数研究未能观察到完全免疫，因此这些模型中对慢性心脏病的长期预防效果尚不明确，持续存在的寄生虫可能重新激活。值得注意的是，使用减毒活疫苗接种可能实现了完全免疫，在接种疫苗后，尽管组织中 ​​锥虫 DNA 的 PCR 检测结果仍然呈阳性，但在接受免疫抑制的小鼠中未观察到寄生虫重新激活[25]。也对通过接种疫苗预防口腔感染进行了评估[35]，以及用表达克氏锥虫 Tc24 的微藻进行口服疫苗接种，发现对腹腔感染有部分保护作用[37,38]（表 1 ）。

另一方面，治疗性疫苗接种旨在通过调节宿主反应来清除正在进行的感染，从而阻止疾病进展。在急性期或慢性期对实验感染小鼠进行治疗性疫苗接种可以降低寄生虫负荷和心脏组织损伤，但同样，完全免疫可能难以实现（表 1 ）。有趣的是，在感染宿主的综合免疫治疗方案中，疫苗接种与药物治疗相结合，可能有助于减少药物剂量，从而降低不良反应，同时增强对寄生虫的控制[26-29]（表 1 ）。然而，药物和疫苗的最佳给药时间仍有待确定。

如前所述[51]，在妊娠期间接种克氏锥虫疫苗也可用于降低母体寄生虫负荷并预防先天性传播。例如，最近一项研究测试了在小鼠感染克氏锥虫并交配前进行预防性疫苗接种，以降低感染率并改善受感染母鼠的妊娠结局[52]。疫苗对母鼠心脏炎症、纤维化和坏死的保护作用在妊娠期间得以维持，并且疫苗接种预防了胎儿丢失，使受精时间、胎盘重量、胎盘效率和成熟胎儿数量恢复正常，表明妊娠结局得到改善（表 1 ）。

这些研究共同提出了一个问题： 克氏锥虫疫苗可能达到的目标是什么？这也就是所谓的目标产品概况（TPP），它概括了疫苗的适应症。显然，这并非一个新问题，此前已有相关讨论[18,20,22,23,53]。明确研究重点并制定清晰的疫苗研发决策标准至关重要，这有助于把握成功研发的机遇。

2.3. 疫苗的高级临床前评估

尽管上述研究主要基于小鼠模型，但一些候选疫苗已在犬类和非人灵长类动物模型中进行了测试，这些模型对于疫苗的进一步研发具有重要意义。事实上，犬类是克氏锥虫的主要家养宿主和储存库，增加了人类感染的风险[54-57]，因此，针对犬类感染的干预措施已被提议纳入恰加斯病防控策略[58]。感染犬类也会发展出与人类相似的临床疾病，其发病率和死亡率也与之相当[59-63]，因此，疫苗的研发将有助于改善伴侣犬和工作犬的兽医护理。

早期基于减毒克氏锥虫或兰氏锥虫株的疫苗研究表明，使用这些减毒活寄生虫进行预防性疫苗接种可能降低犬的感染率[64,65]，这为评估基于特定寄生虫抗原的疫苗铺平了道路。与小鼠模型类似，已在犬身上测试了多种疫苗配方，用于预防和治疗性疫苗接种，结果表明这些疫苗对实验性克氏锥虫感染至少具有部分疗效（表 2 ）。值得注意的是，首个基于重组 Tc24 和 TSA1 抗原的治疗性疫苗的随机现场试验，在宠物犬自然感染的情况下，也显示出令人鼓舞的结果：该疫苗安全，接种疫苗的犬只血液寄生虫数量减少，并且在至少 6 个月的随访期内未出现心脏病变[73]。综上所述，这些结果有力地支持了兽用疫苗的研发，该疫苗有望显著改善犬的健康。仅在美国，犬只数量估计就接近 9000 万只，而德克萨斯州或路易斯安那州等南部各州的克氏锥虫感染率约为 10%至 25% [61,62,77,78]。兽用疫苗的研发也将为人类疫苗的开发提供进一步的支持。从这个意义上讲，非人灵长类动物的研究也令人鼓舞（表 2 ）。事实上，使用基于相同 Tc24 和 TSA1 抗原的重组疫苗对未感染过克氏锥虫的恒河猴进行预防性免疫接种，被证实是安全的，并且能够诱导广泛的体液和细胞免疫反应 [75,76]。 值得注意的是，在实验感染后，用这些抗原的 DNA 疫苗制剂进行治疗性免疫接种，也能至少 7 个月防止心电图改变，这证明恒河猴的心脏功能可以得到保留 [74]，类似于上面提到的在狗身上观察到的情况，这对于治疗性疫苗来说是一个关键的结果，并为人类疫苗的临床开发提供了强有力的支持。

模型动物	疫苗	接种疫苗的目的	结果	参考
实验性感染	TRASP 融合蛋白和 DNA TS/ASP	预防性疫苗接种，6个月随访	心脏炎症、损伤和寄生虫负荷	[Citation31]
实验性感染	TcVac1 或 TcVac4 DNA	预防性疫苗接种，1 年随访	寄生虫血症、心脏炎症和损伤	[Citation66,Citation67]
实验性感染	Tc24 和 TSA1 DNA	预防性和治疗性疫苗接种，70天随访	寄生虫血症、心脏炎症、损伤和寄生虫负荷	[Citation68]
实验性感染	pBCSSP4 和 pBCSP DNA	预防性和治疗性疫苗接种，1 年随访	心脏功能（心电图、超声心动图）、心脏炎症	[Citation69–72]
自然感染	rTc24 和 rTSA1 蛋白	治疗性疫苗接种，自然感染，6个月随访	寄生虫血症、心脏功能（心电图）、免疫原性	[Citation73]
实验性感染	Tc24 和 TSA1 DNA	治疗性疫苗接种，7个月随访	安全性、心脏功能（心电图）	[Citation74]
	rTc24 和 rTSA1 蛋白	预防性疫苗接种	安全性、免疫原性	[Citation75,Citation76]

3.1 目标产品概况和临床开发

如上所述，指导恰加斯病疫苗进一步研发的关键问题在于其目标产品特性，因为每种适应症都面临着不同的挑战和研发机遇，尽管所有适应症都能带来一定的临床健康益处（图 1 ）。预防性疫苗的主要适应症是预防未感染过克氏锥虫的个体在通过媒介或口服途径接触后发生感染（图 1(A) ）。在这种情况下，理想的结果是实现完全免疫，并且完全不发展为有症状的慢性恰加斯病。然而，一个虽不理想但仍可接受的结果是，在不实现完全免疫的情况下，显著延缓心脏/消化系统疾病的进展，这可能更容易实现，并且仍然能够带来健康益处。事实上，尽管寄生虫会终生持续存在，但大多数克氏锥虫感染者并无症状，但由于缺乏生物标志物和已知的风险因素，目前仍无法预测这些无症状患者的疾病进展[79,80]。至关重要的是，此类疫苗的临床开发将极具挑战性，因为临床试验需要招募大量未感染过该病毒的志愿者，并对其进行多年随访以评估疫苗效力，即使在克氏锥虫感染高发地区也是如此 （图 1(A) ）。此外，目前评估克氏锥虫感染治愈的金标准是血清阴性化，而血清阴性化需要数年甚至数十年才能观察到，这凸显了寻找更早期治愈生物标志物的必要性[14,81-83]。 从这个意义上讲，针对母体感染以避免先天性感染和其他出生结局（图 1(C,D) ）的疫苗可能依赖于一些更容易测量的指标，例如母体寄生虫负荷或出生体重，正如之前所建议的[51]。然而，由于先天性传播仅发生在 5-10%的感染母亲妊娠中[84,85]，因此预防性疫苗的后期试验可能也需要较大的样本量。其他出生结局，例如生长发育或神经发育缺陷，也可能需要长期随访才能进行评估。

针对慢性疾病发展的治疗性疫苗可能受益于相对简化的临床开发路径（图 1(B )）。事实上，虽然最佳且可接受的结果与预防性疫苗相同，即分别实现完全免疫和无症状慢性疾病，或至少抑制寄生虫以延缓症状性慢性疾病的发生，但所需的感染患者群体规模要小得多，随访时间也可能更短。上文提及的在犬类和非人灵长类动物中开展的先进临床前研究[73,74]为在人体中开展类似试验的可行性提供了强有力的基础。

然而，预防性和治疗性疫苗在监测慢性恰加斯病进展方面也面临着一些共同的挑战。PCR 寄生虫学评估曾被广泛用于既往抗寄生虫药物的临床试验中，作为主要终点指标[86-89]，但显然不足以评估治疗效果，因为寄生虫负荷可能与心脏功能和临床获益不相关[17]。此外，慢性期寄生虫水平的变异性和 qPCR 的灵敏度也存在问题。虽然增加 PCR 检测次数可以提高灵敏度[90]，但这种方法可能难以应用于常规患者监测。因此，qPCR 阳性时可能是治疗失败的重要指标，但阴性时价值有限。在免疫抑制后未观察到活寄生虫再激活的情况下，PCR 检测到的寄生虫 DNA 在宿主组织中的长期存在（如减毒活疫苗评估中所观察到的[25]），进一步增加了寄生虫学评估的复杂性。虽然免疫抑制似乎仍然是发现宿主体内残留持续寄生虫的首选工具，但这种方法不能用于临床试验。

监测临床心脏病进展也极具挑战性，因为这是一个非常缓慢且受多种因素影响的过程，因此心脏功能评估可能需要使用多个参数，而这些参数难以整合为一个单一且简单的指标来评估疾病进展[5,91-93]。巴西心脏病学会和美国心脏协会推荐的患者分期（A、B、C 和 D 期）[94,95]非常有用，但这种宽泛的分期可能会掩盖疾病严重程度和进展中更细微的差异，而这些差异可能与疫苗/药物的评估相关[5]。值得注意的是，对实验感染的恒河猴进行治疗性疫苗接种，能够预防心电图改变长达 7 个月[74]。在自然感染克氏锥虫的犬只中也观察到了类似的现象，治疗性疫苗接种在 6 个月的随访期内阻止了心电图改变的进展[73]。这些研究表明，在非人灵长类动物和犬类中，可以在短时间内检测到心脏功能的微小变化，这对于缩短治疗性疫苗临床试验所需的随访时间至关重要（图 1 ）。尽管如此，早期心脏功能生物标志物和治愈试验对于促进疫苗的临床开发仍然至关重要。另一方面，由于致病机制和疾病进展机制的不确定性增加，评估疫苗对消化型恰加斯病的疗效将更具挑战性。

3.2 保护性免疫相关因素

为了更好地了解克氏锥虫感染如何导致无症状或有症状的慢性期，人们对哺乳动物宿主的免疫反应进行了广泛的研究，因为这有助于指导疫苗研发，使其能够模拟保护性免疫反应。这些研究表明，宿主与寄生虫之间的关系非常微妙，在感染的不同阶段，免疫系统与克氏锥虫之间存在多种复杂的相互作用。

在感染的最初几天， 克氏锥虫能够从入侵部位侵入巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞，但这些细胞无法完全激活，从而导致寄生虫早期复制。虽然适应性免疫反应逐渐发展，并且已启动的产生 IFNγ的 T 细胞开始控制克氏锥虫 ，但寄生虫的这种先发制人的复制使其能够在急性期持续存在、增殖和扩散[96,97]。尽管如此，人们普遍认为，需要一种高度平衡的适应性免疫反应，包括裂解性抗体、CD4⁰ T 细胞（包括 Th1、Th2 和 Th17 极化）以及细胞毒性 CD8¹ T 细胞反应，才能最大限度地清除寄生虫，同时减轻炎症，从而防止组织损伤。在小鼠感染期间，CD8² T 细胞反应的一个关键靶点是转唾液酸酶蛋白，这些蛋白包含多个免疫优势表位[98]，这进一步表明它们可能是良好的疫苗候选物。寄生虫清除也与多功能 T 细胞有关，这些 T 细胞能够产生 IFNγ、TNFα、IL-2、颗粒酶 B 和穿孔素，而不是单功能 T 细胞 [99,100]。然而，尽管宿主免疫反应强烈，但 T 细胞向感染灶（例如结肠）的募集不完全，以及 T 细胞耗竭最终限制了寄生虫的杀灭，导致其长期持续存在 [101–103]。

免疫反应促炎极化的弊端在于其与组织炎症和随后的纤维化相关，进而导致心脏损伤和慢性恰加斯病临床表现。因此，尽管这方面的研究较少，但调节过程也被认为在疾病进展中发挥作用。调节性 T 细胞（Tregs）和髓源性抑制细胞（MDSCs）均可通过多种相互作用来平衡先天性和适应性免疫过程，从而防止组织损伤[104,105]。事实上，虽然大多数旨在了解克氏锥虫感染慢性期的研究倾向于关注适应性免疫反应，但其与先天免疫的相互作用似乎仍然与疾病进展密切相关。例如，血小板和巨噬细胞可通过促进促炎环境发挥重要的免疫调节作用，血小板还可以进一步调节体内平衡和高凝状态，从而促进血栓形成[106]。慢性恰加斯病不同类型/严重程度患者的外周血单核细胞 (PBMC) 中，先天免疫受体（如 Toll 样受体 (TLR)）和与单核细胞和自然杀伤 (NK) 细胞反应相关的通路 [107,108] 以及血小板 [109] 的表达均发生改变，这可能反映了在急性感染期触发的先天免疫过程在慢性期持续激活，正如在小鼠中观察到的那样 [110]。对慢性感染的恒河猴 PBMC 进行转录组分析也观察到了类似的反应，提示先天免疫细胞发生了长期重编程，其与血小板、单核细胞和抗原呈递细胞等先天免疫细胞通路相关的基因表达谱存在差异 [111]。 这种现象与训练免疫高度相似，后者涉及通过表观遗传修饰对包括单核细胞、巨噬细胞或 NK 细胞在内的固有免疫细胞进行重编程，从而产生长期记忆并增强对后续刺激的反应[112]。值得注意的是，根据血液寄生虫负荷和心电图随时间的变化评估，寄生虫控制水平不同的猕猴在这些固有免疫过程中差异更大，而它们的抗体和 T 细胞适应性免疫库则高度相似[111,113]。固有免疫的差异也可能影响先天性感染新生儿的疾病进展[114]。

这些研究共同提供了一些关于疫苗效力相关因素的关键信息，表明需要广泛而平衡的免疫力，即先天免疫和适应性免疫的激活。因此，虽然针对单个 CD8 ⁺ 表位的疫苗已在小鼠中获得了针对克氏锥虫感染的保护作用[115]，但有效的疫苗可能需要靶向更广泛的表位/抗原，以产生平衡的 Th1/Th2/Th17 CD4 + 反应和强烈的 CD8 + T 细胞激活。此外，疫苗需要调节先天免疫，正如之前用兰氏锥虫 [116,117]或克氏锥虫减毒活疫苗所表明的那样，后者的效力部分依赖于具有记忆样特征的 NK 细胞[118]。

因此，值得注意的是，上述基于 Tc24 和 TSA1 抗原的主要候选疫苗之一，能够诱导未感染过锥虫的恒河猴体内多种 B 细胞和 T 细胞克隆扩增[76]，并且在体外对巨噬细胞具有免疫调节作用，增强 NO 和细胞因子的产生[119]。该疫苗可能同时靶向适应性免疫和固有免疫，这一点最近在一项针对犬类自然感染克氏锥虫的治疗性疫苗的现场试验中得到了证实。事实上，在慢性感染犬中接种治疗性疫苗，通过显著扩增独特的 T 细胞克隆并重编程固有免疫，改变了正在进行的免疫反应，从而有效清除寄生虫并保护心脏功能[73]。

3.3. 克氏锥虫寄生虫多样性

无论适应症如何，恰加斯病疫苗的一个重要方面是其对美洲流行的多种克氏锥虫（T. cruzi）毒株的有效性。事实上，克氏锥虫在其七个主要谱系或离散分型单元（DTU）中表现出广泛的遗传多样性，这些谱系或 DTU 分别标记为 TcI 至 TcVI 和 TcBat [120,121]。因此，疫苗抗原应在不同寄生虫毒株中高度保守，一些主要抗原如 TS、TSA1 或 Tc24 就符合这一条件 [46,122,123]。α-半乳糖苷酶也存在于多种（如果不是全部） 克氏锥虫 DTU 中，尽管不同毒株的含量可能有所不同 [124,125]。然而，疫苗的有效性可能因实验感染中使用的寄生虫毒株而异 [126]。此外，对于转唾液酸酶家族的抗原，这个极其庞大的家族（约 1400 个拷贝）成员之间的交叉反应程度尚不清楚，它们的差异表达谱 [43] 也可能使免疫逃逸。

长期以来，人们一直在探索寄生虫 DTU、临床特征和患者疾病进展之间的关联，但收效甚微[121,127–130]。尽管如此，BENEFIT 试验中患者的临床结局存在地域差异，这表明患者特征和/或寄生虫毒株多样性的差异可能导致了这些差异[5]。进一步的研究发现，即使仅检测到每位患者的主要 DTU，且仅有少数患者存在多种 DTU 的混合感染，这些患者的细胞因子谱仍会根据其寄生虫 DTU 的不同而有所差异[131]。有趣的是，基于对负鼠复杂混合感染的初步研究[132]，基因分型方法的改进使得人们能够识别哺乳动物宿主（包括人类）以及锥蝽媒介中常见的多种感染，这种感染被提议称为“cruziome”[7]。多种寄生虫株/DTU 混合物的感染预计会对宿主反应和疾病进展产生重要影响，这已在小鼠单株或多株感染实验[133-137]和株系共培养实验[138]中得到证实，相关综述见前文[7]。事实上，对自然感染多种 DTU 的恒河猴进行随访发现，寄生虫学和心电图参数的差异与克鲁兹虫群的组成相关[139]。宿主外周血单核细胞（PBMC）的转录组反应和免疫特征也与克鲁兹虫群相关，克鲁兹虫群多样性更高的宿主表现出更强的保护性反应[111]。 这些数据构建了一个模型，该模型表明寄生虫多样性是恰加斯病进展的关键决定因素。感染了广泛且多样化的克氏锥虫（多种毒株/DTU）的宿主能够更好地控制寄生虫，而感染的克氏锥虫种类有限（少数毒株/DTU）的宿主则病情进展更快[139]。该模型表明，使用实验感染评估疫苗存在显著局限性，因为只能探索有限数量的毒株和毒株组合。因此，在自然感染（包含多种毒株和毒株混合物）的背景下评估疫苗也至关重要。例如，最近一项针对犬的治疗性疫苗现场试验就包含了多种 DTU 的感染，包括 TcI、TcII、TcIV、TcV 和 TcVI 及其不同比例的混合物，尽管 TcI 占主导地位[73]。有趣的是，与仅感染 TcI 的犬相比，感染混合 DTU 的犬在治疗后血液中 T. cruzi PCR 检测呈阴性的比例更高，这表明治疗性疫苗对多种 cruziome 的疗效可能更高，正如预测的那样[139]。因此，这些结果对于在 T. cruzi 遗传变异性背景下具有广泛疗效的治疗性疫苗来说充满希望，后续研究应扩展并证实这些观察结果。此外，在未来针对 T. cruzi 的疫苗临床开发工作中，考虑不同地理区域和患者群体中 cruziome 的变异性对于可靠地评估疫苗疗效至关重要。