疫苗诱导抗体对马尔堡病毒具有强效中和作用

马尔堡病毒（MARV）属于丝状病毒科，可引起马尔堡病毒病（MVD），其特征是出血热，病死率在 24%至 88%之间 ^1,2,12 。近年来，多个非洲国家爆发了 MARV 疫情，包括 2022 年的加纳、2023 年的赤道几内亚、2024 年的卢旺达以及 2023 年和 2025 年的坦桑尼亚（ ^参考文献 8,13,14,15,16 ）。尽管近期疫情已得到控制，但仍可能发生更大规模的 MARV 疫情，类似于 2013 年至 2016 年西非爆发的埃博拉病毒（EBOV）疫情，该疫情导致超过 28,600 人感染，11,325 人死亡 17,18 。马尔堡病毒（MARV）的反复和频繁溢出凸显了获得许可的疫苗和治疗药物的必要性，而目前这些药物尚不可用。相比之下，针对埃博拉病毒，已开发并批准了多种应对措施，包括疫苗 Ervebo（rVSV-ZEBOV）和 Zabdeno/Mvabea（Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo），以及单克隆抗体治疗药物 mAb114（Ebanga）和 REGN-EB3 鸡尾酒疗法（Inmazeb）。所有这些治疗药物都为成功开发丝状病毒应对措施提供了概念验证 19 , 20 , 21 , 22 。

针对马尔堡病毒（MARV）的疫苗和单克隆抗体正在研发中，其靶向病毒糖蛋白（GP），因为有研究表明，针对 GP 的抗体是抵御马尔堡病毒病（MVD）的主要保护因素 ³ 。MARV GP 是一种锚定在病毒膜上的同源三聚体蛋白，负责识别宿主受体 NPC1，并随后发生膜融合，最终导致病毒进入细胞 ^23,24 。在病毒形态发生过程中，MARV GP 经弗林蛋白酶水解，产生 GP1 和 GP2 亚基，这两个亚基通过二硫键共价连接 ^10,11,25 。GP1 包含三个结构域：核心结构域、糖基化帽结构域和黏蛋白样结构域。GP1 核心结构域包含受体结合位点（RBS），该位点受到高度糖基化的糖基化帽结构域和黏蛋白样结构域的保护，免受中和抗体的攻击 10,23,26,27 。 与埃博拉病毒（EBOV）或苏丹病毒（SUDV）的糖蛋白（GP）不同，马尔堡病毒（MARV）的 GP 尚未观察到有序的糖基化帽，这表明 MARV GP 的核糖体结合位点（RBS）可能比 EBOV 和 SUDV 的 GP 更暴露 10 , 11 , 27 , 28 。GP2 也由三个结构域组成：翼状结构域、核心结构域和跨膜结构域。GP2 核心结构域是促进病毒膜和宿主膜融合的融合机制 29 , 30 , 31 。翼状结构域是马尔堡病毒属特有的，它环绕 GP 的赤道部分，据推测，这种结构域可以限制中和抗体的识别 11 。

多种马尔堡病毒（MARV）试验性疫苗已进入 I 期或 II 期临床试验，其中一种疫苗 cAd3-Marburg 已于 2024 年在卢旺达爆发的 MARV 疫情中使用（参考文献 ^{3、4、5、6、7、8 ） 。 这些疫苗要么}在病毒载体上展示 MARV 糖蛋白（GP），要么直接编码 MARV GP。这些疫苗可能受益于鉴定和引入能够提高 GP 表达和融合前稳定性的突变，类似于 SARS-CoV-2 和呼吸道合胞病毒疫苗中引入的稳定突变 ^32,33 。目前仅发现一种能够促进 MARV GP 胞外结构域三聚体形成的稳定突变 ^{34 。相比之下，埃博拉病毒（EBOV）和苏丹病毒（SUDV）的 GP 已发现多种稳定突变，这表明 MARV GP 的融合前状态可能还有进一步优化的空间 34,35 。}

从马尔堡病毒（MARV）感染康复患者和接种过 GP 蛋白的动物体内分离出了靶向多个 MARV 糖蛋白（GP）结构域的单克隆抗体 ^9,36,37,38 。 然而，只有靶向核糖体结合位点（RBS）的抗体对 MARV 具有可检测的、尽管较弱的中和活性 ⁹ 。其中一些靶向 RBS 的抗体在动物模型中显示出保护效力，其中 MR191 是研究性治疗性单克隆抗体 MBP01 的前体（参考文献 9,39,40 ）。鉴于包括 MR191 在内的靶向 RBS 的抗体的中和效力会因高度可变的糖基化帽的单个突变而降低 9 ，因此，抗体混合物可能更能抵抗病毒的进化。

我们旨在鉴定马尔堡病毒（MARV）糖蛋白（GP）稳定突变，以开发一种免疫原，从而后续发现能够有效中和 MARV 的疫苗诱导抗体。我们在 GP2 核心结构域的七肽重复序列 1-C（HR1 _C ）中鉴定出两个突变，这两个突变能够提高融合前胞外结构域三聚体的表达、热稳定性和免疫原性，同时保持其天然的融合前结构和抗原性。用融合前稳定的 MARV GP 胞外结构域三聚体免疫人源化转基因小鼠，成功分离出一种高效中和抗体，命名为 MARV16，该抗体靶向跨越 GP1 和 GP2 亚基的融合前 GP 表位。我们进一步证明，MARV16 能够有效中和历史和现代 MARV 变种以及相关的拉文病毒（RAVV）和德宏病毒（DEHV）。我们还发现，在豚鼠暴露于 MARV 后接种 MARV16，可以保护其免受马尔堡病毒病（MVD）的侵害。最后，我们证明 MARV16 可以与 RBS 靶向抗体同时与 MARV GP 结合，从而为开发 MVD 的治疗性抗体混合物提供了途径。

为了制备可溶性融合前 MARV GP 胞外结构域三聚体，我们首先设计了一个缺失黏蛋白样结构域（氨基酸残基 257-425）和跨膜结构域（氨基酸残基 638-681）的 MARV GP 构建体（图 1a ）。之所以从构建体中省略黏蛋白样结构域，是因为靶向该结构域的抗体不太可能具有中和作用 ^41,42 。此外，我们还引入了三个先前报道的突变：W439A、F445G 和 F447N，这些突变可增强弗林蛋白酶对前体 GP 的切割 ^{10 ；以及 H589I 突变，该突变可在缺乏外源三聚化结构域的情况下促进单分散三聚体的形成 34 。将该构建体（命名为 MARV GPΔMuc _WT） 与弗林蛋白酶共表达，可产生单分散的三聚体（图 1b ），这可通过负染电镜观察到。与 MR191 的结合（图 1c ）证实了我们构建的 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域的正确折叠和抗原性，我们将其用于后续的抗体筛选实验。}

a ，MARV GP 结构域组织及 MARV GPΔMuc 胞外结构域构建体中包含的突变示意图。CD，胞质结构域；FCS，弗林蛋白酶切割位点；GC，糖帽；MLD，黏蛋白样结构域；TM，跨膜结构域。SP，信号肽。b ， MARV GPΔMuc 构建体的负染电镜照片。比例尺，50 nm。每个胞外结构域的四个生物学重复样本均采集了五张电镜照片。c，通过生物发光成像（BLI）评估 MARV GPΔMuc 胞外结构域与固定化 MR191 IgG 的结合情况。d ， RAVV GP（蛋白质数据库（PDB）标识符： 6BP2 ）的带状图，突出显示了 GP2 _HR1c 中发生突变的残基。GP1，紫色；GP2，金色；N-连接糖，浅蓝色表面。 图 e – g 分别展示了从 Expi293 细胞中纯化的 MARV GPΔMuc _WT 和 MARV GPΔMuc 突变体的重组生产产量 ( e )、尺寸排阻色谱图 ( f ) 和差示扫描荧光分析 ( g )。相对于 MARV GPΔMuc _{WT 的}产量倍数显示在图 ( e ) 上方。柱状图表示四个生物学重复的平均产量 ± 标准差。mAU，毫吸光度单位。图 g 中的数据以荧光强度 ( dF ) 对温度 ( dT ) 的一阶负导数表示，MARV GPΔMuc _WT 和 MARV GPΔMuc _PV 的 Tm _值用虚线垂直线标出。图 c 、 f 和 g 中的数据来自一个生物学重复，并代表了其他三个生物学重复的结果。每个生物学重复均进行了六次技术重复，并在图 g 中取平均值。 h ，MARV GPΔMuc 胞外结构域在 BALB/c 小鼠中免疫原性研究方案（每组 n =10；0.1 µg MARV GPΔMuc _WT 组中有 1 只动物的第二次采血血清未能收集）。i 、 j ，分别表示 MARV GPΔMuc _PV 血清结合滴度（ i ）和针对 MARV/Musoke GP 假型 VSV 的中和滴度（ j ），以两次生物学重复实验（每次实验均进行技术重复）的平均 ED _{50 （半数最大有效稀释度）或 ID 50 （半数最大抑制稀释度）值表示，且均使用不同批次的蛋白或假病毒。检测限（ED 50 为 33 或 ID 50 为 10）用虚线表示。黑线表示几何平均滴度。采用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 事后检验对接受相同剂量 MARV GPΔMuc WT 或 MARV GPΔMuc PV 的组进行统计评估。}

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与其他 I 类融合蛋白类似，马尔堡病毒（MARV）GP 蛋白在与 GP2 HR1 _C 区（氨基酸残基 577-583）融合时，会发生大规模的结构重排，融合前呈环状结构，融合后则形成螺旋结构 ^{10 , 11 , 29 , 30} 。先前的研究已发现埃博拉病毒（EBOV）GP2 HR1 _C 区的突变能够稳定融合前构象，并提高 GP 蛋白的表达量，无论是否添加三聚化结构域 ³⁴ , 35 。然而，将 EBOV GP 的 T578P 稳定突变移植到 MARV GP 中并未产生相同的表达增强效果 34 。继我们之前成功稳定了朗亚病毒 G 蛋白和 EB 病毒 gB 蛋白 43,44 之后，我们利用 ProteinMPNN 45 ，以先前确定的 RAVV GP 结构 11 为输入模型，辅助鉴定了能够稳定 MARV GP HR1 _C 的突变。我们对鉴定出的突变进行了目视检查，并将那些与融合前构象相符的突变整合到 MARV GPΔMuc 胞外结构域中（图 1a,d ）。与我们最初的 MARV GPΔMuc _WT 相比，单独替换 T582P 和 F583V 分别使表达产量提高了 1.6 倍和 1.7 倍，而当两者结合使用时，表达产量提高了 2.5 倍（图 1e ）。通过尺寸排阻色谱分析，所有三个设计的 MARV GPΔMuc 胞外结构域构建体均以单分散物种的形式洗脱，并且与 MARV GPΔMuc _WT 具有相似的保留体积（图 1f ）。 负染样品的电镜成像证实了构建体的单分散性（图 1b ）。此外，MR191 结合能力的保留（图 1c ）表明，引入 HR1c 突变并未改变 MARV GP 的构象完整性或抗原性。T582P（平均熔解温度( T m ) ± 标准差为 69.7 ± 0.2 °C）和 F583V（ T m 为 71.2 ± 0.1 °C）突变均提高了 MARV GPΔMuc 的热稳定性， T m 分别提高了 0.9 °C 和 2.4 °C。 T582P/F583V 双突变体（命名为 MARV GPΔMuc PV ）的熔解温度比原始 MARV GPΔMuc WT 高 2.6 °C（ T m 为 71.4 ± 0.2 °C，而 WT 为 68.8 ± 0.3 °C），这表明突变体表现出更好的融合前状态稳定性（图 1g ）。

接下来，我们通过免疫 BALB/c 小鼠（每组 n =10）来评估稳定化 MARV GP 胞外结构域的免疫原性。每组小鼠间隔 4 周接种三次 0.1、1 或 10 µg 的 MARV GPΔMuc _WT 或 MARV GPΔMuc _PV 胞外结构域，佐剂为 Addavax（图 1h ）。MARV GPΔMuc _WT 和 MARV GPΔMuc _PV 胞外结构域在两次接种后均诱导了强效的血清结合滴度，几何平均滴度（GMT）范围为 3.9 × ^10³ 至 3.7 × ^10⁴ （图 1i 和扩展数据图 1 ）。接种三剂后，用 MARV GPΔMuc _PV 胞外结构域免疫的小鼠血清结合滴度（0.1、1 和 10 µg 剂量下的几何平均滴度分别为 2.1 × ^10⁴ 、1.2 × ^10⁵ 和 2.2 × ^10⁵ ）比接种 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域免疫的小鼠高 1.9 至 4.0 倍（0.1、1 和 10 µg 剂量下的几何平均滴度分别为 1.1 × ^10⁴ 、5.0 × ^10⁴ 和 5.4 × ^10⁴ ）。大多数接种 1 或 10 µg MARV GPΔMuc _WT 或 MARV GPΔMuc _PV 胞外结构域的小鼠在接种三剂后均检测到血清中和抗体滴度（图 1j 和扩展数据图 1 ）。用 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域免疫的小鼠血清中和抗体滴度相似（0.1、1 和 10 µg 的 GMT 分别为 21、84 和 58），用 MARV GPΔMuc _{PV 胞}外结构域免疫的小鼠血清中和抗体滴度相似（0.1、1 和 10 µg 的 GMT 分别为 28、57 和 87）。 这些数据表明，MARV GPΔMuc _PV 胞外结构域比 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域具有更强的免疫原性，是一种很有前景的候选疫苗，尤其是在目前的 MARV 疫苗诱导的中和抗体水平很低的情况下 ^3,7,46 。此外，将稳定的 GP 多聚化到纳米颗粒上 47,48,49 或将稳定的 GP 作为 mRNA 疫苗递送 42,50 等策略可能有助于诱导更强的中和抗体反应。

迄今为止，所有已鉴定的靶向 MARV GP 的单克隆抗体对 MARV GP 假病毒均无或仅有微弱的中和效力（半数抑制浓度 ( _IC50 ) 为 3E1 µg ^ml⁻¹ ），而对真正的 MARV 病毒的活性则更弱，甚至没有活性（ _IC50 为 3E100 µg ^ml⁻¹ ） ^9,36,37,38 。 为了鉴定有效的 MARV 中和抗体，我们使用了 Alloy ATX 转基因小鼠，该小鼠具有编码重链和 λ (ATX-GL) 或 κ (ATX-GK) 轻链的人类免疫球蛋白基因位点。两只 ATX-GL 小鼠和两只 ATX-GK 小鼠分别接种了 MARV GPΔMuc _WT ，共接种三剂（图 2a ）。小鼠在末次加强免疫后 6 天处死，采集外周血、脾脏和淋巴结，并新鲜分离细胞。采用荧光辅助细胞分选法（见扩展数据图 2 ）筛选 MARV GPΔMuc WT 特异性记忆 B 细胞，随后通过逆转录 PCR（RT-PCR）扩增可变区（VH 和 VL）序列。

a ，用于发现 MARV GP 靶向单克隆抗体的免疫方案示意图（ n = 4 只小鼠） 。b ，MARV16、MR78 和 MR191 对 MARV/Musoke GP 假型 VSV 的剂量-反应中和曲线。数据为三次技术重复的平均值 ± 标准误差。数据代表 3-5 次额外的生物学重复。c ， MARV16、MR78、MR191 和 MERS-CoV 抗体 4C2 对真实 MARV/Musoke 的中和效力。数据点反映了使用不同批次 IgG 的两个生物学重复获得的 PRNT ₅₀ 值。黑线表示 PRNT _{50 的}平均值 。d ，使用生物发光成像 (BLI) 测量 MARV16 Fab 与固定化 MARV GPΔMuc _WT 的结合亲和力。 e 、 f ，通过生物发光成像（BLI）评估 MARV16、MR78 和 MR191 IgG（ e ）或 Fab（ f ）与固定化 MARV GPΔMuc _{WT 的}结合 。g ，使用 BLI 在不同 pH 值下评估 MARV16 IgG 与固定化 MARV GPΔMuc _{WT 的}结合 。h ，示意图突出显示了 MARV 变体相对于 MARV/Musoke 的 GP 突变（黑色竖线）。残基编号对应于 MARV/Musoke GP。i ， MARV16、MR78 和 MR191 对用所示 MARV GP 假型化的 VSV 的中和效力 。j ，使用与右侧所示的 MARV/Musoke GP 具有序列同一性的相关丝状病毒 GP 的氨基酸序列构建的系统发育树。 k ，MARV16、MR78、MR191 和 EBOV-515 对经指定丝状病毒 GP 假型化的 VSV 的中和效力。i 和 k 中的数据为使用不同批次的 IgG 和假病毒，在至少两个生物学重复实验（每个生物学重复实验均进行三次技术重复）中获得的平均 _IC50 值。 l – o ，MARV GPΔMuc _WT ，EBOV GPΔMuc，SUDV GPΔMuc，以及经嗜热菌蛋白酶切割的 EBOV GPΔMuc 或 SUDV GPΔMuc 与固定化 EBOV-515 ( l )、MR191 ( m )、MR78 ( n ) 或 MARV16 ( o ) IgG 的结合情况，通过生物发光成像 (BLI) 进行评估。d – g 和 l – o 中的数据反映了一个生物学重复，并代表了使用不同批次蛋白质的两个生物学重复的结果。

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我们回收了 10 种与 MARV GPΔMuc _WT 结合的抗体（半数最大有效浓度 (EC ₅₀ ) 为 3.4–10.4 ng ml ^–1 ）（扩展数据表 1 和扩展数据图 2 ），其中一种抗体，命名为 MARV16，能有效中和用疫苗匹配的 MARV/Musoke GP 假型化的水疱性口炎病毒 (VSV)（IC ₅₀ 为 36.4 ng ml ⁻¹ ）（扩展数据图 2 ）。使用 MARV/Musoke GP VSV 假病毒进行并排测定，MARV16 的效力分别是先前报道的靶向 RBS 的中和抗体 ^MR78 （ _IC50 为 1,520 ng ^ml⁻¹ ）和 MR191（ _IC50 为 1,407 ng ^ml⁻¹ ）的 42 倍和 39 倍（图 2b ）。此外，MARV16 能中和真正的 MARV/Musoke（50% 噬斑减少中和试验 ( _PRNT₅₀ ) 为 2.2 µg ^ml⁻¹ ），而未检测到 MR78 或 MR191 介导的中和作用（ _PRNT₅₀ 为 3E100 µg ^ml⁻¹， 对应于该检测方法的检测限）（图 2c 和扩展数据图 2 ）。这些结果证实 MARV16 是同类最佳的 MARV 中和抗体。

我们利用生物层干涉法 (BLI) 评估了 MARV16 抗原结合片段 (Fab) 与固定化 MARV GPΔMuc _{WT 的}结合动力学和亲和力。结果显示，二者结合非常强，亲和力达到纳摩尔级（解离常数 ( K<_sub​​>d ) 为 1.35 nM）（图 2d 和扩展数据表 2 ）。此外，无论以 IgG 还是 Fab 形式存在，MARV16 与 MARV GPΔMuc _WT 的结合强度均高于 MR78 和 MR191（图 2e,f ）。鉴于 MARV 通过与内体膜融合进入靶细胞，而内体膜的低 pH 值诱导了这一过程 ⁵¹ ，我们评估了 pH 值对 MARV GPΔMuc _WT 与这三种抗体结合的影响。在所有四个测试的 pH 值下，MARV16 与 MARV GPΔMuc _{WT 的}结合亲和力均相当（图 2g ）。相比之下，MR78 和 MR191 的结合在 pH 7.4、6.5 和 5.5 时未发生改变，但在 pH 4.5 时增强（扩展数据图 3 ）。我们认为这些结果可能反映了 RBS 在较低 pH 值下可及性的增加。

接下来，我们使用经相应 MARV 糖蛋白（GP）假型化的水痘-病毒（VSV）评估了 MARV16 对七株历史和当代 MARV 分离株的中和广度。这些分离株与疫苗株（MARV/Musoke）在氨基酸水平上存在 6.3%–8.7% 的差异（图 2h ），其中大多数替换位于糖基帽或黏蛋白样结构域。MARV16 能有效中和所有七株与疫苗株不匹配的 MARV 分离株， _IC50 值范围为 151 至 310 ng ^ml⁻¹ （图 2i 和扩展数据图 4 ），并且在并排评估中，其对所有这些 MARV 分离株的中和效果均显著优于 MR78 和 MR191。

对 MARV16 介导的丝状病毒科中和广度的评估表明，MARV16 能有效抑制 RAVV 和 DEHV 的 VSV 假病毒，但对 Měnglà病毒（MLAV）、EBOV 或 SUDV 的 VSV 假病毒无抑制作用（图 2j、k 和扩展数据图 4 ）。先前的研究表明，包括 MR78 和 MR191 在内的 RBS 靶向抗体能够识别所有丝状病毒糖蛋白共有的表位，但由于糖帽介导的掩蔽作用，它们无法中和埃博拉病毒 ^9,10 。为了确定 MARV16 是否同样识别隐蔽的泛丝状病毒表位，我们评估了 MARV16 IgG 是否能结合埃博拉病毒 (EBOV) 和苏丹病毒 (SUDV) GPΔMuc 的未切割形式和热溶素切割形式（即去除糖基帽） ¹⁰ ，并使用生物发光成像 (BLI) 将其与 EBOV-515、MR78 和 MR191 进行比较。 埃博拉病毒 GP2 靶向抗体 EBOV-515 能结合未切割和切割后的 EBOV 和 SUDV GPΔMuc，但不能结合 MARV GPΔMuc _WT （图 2l ）。MR78 和 MR191 能结合 MARV GPΔMuc _WT 以及切割后的 EBOV 和 SUDV GPΔMuc，但不能结合未切割的 EBOV 或 SUDV GPΔMuc（图 2m,n ）。 MARV16 能与 MARV GPΔMuc _WT 结合，但不能与 EBOV 或 SUDV GPΔMuc 结合，无论其是否被切割。这一发现表明 MARV16 与埃博拉病毒属的糖蛋白没有交叉反应，这很可能是由于它们之间存在广泛的遗传差异（图 2j,o ）。

为了解 MARV16 有效中和 MARV 的分子机制，我们利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）对与 MARV16 Fab 结合的 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域进行了表征，并解析了其 2.6 Å分辨率的结构（扩展数据表 3 和扩展数据图 5 ）。MARV16 识别的表位跨越 GP1 和 GP2（图 3a、b 和扩展数据表 4 ）。表位与互补位之间的界面处平均埋藏着 1100 ^Ų 的表面积，其中 Fab 重链与 MARV GP 的大部分接触。GP2 约占表位埋藏表面积的 75%，并被 MARV16 重链的所有三个互补决定区（CDR）识别。 CDRH3 残基通过氢键、盐桥和范德华力识别 MARV GP2，其中 CDRH3 R99 和 D105 分别与 GP2 E515 和 K550 形成盐桥，CDRH3 N101 与 GP2 N551 侧链形成氢键，CDRH3 W102 吲哚与 GP2 N554 形成氢键（图 3c ）。CDRH1 和 CDRH2 与 GP2 形成广泛的相互作用，例如 CDRH2 S52 和 S54 侧链与 GP2 D513 之间、CDRH2 Y57 与 GP2 R517 主链酰胺和羰基氧之间以及 CDRH2 Y59 与 GP2 R517 侧链之间形成氢键。CDRH1 T33 侧链与 GP2 E515 侧链相互作用。 MARV16 轻链也主要通过 CDRL3 与 GP2 相互作用，其中 D93 通过盐桥与 GP2 R517 连接，S91 和 Y92 主链羰基与 GP2 K550 侧链形成氢键（图 3d ）。 MARV GP1 的识别主要通过 MARV16 CDRH2 介导，其中 S54 和 S56 的主链羰基分别与 GP1 的 K90 和 K120 侧链形成氢键，CDRH2 的 Y57 侧链与 GP1 的 E87 侧链也形成氢键（图 3e ）。这些广泛的相互作用解释了 MARV16 具有很强的结合亲和力，而 MARV 分离株、RAVV 和 DEHV 中界面残基的保守性则解释了该抗体对多种马尔堡病毒的中和活性（图 2h–k 和扩展数据图 6 ）。多个表位残基的替换解释了 MARV16 无法中和 EBOV 和 SUDV VSV 的原因（图 2j,k ）。

a ，MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域与三个 MARV16 Fab 片段复合物的冷冻电镜结构带状图。图中仅对 Fab 可变区进行了建模。MARV GP1 和 GP2 分别以紫色和金色显示，MARV16 VH 以绿色显示，MARV16 VL 以浅绿色显示。N-连接糖链以浅蓝色表面表示。b，单个 MARV GP 原体与一个 MARV16 Fab 片段复合物的带状图 。c – e ， MARV16 CDRH1-CDRH3 与 MARV GP2（ c ）、MARV16 CDRL3 与 MARV GP2（ d ）以及 MARV16 CDRH2 与 MARV GP1（ e ）之间相互作用的放大图。选定的氢键和盐桥用黑色虚线标出。 f ，NPC1 受体（黄色）和 MARV16（绿色/浅绿色）与 MARV GP 的结合模式。NPC1 的位置是通过将 EBOV GP–NPC1（PDB： 5JNX ）和 MARV GP–MARV16 Fab 结构进行叠加确定的。为了清晰起见，图中未显示 EBOV GP 三聚体和我们结构中解析出的 MARV GP 糖帽区域（残基 191–219）。红色星号表示空间位阻 。g ，MARV GP1 和 EBOV GP1（PDB： 3CSY ）的带状图。MARV GP1 核心和糖帽分别以深紫色和浅紫色显示。EBOV GP1 核心和糖帽分别以深蓝色和浅蓝色显示。糖帽与核心之间的氢键用黑色虚线表示，插入核糖体结合位点（RBS）的糖帽芳香族残基以棒状模型表示并标注。实验确定的埃博拉病毒糖蛋白（EBOV GP）RBS 位置和马尔堡病毒糖蛋白（MARV GP）推测 RBS 位置用红色虚线圆圈表示。

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在先前解析的 RAVV GP–MR191 结构中，GP2 侧翼部分阻碍了 MARV16 表位 ¹¹ 。在我们解析的结构中，GP2 侧翼呈无序状态，GP2 核心的氨基末端残基相对于其在 RAVV GP–MR191 结构中的位置发生了高达 18 Å 的位移，这使得 MARV16 Fab 能够结合（扩展数据图 6 ）。这些数据表明，GP2 核心的侧翼和 N 末端具有柔性，并不能完全屏蔽 GP 免受中和抗体的攻击。与先前已表征的抗埃博拉病毒 GP 抗体的结构相比，MARV16 与埃博拉病毒 GP 靶向中和抗体 ADI-15946、EBOV-515 和 EBOV-520 具有相似的结合模式（扩展数据图 6 ），这些抗体被认为通过将 GP1 和 GP2 束缚在融合前构象中来中和埃博拉病毒 52, 53, 54, 55。我们的结构数据表明，MARV16 通过与在导致膜融合的融合构象变化过程中重排的残基接触来锁定 MARV GP1 和 GP2 的^界面 30 。 此外，与 NPC1 结合的 EBOV GP 结构 26 , 56 的比较表明，MARV16 也会干扰受体结合，因为重链可变区会与 NPC1 N 端结构域发生空间冲突（图 3f ），ADI-15946、EBOV-515 和 EBOV-520 的情况也是如此。

从马尔堡病毒（MARV）感染者体内发现靶向 MARV 糖蛋白核糖体结合位点（RBS）的中和抗体，表明糖基帽可能无序，因此无法有效屏蔽 RBS ^9,36 。我们的冷冻电镜图谱解析出 RBS 附近的电子密度，对应于 GP1 糖基帽的 191-219 位残基，这与糖基帽对 RBS 的部分屏蔽作用相符，类似于埃博拉病毒（EBOV）糖蛋白的情况（扩展数据图 6 ）。事实上，EBOV 糖蛋白的糖基帽通过β折叠的增强以及 F225 和 Y232 插入 RBS ²⁷ 与 GP1 核心相互作用。我们的结构显示，MARV 糖蛋白的结构与 EBOV 糖蛋白高度相似，都存在β折叠的增强以及 F212 残基插入 MARV RBS 的情况（图 3g ）。与马尔堡病毒糖蛋白（MARV GP）相比，埃博拉病毒糖蛋白（EBOV GP）糖基帽与核糖体结合位点（RBS）的锚定可能更紧密，这或许导致 RBS 区域比 EBOV 糖基帽更易移动和置换。这一发现解释了为什么 MR78 和 MR191 能够中和 MARV，但不能中和 EBOV。

接下来，我们对通过免疫 Alloy ATX 小鼠发现的九种非中和性单克隆抗体识别的 MARV GP 表位进行了定位。基于生物发光成像（BLI）进行的表位分型，这些抗体被分为四个不同的结合组（扩展数据图 7 ）。第一组包括 MARV4、MARV12、MARV18、MARV21 和 MARV23，第二组包括 MARV11 和 MARV14。MARV7 和 MARV20 不与其他分析的抗体竞争结合，表明这两种抗体分别靶向不同的 MARV GP 抗原位点。然后，我们使用负染样品的电镜来鉴定这四个结合组识别的 MARV GP 表位。第一组抗体（以 MARV18 为代表）结合 HR2（扩展数据图 7 ）。相比之下，第二组抗体（以 MARV14 和 MARV7 为代表）结合 GP2 的侧翼结构域（扩展数据图 7 ）。 MARV20 靶向的表位无法确定，这可能是由于 MARV20 靶向 MARV GP 上的柔性区域（扩展数据图 7 ）。

为了评估 MARV16 的保护效力，我们用 1000 个噬斑形成单位 (PFU) 的豚鼠适应性 MARV/Angola 病毒感染豚鼠（每组 n = 6），并在感染后 1、2 或 4 天 (dpi) 分别给予 10 mg MARV16（人 IgG1）抗体（图 4a ）。另取 6 只豚鼠，在感染后 1 天给予同型对照单克隆抗体。对照组的 6 只动物均在感染后 13 天死亡，且感染后均表现出高病毒载量、体重下降（≥5%）和临床评分升高（图 4b–f ）。此外，这 6 只动物中有 3 只在感染后出现体温升高（≥1.1 °C）。对于接受 MARV16 治疗的豚鼠，存活率如下：感染后 1 天（1 dpi）接受 MARV16 治疗的豚鼠存活率为 33%（6 只中有 2 只）；感染后 2 天（2 dpi）接受 MARV16 治疗的豚鼠存活率为 83%（6 只中有 5 只）；感染后 4 天（4 dpi）接受 MARV16 治疗的豚鼠存活率为 50%（6 只中有 3 只）（图 4b ）。在感染后 1 天，我们未检测到两只感染后 1 天（分别于感染后 7 天和 10 天死亡）接受 MARV16 治疗的豚鼠以及一只感染后 4 天（4 dpi）接受 MARV16 治疗的豚鼠（于感染后 10 天死亡）的血浆中存在 MARV16 结合滴度。这些结果表明，在这些动物体内，MARV16 被隔离在注射部位，并在进入血液循环之前就被攻击病毒立即清除或“吸收”。排除这些动物后，在感染后 1 天（1 dpi）接受 MARV16 治疗的动物中，50%（4 只中的 2 只）存活；在感染后 4 天（​​4 dpi）接受 MARV16 治疗的动物中，60%（5 只中的 3 只）存活（图 4b ）。在存活的 MARV16 治疗豚鼠中，60%在恢复前出现体重下降，而 40%未出现体重下降。 此外，10 只存活的豚鼠中有 7 只出现短暂的体温升高，所有存活的动物临床症状评分均较低（图 4d-f ）。与接受同型对照的豚鼠（几何平均病毒载量为 2.8 × 10⁷ GE/ml）相比，分别在感染后 1、2 或 4 天接受 MARV16 治疗的动物在感染后 5 天，其 MARV 病毒载量分别降低了 2 个对数单位、3 个对数单位和 1 个对数单位（几何平均病毒载量分别为 1.2 × ^10⁵ 、9.6 × ^10³ 和 1.9 ^{× 10⁶ GE} /ml）（图 4c ）。这些数据表明，MARV16 能够提供针对 MARV 攻击的治疗性保护。

a ，MARV 攻毒试验示意图，用于评估 MARV16 的治疗效果。ip，腹腔注射。b ， 豚鼠（每组 n = 6）接种 1000 PFU MARV/Angola 后，分别接受 MARV16 或同型对照抗体治疗的生存曲线。动物在感染后 29 天（dpi）进行监测。图中以虚线框表示分别在感染后 1 天和 4 天（dpi）接受 MARV16 治疗的各组的生存曲线，并排除治疗后 1 天血浆 MARV16 浓度无法检测到的动物。采用 Kaplan-Meier 生存分析评估各组间生存率的统计学差异，并排除血浆 MARV16 浓度无法检测到的动物。采用双侧对数秩检验，并对同型对照抗体治疗组和 MARV16 治疗组之间的多重比较应用 Holm-Šídák 校正。 c ，感染豚鼠血浆中 MARV/Angola 病毒载量在感染后 5 天（dpi）测定。黑线表示各组的几何平均病毒载量，虚线表示检测限（病毒载量≤2 × ^10³ GE/ml）。采用 Kruskal-Wallis 检验和 Dunn 事后检验评估各组间病毒载量的统计学差异，比较同型对照抗体处理组和 MARV16 处理组（排除血浆中 MARV16 浓度无法检测的动物） 。d – f ，攻毒试验期间豚鼠的每日体重（ d ）、体温（ e ）和临床评分（ f ）。 治疗后 1 天血浆中 MARV16 浓度无法检测的动物用三角形表示，这表明在这些动物中，MARV16 在注射部位被隔离，并在进入血液之前立即被攻击病毒清除或“吸收”。

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接下来，我们评估了 MARV16 激活 FcγRIIa (H131)和 FcγRIIIa (V158)的能力，分别作为抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的替代指标。MARV16 未能激活 FcγRIIa 或 FcγRIIIa（扩展数据图 8 ）。该结果表明，MARV16 诱导的保护作用完全源于其对病毒的直接中和作用。我们推测，对可结晶片段(Fc)进行修饰，如同对其他 MARV 抗体 ^37,39,40 所做的那样，以增强其效应功能，可能进一步提高 MARV16 的治疗效果。

由两种或多种靶向非重叠中和表位的单克隆抗体组成的抗体混合物常被用作抗病毒疗法，因为与单一单克隆抗体相比，它们能更有效地抵抗病毒进化 ⁵⁷ 。由于 MARV16 与 MARV GP 上的一个表位结合，该表位不同于靶向 RBS 的 MR78 和 MR191，我们推测 MARV16 和 MR78 或 MR191 可能同时结合 MARV GP。为了验证这一可能性，我们进行了 MARV16 与 MR78 或 MR191 的竞争性结合实验，观察到 MARV GPΔMuc _WT 在结合 MARV16 后也能结合 MR78 或 MR191（图 5a ）。此外，通过对负染样品进行单颗粒电子显微镜分析（图 5b，c ）可观察到，三个 MARV16 Fab 片段和三个 MR78 或 MR191 Fab 片段可以同时与融合前的 MARV GPΔMuc WT 胞外域三聚体结合。

a ，利用生物发光成像（BLI）技术，对 MARV16、MR78 和 MR191 IgG 与 MARV16 结合的 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域进行竞争性结合实验。所示数据来自一个生物学重复，并代表了使用不同批次蛋白质的两个生物学重复实验的数据。b 、 c ，分别展示了负染 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域与 MR78 和 MARV16 Fab 片段（ b ）或 MR191 和 MARV16 Fab 片段（ c ）结合的代表性二维类平均图和三维重建图。MR78（粉色）或 MR191（蓝色）Fab 片段的位置是通过将 RAVV GP–MR78 Fab（PDB： 5UQY ）或 RAVV GP–MR191 Fab（PDB： 6BP2 ）结构与我们的 MARV GP–MARV16 Fab 结构进行叠加确定的。比例尺，400 Å。d – f ，使用编码 MARV/Musoke GP 而非 VSV G 蛋白的复制型 VSV，分别鉴定 MARV16 单独感染 ( d )、MARV16-MR78 抗体混合物 ( e ) 和 MARV16-MR191 抗体混合物 ( f ) 的逃逸突变。使用分别经噬斑纯化的 VSV-MARV/Musoke GP 分离株 2B2 和 2B4 进行了两次选择实验。在抗体浓度递增的情况下进行病毒传代，直至在 100 µg ^ml⁻¹ 抗体存在下观察到明显的细胞病变效应（视野的 3% 至 20%）。通过对病毒上清液进行深度测序来鉴定突变，并将频率达到至少 10% 的突变显示在图中，并根据其来源分离株进行着色。在未添加抗体的 2B2 代中也发现了 V547G 突变，该突变以灰色显示。 g ，在抗体筛选实验中鉴定的逃逸突变（红色）被定位在 MARV GPΔMuc _WT （灰色）的表面。MR78 的位置（粉色）是通过将 RAVV GP–MR78 Fab（PDB： 5UQY ）的结构与我们解析的 MARV GP 与 MARV16 Fab 复合物的结构（绿色）进行叠加而确定的。C226、F447S 和 L448P 在我们的结构中未被解析，因此未显示在 MARV GP 上。

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为了评估病毒逃避抗体介导的中和作用的屏障，我们首先在仅存在 MARV16 的情况下，对编码 MARV/Musoke GP 而非 VSV G 蛋白的复制型 VSV 进行传代培养。我们使用两个分别经噬斑纯化的 VSV-MARV/Musoke GP 分离株（分别命名为 2B2 和 2B4）进行了两次独立的筛选实验。输入的 2B2 病毒包含两个非同义 GP 突变，分别位于信号肽 (K2E) 和黏蛋白样结构域 (I381R)；而输入的 2B4 病毒仅包含 I381R GP 突变。两次仅使用 MARV16 的筛选实验均在 GP2 核心中产生了一个逃逸突变 A514T（图 5d ）。这些数据与之前对单克隆抗体的研究结果一致，包括 MR78 和 MR191，这些研究表明，靶病毒抗原的单个突变可以使其逃避单个单克隆抗体 ^9 , 57 。

为了证明由 MARV16 和一种靶向 RBS 的抗体配制的抗体混合物能够阻止单个 MARV GP 突变引起的病毒逃逸，我们接下来在含有 MARV16 和 MR78 或 MARV16 和 MR191 的抗体混合物中对 VSV-MARV/Musoke GP 分离株进行传代培养。与单独使用 MARV16 相比，分离株需要两个或多个突变才能从 MARV16-MR78 和 MARV16-MR191 抗体混合物中逃逸。使用 2B2 分离株在 MARV16-MR78 混合物中筛选，最终鉴定出 GP1 核心、黏蛋白样结构域和 GP2 核心中的三个逃逸突变，分别为 Q128P、F447S 和 K550E（图 5e ）。使用 2B4 分离株进行 MARV16–MR78 选择实验，在聚糖帽和 GP2 核心分别产生了两个逃逸突变，分别为 Y197C 和 A514E（图 5e ）。对于 MARV16–MR191 混合病毒，使用 2B2 分离株鉴定出三个逃逸突变，分别位于聚糖帽 (C226R)、翅 (L448P) 和 GP2 核心 (K550E)（图 5f ）。在 MARV16–MR191 存在下传代的 2B4 分离株中，我们在翅和 GP2 核心分别鉴定出两个逃逸突变，分别为 L451S 和 A514T（图 5f ）。我们的数据表明，GP2 核心的突变可能影响了 CDRH1 和 CDRH2（A514T/E）或 CDRH3 和 CDRL3（K550E）的识别（图 5g ），并导致了 MARV16 的逃逸。与之前的筛选实验 ^{9 一致，RBS 的突变（先前研究中的 Q128P 或 N129S）或可能阻止聚糖帽或侧翼移位的突变（ 先前研究中的 Y197C、C226R、L448P 和 L451S 或 S220P、C226Y 和 P455L）导致了 MR78 和 MR191 的逃逸（图 5g ）。 这些数据表明，MARV16 和一种针对 RBS 的抗体可以一起用于治疗性抗体混合物中，这种混合物需要多个 GP 突变才能逃避两种抗体的中和作用。从而创造出一种对病毒进化具有更强抵抗力的马尔堡病毒治疗药物。}

识别稳定突变是疫苗设计的关键目标，因为利用此类突变可以优先诱导针对糖蛋白（GP）所需构象的抗体，从而显著提高病毒抗原的免疫原性。SARS-CoV-2 S 蛋白疫苗和呼吸道合胞病毒 F 蛋白疫苗已成功引入融合前稳定突变 ^32,33 。本文鉴定的稳定突变提高了马尔堡病毒（MARV）GPΔMuc 的表达、热稳定性和免疫原性。然而，由于用 MARV GPΔMuc _WT 或 MARV GPΔMuc _PV 免疫的小鼠血清中和抗体滴度较低，因此可能需要采取一些策略来诱导更有效的中和抗体滴度，例如将稳定的 MARV GP 以多聚体形式呈递在纳米颗粒上 ^47,48,49 ，或将稳定突变纳入编码全长 MARV GP 的 mRNA 疫苗中 ^42,50 。我们还使用 ProteinMPNN 45 来鉴定 MARV GPΔMuc 中的稳定突变，类似于最近用于 Langya 病毒 G 蛋白和 Epstein-Barr 病毒 gB 蛋白的方法 43,44 ，从而进一步证明了机器学习辅助疫苗设计的实用性。

先前的研究表明，由于所有先前鉴定的 MARV GP 中和抗体都仅靶向 RBS ^9,36 ，因此 GP1 的黏蛋白样结构域和 GP2 的翼状结构域能够屏蔽 MARV GP 的赤道区和基部，使其免受中和抗体的攻击 10,11 。由于 MARV16 结合的表位跨越 GP1 和 GP2，我们的数据表明，黏蛋白样结构域和翼状结构域并不能完全屏蔽 GP2。相反，翼状结构域具有构象灵活性，从而能够与抗体结合。因此，我们预期未来的抗体发现活动将鉴定出靶向多个不同 GP2 表位的中和抗体。MARV16 识别一个保守的马尔堡病毒表位，并能中和与 MARV GP 亲缘关系较远的丝状病毒，例如与 MARV GP 氨基酸序列同一性仅为 49.9%的 DEHV。一些针对埃博拉病毒糖蛋白（GP）的抗体，例如 ADI-15946、EBOV-515 和 EBOV-520，能够中和埃博拉病毒（EBOV）、苏丹埃博拉病毒（SUDV）和邦迪布焦埃博拉病毒（Bundibugyo ebolavirus），但不能中和马尔堡埃博拉病毒（MARV），它们识别的表位与 MARV16 相似（参考文献 52、53、54、55 ） ， 这表明该表位是广谱属特异性中和的主要靶点。因此，针对该 MARV GP 抗原位点的治疗药物或疫苗可能对新出现的 MARV 变种和 MARV 相关丝状病毒提供有效的保护，类似于针对埃博拉病毒（EBOV）开发的疗法 48 。

对于埃博拉病毒 ，结构化的糖基帽会阻碍受体接近核糖体结合位点（RBS），直到内体中组织蛋白酶 B 或 L 介导的糖蛋白（GP）切割 ^27,28,51 。这一特性限制了 RBS 靶向抗体的产生和效力 9,10 。相比之下，马尔堡病毒（MARV）糖蛋白的糖基帽尚未被观察到，且 RBS 靶向抗体介导的 MARV 中和作用较弱但可检测到，这表明 MARV 糖蛋白的 RBS 比埃博拉病毒糖蛋白的 RBS 暴露程度更高 9,10,11,36 。 我们的结构分析表明，MARV 糖基帽以类似于埃博拉病毒糖基帽的方式屏蔽 RBS。然而，MARV GP 糖基帽构象异质性的增加或与 RBS 结合的松散可能导致其更容易被置换，这解释了为什么 MR78 和 MR191 能够中和 MARV，但不能中和埃博拉病毒 。相应地，我们观察到在酸性条件下，RBS 靶向抗体 MR78 和 MR191 与 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域的结合增强。这些数据表明，在晚期内体的酸性条件下，糖基帽不太可能掩盖 RBS。

由于人类的微血管疾病（MVD）诊断和治疗常常延误，单克隆抗体已根据其在动物模型中于马尔堡病毒（MARV）感染后数天给药时的治疗效果进行了评估 ^39,40 。我们在此证明，MARV16 在豚鼠感染后 96 小时给药仍能显著保护其免受 MARV 感染，这表明 MARV16 是治疗 MVD 的潜在候选抗体。此外，由靶向抗原上不同表位的多种抗体组成的治疗性抗体混合物更适用于病毒病原体，因为靶向病毒蛋白通常需要积累多个突变才能逃避混合物中所有抗体的攻击 ⁵⁷ 。所有先前发现的针对 MARV 糖蛋白（GP）的中和抗体均靶向核糖体结合位点（RBS），这限制了 MARV 抗体混合物的开发 9,36,37,38 。 我们证实 MARV16 可以与靶向 RBS 的抗体同时结合 MARV 糖蛋白 (GP)，这表明可以开发出类似于针对埃博拉病毒 (EBOV ) 的 ZMapp 抗体混合物的 MARV 治疗性抗体混合物。我们在此证明，此类混合物需要对 GP 进行多个氨基酸替换才能逃避混合物中两种抗体的中和作用。这些数据表明，由 MARV16 和靶向 RBS 的抗体组成的抗体混合物可用作 MARV 治疗药物，以增强其对突变的抵抗力。事实上，即使病毒发生进化，这种组合在治疗期间也应保持疗效。

总之，我们的研究结果将为马尔堡病毒疫苗和治疗方法的研发提供信息，为未来马尔堡病毒疫情的治疗和预防提供更好的选择。

细胞

HEK-293T (ATCC)、Vero E6 (ATCC)、BHK-21/WI-2 (Kerafast) 和 BS-C-1 细胞 (ATCC) 在添加 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺 (PS) 的 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO₂ _条件下培养。Expi293 (ThermoFisher) 和 ExpiCHO-S (ThermoFisher) 细胞分别在 Expi293 培养基或 ExpiCHO 培养基中，于 37 °C、8% _CO₂ 条件下，以 130 rpm 的转速旋转培养。这些细胞系未经鉴定或支原体污染检测。

体内动物研究

本研究从 Inotiv 公司获得了 60 只（30 只雄性，30 只雌性）6-8 周龄的 BALB/c 小鼠（ Mus musculus ）。小鼠饲养于 Bioqual 动物房（12 小时光照/12 小时黑暗循环，温度 20-26.1℃，相对湿度 30-70%），可自由获取无菌水和饲料。小鼠的饲养和处理均遵循国际实验动物评估与认证协会（AAALAC）的参考标准：《实验动物饲养和使用指南》（第八版）、经修订的《动物福利法》以及 2015 年美国公共卫生署（PHS）关于人道对待和使用实验动物的政策。所有实验均在 Bioqual 机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的实验方案（编号 23-054P）下进行。动物在纳入实验前均经过检查，并在整个研究过程中由兽医进行监测。

6-7 周龄的 ATX-GK 和 ATX-GL 雌性小鼠购自 Alloy Therapeutics 公司，饲养于瑞士贝林佐纳生物医学研究所，用于免疫实验。所有动物实验均按照瑞士联邦兽医办公室的指导方针进行，并经州兽医部门批准（批准号：35554 TI-39/2023/2023）。动物实验由执业兽医监督，并采取适当措施确保所有动物的福利，最大程度地减少动物的痛苦。动物饲养于通风笼中，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，温度为 20 ± 2 °C，相对湿度为 55 ± 8%，可自由饮水和摄取标准灭菌饲料。

本研究使用了 24 只雌性、4-8 周龄的哈特利豚鼠（ Cavia porcellus ），这些豚鼠购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories），饲养于德克萨斯生物医学研究所（Texas Biomed）经美国疾病控制与预防中心（CDC）认证的生物安全四级（BSL-4）/动物生物安全四级（ABSL-4）生物安全实验室（温度 18-28℃，相对湿度 25-75%），并可自由获取水和饲料。所有实验均在研究开始前获得德克萨斯生物医学研究所动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 1915C），并严格遵守《动物福利法》和《实验动物饲养与使用指南》。在接触攻击病毒前，兽医每天至少观察动物一次；在接触攻击病毒后，兽医每天至少观察两次。濒死动物经兽医批准后实施安乐死。

构造

编码带有羧基末端 8×His 标签的 MARV GPΔMuc _WT 胞外结构域（氨基酸残基 1-256 和 426-637）的构建体经密码子优化、合成后，由金斯瑞生物技术公司（Genscript）插入 pcDNA3.1(+)载体。利用重叠诱变引物，通过 In-Fusion 克隆技术引入了邻近弗林蛋白酶切割位点的突变（W439A、F445G 和 F447N）以及稳定突变（H589I）。HR1c _稳定突变（T582P 和 F583V）也通过 In-Fusion 克隆技术，利用重叠诱变引物引入。编码埃博拉病毒 (EBOV) GPΔMuc 结构域（氨基酸残基 1–312 和 463–637）和苏丹病毒 (SUDV) GPΔMuc 结构域（氨基酸残基 1–313 和 474–637）的构建体，均带有 C 端 T4 折叠结构域和 8× His 标签，由金斯瑞生物技术有限公司 (Genscript) 进行密码子优化、合成并插入到 pcDNA3.4 载体中。编码全长马尔堡病毒/穆索克病毒 (MARV/Musoke) GP（GenBank 登录号： NC_001608 ）的构建体，带有 C 端 Flag 标签，由金斯瑞生物技术有限公司 (Genscript) 进行密码子优化、合成并插入到 pcDNA3.1(+) 载体中。由金斯瑞生物技术有限公司对编码全长 MARV/Ci67（GenBank 登录号： EF446132 ）、MARV/Ozolin（GenBank 登录号： AY358025 ）、MARV/Angola（GenBank 登录号：KY047763）、MARV/Kakbat-SL-2017（GenBank 登录号：MN258361）、MARV/Kasbat-SL-2018（GenBank 登录号：MN187403）、MARV/Ghana-2022（GenBank 登录号：OQ672470）和 MARV/Equatorial Guinea-2023（HS415030）的构建体进行了密码子优化、合成，并插入到 pHDM 中。编码弗林蛋白酶和 MR78、MR191 和 EBOV515 重链和轻链的构建体由 Genscript 进行密码子优化、合成并插入到 pcDNA3.1(+) 中。 通过将可变区克隆到 IgG1 和 IgK 表达载体中，构建了编码 MARV4、MARV7、MARV11、MARV14、MARV16、MARV18、MARV20、MARV21 和 MARV23 重链和轻链的载体 ⁵⁸ 。十种 MARV 抗体的 VH 和 VL 氨基酸序列见扩展数据表 1。 编码带有 N 端 CD5 前导序列和 C 端 His 标签的 MARV7、MARV14、MARV18 和 MARV20 VH-CH1 序列的载体经密码子优化、合成后，由金斯瑞生物技术公司（Genscript）插入 pcDNA3.4 载体。编码带有 N 端 CD5 前导序列和 C 端 3×Flag 标签的 MARV7、MARV14、MARV18 和 MARV20 VL-CH1 序列的载体经密码子优化、合成后，由金斯瑞生物技术公司（Genscript）插入 pcDNA3.4 载体。由金斯瑞生物技术公司（Genscript）合成并插入 pVSV eGFP dG 载体（由 C. Cepko 惠赠；Addgene 质粒 31842）中 VSV M 蛋白和 L 蛋白之间的天然全长 MARV/Musoke GP 蛋白。编码 VSV N、P、L 和 G 蛋白的辅助质粒购自 Kerafast 公司（EH1012）。

重组蛋白表达和纯化

为了制备 MARV GPΔMuc、EBOV GPΔMuc 和 SUDV GPΔMuc 胞外结构域，将 Expi293 细胞培养至 3 × ^{10⁶ 个}细胞/ml 的密度，然后使用 Expifectamine293 转染试剂盒，按照制造商的说明，以 3:1 的质量比将编码胞外结构域和弗林蛋白酶的构建体转染到细胞中。转染 5 天后，收集上清液，离心澄清，并与 Ni Sepharose Excel 树脂（Cytiva）在室温下孵育 1 小时。然后将树脂收集到重力柱中，并用含有 25 mM 磷酸钠（pH 8.0）、300 mM NaCl 和 50 mM 咪唑或 100 mM Tris（pH 8.0）、300 mM NaCl 和 40 mM 咪唑的缓冲液洗涤。随后，使用含有 25 mM 磷酸钠、300 mM 氯化钠、500 mM 咪唑（pH 8.0）或 100 mM Tris、300 mM 氯化钠、300 mM 咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质，并使用 Superose 6 Increase 10/300 GL 柱进行尺寸排阻色谱，进一步纯化至 TBS 缓冲液（20 mM Tris pH 7.4 和 100 mM 氯化钠，或 50 mM Tris pH 7.4 和 150 mM 氯化钠）。纯化的蛋白质经 100 kDa Amicon 超滤离心管浓缩后，快速冷冻并储存于−80 °C 直至使用。

MARV7、MARV11、MARV14、MARV16、MARV18、MARV20、MARV21 和 MARV23 通过瞬时转染 ExpiCHO-S 细胞（ThermoFisher Scientific）进行重组表达，转染试剂盒为 ExpiFectamine CHO（Thermo Fisher Scientific）。8 天后，使用 Sartoclear Dynamics Lab V 试剂盒（Sartorius）分离细胞培养上清液，并使用配备 HiTrap 蛋白 A 柱（Cytiva）的 ÄKTA Xpress Fast Protein 液相色谱仪（Cytiva）进行蛋白 A 亲和层析纯化。随后，使用 HiPrep 26/10 脱盐柱（Cytiva）将缓冲液置换为含有 20 mM 组氨酸和 150 mM NaCl、pH 6.0 的缓冲液。使用 Lunatic 分光光度计（Unchained Labs）对纯化的抗体浓缩物进行定量，并储存于 -80 °C 直至使用。

将密度为 3 × ^{10⁶ 个}细胞/毫升的 Expi293 细胞用 Expifectamine293 转染试剂盒以 1:1 的质量比转染重链和轻链构建体，制备 MR78、MR191 和 EBOV515 单克隆抗体。转染 4 至 5 天后，收集上清液，离心澄清后，将其上样至蛋白 A 柱。然后用至少 10 倍柱体积的含 20 mM 磷酸钠（pH 8.0）的洗涤缓冲液洗涤该柱。最后，将洗脱的抗体置换到 TBS 缓冲液中，并使用 100 kDa Amicon 超滤离心管浓缩。

使用 Expifectamine293 转染试剂盒，按照制造商的说明，将重链和轻链构建体以 1:1 的质量比转染至 Expi293 细胞，制备 MARV7、MARV14、MARV18 和 MARV20 Fab 片段。转染 4 至 5 天后，收集上清液，离心澄清后，与 Ni Sepharose Excel 树脂（Cytiva）在室温下孵育 1 小时。将树脂收集于重力柱中，并用含有 25 mM 磷酸钠（pH 8.0）、300 mM NaCl 和 20 mM 咪唑的缓冲液洗涤。然后使用含有 25 mM 磷酸钠、300 mM NaCl、500 mM 咪唑、pH 8.0 的洗脱缓冲液洗脱蛋白质，并通过 Superdex 75 Increase 10/300 GL 柱的尺寸排阻色谱法进一步纯化到 TBS（20 mM Tris pH 7.4 和 100 mM NaCl）中，并使用 30 kDa Amicon 离心过滤器浓缩。

MARV GPΔMuc _{WT 的生物素化}

MARV GPΔMuc _{WT 的}制备和纯化方法如上所述。从 Ni Sepharose Excel 树脂上洗脱后，将 GP 置换到 PBS 缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM _Na₂HPO₄ 和 1.8 mM _KH₂PO₄ ，pH _7.4 ） 中，并使用 100 kDa Amicon 超滤离心管浓缩至 1 mg/ ^ml 。使用 EZ-Link Sulfo-NHS-SS 生物素化试剂盒（ThermoFisher），以 40 倍摩尔过量的 Sulfo-NHS-SS-生物素对 MARV GPΔMuc _WT 进行生物素化，并将反应混合物在室温下孵育 30 分钟。然后使用 Superose 6 Increase 10/300 GL 柱，通过尺寸排阻色谱法将生物素化的 MARV GPΔMuc _WT 纯化到 TBS 缓冲液中。然后使用 100 kDa Amicon 离心过滤器浓缩纯化的蛋白质，快速冷冻并储存在 −80 °C 直至使用。

EBOV 和 SUDV GPΔMuc 的裂解

EBOV 和 SUDV GPΔMuc 胞外结构域的制备和纯化方法如上所述。从 Ni Sepharose Excel 树脂上洗脱后，将 GP 置换到 TBS 缓冲液中，并使用 100 kDa Amicon 超滤离心管浓缩至 1 mg ^/ ml。将重悬于 TBS 缓冲液中的嗜热菌蛋白酶（Sigma-Aldrich）加入反应体系，使其最终浓度为 0.2 mg ^/ ml。反应混合物在 37 °C 下孵育 1 小时，之后加入磷酰胺（Sigma-Aldrich）至终浓度为 500 µM 以终止嗜热菌蛋白酶的活性。使用 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱进行尺寸排阻色谱，将裂解的 GP 纯化到 TBS 缓冲液中。

Fab 片段的生成

为了从纯化的单克隆抗体中生成 Fab 片段，将重悬于 TBS 缓冲液中的 LysC 以 1:4000 至 1:8000 的质量比加入到 1 mg MARV16、MR78 或 MR191 IgG 中，并在 37 °C 下孵育过夜。第二天，将 Cytiva MabSelect 树脂加入到消化后的 IgG 溶液中，并在室温下孵育 1 小时。收集流出液，并将其上样至预先用 TBS 缓冲液平衡的 Superdex 75 Increase 10/300 GL 柱。收集含有 Fab 片段的组分，并使用 30 kDa Amicon 超滤离心管进行浓缩。

利用 BALB/c 小鼠进行免疫原性研究

小鼠被随机分为六组（每组 n = 10 只），雌雄小鼠数量相等。在实验第 0、28 和 56 天，将 0.1 µg、1 µg 或 10 µg 的 MARV GPΔMuc _WT 或 MARV GPΔMuc _{PV 病毒}液用 TBS 稀释，并与 InvivoGen Addavax 免疫球蛋白按 1:1 的体积比混合，总注射体积为 100 µl。小鼠双侧股四头肌均进行肌内注射（每侧股四头肌 50 µl）。在实验第 -7、14、42 和 70 天，从每只小鼠采集血液，置于血清分离管中。所得血清储存于 -80 °C 直至使用。

MARV GPΔMuc 免疫接种及 Alloy 小鼠抗体发现

在免疫前 1 周，从每只小鼠中采集免疫前血清。ATX 小鼠用重组 MARV GPΔMuc _WT 病毒（以 1:1 的比例稀释于 Magic Mouse 佐剂（CDN-A001E；CD Creative Diagnostics）中）进行免疫，并通过皮下和腹腔注射给药。第 0 天，小鼠接受 20 µg MARV GPΔMuc _WT 病毒的初次免疫，并在第 13 天和第 64 天接受相同剂量的加强免疫。第 70 天，处死小鼠，采集外周血、脾脏和淋巴结，并新鲜分离细胞。使用小鼠 CD19 微珠和 LS 柱（Miltenyi）通过阳性选择富集新鲜分离或冷冻脾细胞中的 B 细胞，随后用小鼠抗 IgM（BioLegend，406508；2 µg ml ^–1 ）、抗 IgD（BioLegend，405706；2 µg ml ^–1 ）、抗 IgA（Fisher Scientific，15208769；2 µg ml ^–1 ）和用链霉亲和素-Alexa-Fluor 488 和链霉亲和素-Alexa-Fluor 647（Life Technologies）标记的生物素化 MARV GPΔMuc _WT 进行染色。通过流式细胞术分选 MARV GPΔMuc _WT 特异性 IgG ⁺ 记忆 B 细胞，方法是先排除 IgM ⁺ IgD ⁺ IgA + B 细胞，然后使用 SH800SFP 细胞分选仪（Sony）以双标记（Alexa-Fluor 488 和 Alexa-Fluor 647）抗原阳性诱捕 B 细胞。将分选出的 IgG + 记忆 B 细胞以克隆稀释度接种于 384 孔板中，孔内预先铺有一层饲养间充质细胞，并添加 B 细胞存活因子。随后分离抗原结合阳性克隆并合成 cDNA。通过 RT-PCR 获得单克隆抗体 VH 和 VL 序列。参考 IMGT 数据库 59 鉴定编码 IgH DNA 序列 V、D 和 J 的基因。 然后，在 ExpiCHO 细胞中重组生产人 IgG1（IgG1m3 同种型）单克隆抗体，并按照先前描述的方法用重和轻表达载体进行瞬时转染 58 。

酶联免疫吸附试验

将 MARV GPΔMuc _WT 或 MARV GPΔMuc _PV 胞外结构域用 TBS 稀释至 0.003 mg/ ^ml ，加入 Maxisorp 384 孔板（ThermoFisher），室温孵育过夜。次日，轻拍孔板直至干燥，用封闭酪蛋白于 37 °C 封闭 1 小时。再次轻拍孔板直至干燥，将血清样本（起始浓度 1:40）或单克隆抗体（起始浓度 0.1 mg/ ^ml ）用含 0.1% Tween 20 的 TBS（TBST）稀释，并用 TBST 进行 1:3 系列稀释，加入孔板，于 37 °C 孵育 1 小时。将微孔板吸干水分，用 TBST 洗涤 4 次。随后，向每个孔中加入用 TBST 稀释 1:5000 的山羊抗小鼠 IgG (H+L) HRP 偶联抗体（ThermoFisher）或山羊抗人 IgG (H+L) HRP 偶联抗体（ThermoFisher）。将微孔板于 37℃孵育 1 小时，吸干水分，并用 TBST 洗涤 4 次。向每个孔中加入 SureBlue Reserve TMB 单组分微孔板过氧化物酶底物（SeraCare），室温显色 90 秒。向每个孔中加入等体积的 1 N HCl 终止反应，然后使用 BioTek Synergy Neo2 酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。使用 GraphPad Prism 10 对所得数据进行分析，采用四参数逻辑曲线确定每种抗体的 _ED50 值。使用两批不同的蛋白质进行两次生物学重复实验，每次实验均进行技术重复。

假型病毒生产

如前所述 ^{60 , 61 , 62 , 63} ，我们制备了以全长 MARV、RAVV、DEHV、MLAV、EBOV 或 SUDV GP 为假型的 VSV。简而言之，将 HEK-293T 细胞接种于 10 cm 聚赖氨酸包被的培养皿中，并在 37 °C、5% CO ₂ 条件下培养过夜，直至细胞汇合度达到约 90-95%。用 DMEM 培养基洗涤细胞一次，然后将其置于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。按照制造商的建议，使用 Lipofectamine 2000 将 16-24 µg 全长 GP 构建体转染至细胞中，之后将细胞在 37 °C、5% CO ₂ 条件下孵育 20-24 小时。将细胞用 DMEM 洗涤 3 次，感染 VSV∆G/luc 病毒，并在 37℃、5% CO₂ 条件下培养。2 小时后，用 DMEM 洗涤细胞 5 次，然后将细胞置于添加了抗 VSV-G 抗体（I1 小鼠杂交瘤上清液，CRL-2700，美国典型培养物保藏中心，稀释 1:25）的 DMEM 培养基中，在 37℃、5% CO₂条件下培养 20-24 小时。培养结束后，收集上清液，离心澄清，用 0.45 µM 滤膜过滤，再用 100 kDa 超滤离心管（Amicon）浓缩。所得假病毒保存于-80℃直至使用。

假病毒中和试验

中和试验按先前描述的方法进行 ^{60 , 61 , 62 , 63 。简而言之，将 Vero E6 细胞以每孔 18,000 个细胞的密度接种于白色壁、透明底的 96 孔板中。细胞在 37℃、5% CO _{2 条件下培养过夜，直至汇合度达到约 80-90%。血清样品（起始浓度为 1:10）或单克隆抗体（起始浓度为 200 µg ml -1 ）用 DMEM 稀释，并以 1:3 的比例进行系列稀释。用 GP 假型化的 VSV 用 DMEM 以 1:5 至 1:250 的比例稀释，然后将等体积的稀释假病毒加入到稀释的单克隆抗体或血清中。假病毒-抗体混合物在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，移除 Vero E6 细胞的培养基，并将假病毒-抗体混合物加入细胞中。细胞在 37℃、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时后，向每个孔中加入等体积的含 20% FBS 和 2% PS 的 DMEM 培养基，并在 37℃、5% CO₂条件下继续孵育 20-24 小时。随后，向每个孔中加入等体积的 ONE-Glo EX（Promega），并在 37℃下恒温振荡孵育 5 分钟。使用 BioTek Synergy Neo2 酶标仪测量每个孔的发光值。}}

使用 GraphPad Prism 10 软件对数据进行标准化，以未感染细胞的相对光单位 (RLU) 值定义 100% 中和率，以未添加抗体的假病毒感染细胞的 RLU 值定义 0% 中和率。采用抑制剂浓度与标准化反应值斜率模型，根据标准化数据确定 ED ₅₀ 值。至少进行了两次生物学重复实验，每次实验均使用不同批次的假病毒和单克隆抗体。

使用真实马尔堡病毒进行噬斑减少中和试验

将 Vero E6 细胞以每孔 3 × ^{10⁵ 个}细胞的密度接种于 6 孔板中，并在含 10% FBS 和 1% PS 的高糖 DMEM 培养基中，于 37 °C、5% _{CO₂ 条件}下培养过夜，直至细胞汇合度达到 75–95%。次日，将单克隆抗体用含 2% FBS 和 1% PS 的高糖 DMEM 培养基（DMEM-2）稀释至起始浓度 100 µg/ml，然后用 DMEM-2 进行 ¹ :4 系列稀释。随后，将 100 µl 用 DMEM-2 稀释至 1,000 PFU/ml 的 MARV/Musoke 病毒加入到 100 µl 稀释后的抗体溶液中，并将病毒-抗体混合物于 37 °C 孵育 60 分钟。孵育结束后，向病毒-抗体混合物中加入 300 µl DMEM，并将 400 µl 该混合物加入 Vero E6 细胞中。将细胞与病毒-抗体混合物在 37 °C 下轻柔摇晃孵育 60 分钟，之后移除混合物，加入由 1%琼脂糖与含 2 mM 丙酮酸钠、1% PS 和 4% FBS 的 2× MEM 按 1:1 比例混合而成的初次覆盖层。将细胞在 37 °C、5% _CO₂ 条件下孵育 7 天。接下来，用由 1%琼脂糖与含 2 mM 丙酮酸钠、4% FBS 和 8%中性红溶液的 2× MEM 按 1:1 比例混合而成的覆盖层对细胞进行染色，并在 37 °C、5% CO₂ _条件下孵育 1 天，之后手动计数噬斑数量。通过将孔中的噬斑数除以含有 24 pg ml ^–1 抗体的孔中计数的噬斑数来确定每个孔的感染率百分比。 对每种抗体进行两次生物学重复实验，每次生物学重复实验进行一至三次技术重复实验，并使用 GraphPad Prism 10 中的 [抑制剂] 与归一化响应变量斜率模型，根据两次生物学重复实验的平均数据确定 _PRNT 50 值。

生物

首先将预水合的 AHC2 生物传感器浸入浓度为 10 ng ^µl⁻¹ 的 MR191 IgG（溶于 10 倍动力学缓冲液）中，直至发生 1 nm 的位移，以此评估稳定的 MARV GPΔMuc WT 胞外结构域与 MR191 的结合情况。然后，将包被 MR191 的生物传感器浸入浓度为 10 nM 的 MARV GPΔMuc 构建体（溶于 10 倍动力学缓冲液）中 300 秒，之后再次浸入 10 倍动力学缓冲液中。所有步骤均在 30 °C 下进行。使用 Octet Data Analysis HT 软件（v.12.0）进行基线校正，并使用 GraphPad Prism 10 进行可视化。

为了测定 MARV16 Fab 与 MARV GPΔMuc _WT 的亲和力，将生物素标记的 MARV GPΔMuc _WT 用 10× 动力学缓冲液稀释至 10 ng ^µl⁻¹ 的浓度，并加载到预先水合的链霉亲和素生物传感器上，使其发生 1 nm 的位移。然后将包被 MARV GPΔMuc _WT 的生物传感器浸入浓度为 100 nM 的 MARV16 Fab 溶液中（该溶液用 10× 动力学缓冲液稀释），并进行 1:3 的系列稀释，浸入时间为 300 秒。之后，将生物传感器再次浸入 10× 动力学缓冲液中 300 秒。所有步骤均在 30 °C 下进行。使用 Octet Data Analysis HT 软件 (v.12.0) 对所得数据进行基线校正和拟合，并使用 GraphPad Prism 10 进行可视化。

如上所述，对 MARV16、MR78 和 MR191 Fab 和 IgG 片段的结合情况进行了比较。将生物素标记的 MARV GPΔMuc _WT 固定在链霉亲和素生物传感器上后，将探针浸入 100 nM 的 Fab 或 IgG 溶液（用 10 倍缓冲液稀释）中 300 秒，然后浸入 10 倍动力学缓冲液中 300 秒。所有步骤均在 30 °C 下进行。使用 Octet Data Analysis HT 软件（v.12.0）进行基线校正，并使用 GraphPad Prism 10 进行可视化。

通过将生物素标记的 MARV GPΔMuc _WT （溶于 10 倍动力学缓冲液，pH 7.4）加载到链霉亲和素生物传感器上，使其发生 1 nm 的位移，从而研究了 MARV GPΔMuc 与 MARV16、MR78 或 MR191 IgG 在不同 pH 值下的结合情况。然后将加载了 MARV GPΔMuc 的生物传感器浸入溶于 10 倍动力学缓冲液（pH 7.4、6.5、5.5 或 4.5）的 IgG 溶液中 300 秒。使用 Octet Data Analysis HT 软件（v.12.0）对所得数据进行基线校正，并使用 GraphPad Prism 10 进行可视化。

如上所述，评估了 MARV GPΔMuc _WT 、EBOV GPΔMuc、裂解的 EBOV GP、SUDV GPΔMuc 和 SUDV GPΔMuc 与 MARV16、MR78、MR191 和 EBOV515 IgG 的结合情况。将 IgG 稀释至 10 ng µl⁻¹（溶于 10× 动力学缓冲液中 ^） ，然后将其加载到 AHC2 生物传感器上，使其发生 1 nm 的位移。之后，将加载了 IgG 的生物传感器浸入稀释至约 10 nM（溶于 10× 动力学缓冲液中）的 GP 溶液中 300 秒。所有步骤均在 30 °C 下进行。使用 Octet Data Analysis HT 软件（v.12.0）进行基线校正，并使用 GraphPad Prism 10 进行可视化。

为了评估 MARV16 与 MR78 或 MR191 与 MARV GPΔMuc _WT 的竞争性结合，将生物素标记的 MARV GPΔMuc _WT （稀释至 10 ng µl⁻¹ ^） 加载到预先水合的链霉亲和素生物传感器上。之后，将加载了 MARV16 的生物传感器浸入 200 nM 的 MARV16 IgG（用 10 倍动力学缓冲液稀释）中 300 秒。随后，将生物传感器浸入 100 nM 的 MR78、MR191 或 MARV16 IgG（用 10 倍动力学缓冲液稀释）中 300 秒，最后再次浸入 10 倍动力学缓冲液中 300 秒。所有步骤均在 30 °C 下进行。使用 Octet Data Analysis HT 软件（v.12.0）对所得数据进行基线校正，并使用 GraphPad Prism 10 进行可视化。

为了研究从 Alloy ATX 小鼠中发现的 MARV 抗体的表位结合，将生物素标记的 MARV GPΔMuc _WT 稀释至 10 ng ^µl⁻¹ ，并加载到预先水化的链霉亲和素生物传感器上，使其发生 1 nm 的位移。将加载了抗体的生物传感器浸入 200 nM 的饱和抗体（用 10 倍动力学缓冲液稀释）中 900 秒，然后浸入 100 nM 的竞争抗体和 25 nM 的饱和抗体（用 10 倍动力学缓冲液稀释）的混合溶液中 300 秒。所有步骤均在 30 °C 下进行。使用 Octet Data Analysis HT 软件（v.12.0）分析所得数据。其中，饱和抗体的响应值通过以下方式计算：用竞争抗体结合步骤最后 90 秒的平均响应值减去饱和抗体结合步骤最后 30 秒的平均响应值。然后，通过减去自身阻断的响应值对所得数据进行校正。结合百分比的计算方法是：将每对竞争抗体-饱和抗体的响应值除以饱和抗体单独与 MARV GPΔMuc _WT 结合的响应值。具有相互阻断关系的抗体对被认为是同一结合组的一部分。

体内攻毒试验

24 只豚鼠被随机分为 4 组（ 每组 6 只）。所有动物均腹腔注射 1000 PFU 的豚鼠适应性 MARV/Angola 病毒（溶于 100 µl PBS）。感染后 24、48 或 96 小时，分别腹腔注射 10 mg（约 20 mg/ ^kg ）MARV16 或同型对照单克隆抗体（MGH2）。分别于注射抗体后 24 小时和感染后 5 天（dpi）采集血样。每日记录动物的体重、体温和临床疾病评分，直至研究结束（感染后 29 天）。临床疾病评分标准如下：体重下降：0 分，较基线体重下降 0%至 4.99%；1 分，较基线体重下降 5%至 10.9%； 2，体重较基线下降 11%以上但小于 19.9%；3，体重较基线下降 20%以上。体温变化：0，无变化；1，变化 1.1°F 以上；3，变化 2.2°C 以上。呼吸困难：0，呼吸正常；3，呼吸急促；12，呼吸费力或濒死。反应性：0，活跃；2，轻度无反应，靠近时活跃；8，中度无反应，嗜睡，虚弱；15，濒死或卧倒。运动失调：0，无；2，明显。外观：0，活跃且警觉；1，毛发粗糙；3，毛发粗糙且弓背。眼部外观：0，正常；1，眼部分泌物；2，斜视（或斜视）。 3. 闭眼。总临床疾病评分由上述各类别的所有临床评分相加得出。 当动物达到安乐死标准（临床疾病总评分12-35分）时，经研究兽医批准，它们被实施了安乐死。

为了检测感染后 5 天（5 dpi）的马尔堡病毒（MARV）病毒载量，从每只动物采集 100 µl 血浆，与 150 µl PBS 混合，并用 750 µl TRIzol LS 试剂灭活病毒。随后，向样品中加入 10 µg 酵母 tRNA 和 ^10³ PFU 的 MS2 噬菌体。接着，向每个样品中加入 200 µl 氯仿，并在 2–8 °C 下以 12,000 g 离心 15 分钟。将上清液转移至 96 孔深孔板（Microtiter Deepwell 96），并使用 NucleoMag Pathogen 试剂盒（Macherey-Nagel）和 KingFisher Flex 仪器提取 RNA。提取的 RNA 保存于−80 °C 直至使用。使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR 预混液（ThermoFisher）进行 RT-qPCR，引物和探针靶向 MARV/Angola 的 GP 基因（MAGP 正向引物：CCAAACGATGGGCCTTCA；MAGP 反向引物：TCCTCCCCTTCTGTATACTCAACAT；MAGP FAM/MGB 探针：CAGGTGTACCTCCC）。使用 1:10 系列稀释的 ssRNA 标准品（10 ^{7 至 10 1 拷贝/5 µl）生成标准曲线，并进行 MS2 噬菌体检测作为内部提取和检测对照。每个样本进行两次技术重复。结果以每毫升血浆中的基因效率（GE）表示。}

为了测定 MARV16 的血浆浓度，在豚鼠注射抗体后 1 天采集血浆。将 MARV GPΔMuc _WT 用 PBS 稀释至 2 µg ^ml⁻¹ ，加入 Immulon 2 HB 96 孔平底板（ThermoFisher），并在 4℃下孵育过夜。第二天，用 PBST 洗涤板 3 次，用 Pierce Protein-Free (PBS)封闭缓冲液（ThermoFisher）在 2–8℃下封闭 1 小时，然后再次用 PBST 洗涤 3 次。接下来，将血浆样品用含 1% FBS 和 0.2% Tween 20 的 PBS 稀释 1:10、1:400 和 1:2000，加入孔中，并在 37℃下孵育 1 小时。将反应板用 PBST 洗涤 3 次，然后向每个孔中加入稀释度为 1:6000 的山羊抗人 IgG-HRP 偶联二抗（Millipore Sigma，溶于含 1% FBS 和 0.2% Tween 20 的 PBS 缓冲液中）。反应板在 37℃孵育 1 小时，并用 PBST 洗涤 3 次。向每个孔中加入 TMB 底物（ThermoFisher），显色 12 分钟，然后加入等体积的 2 _NH₂SO₄ 终止反应 _。 使用 BioTek 800 TS 分光光度计测量 450 nm 处的吸光度值。使用稀释至 200 ng/ml 的 MARV16（溶于 PBS）进行 7 次 ¹ :2 系列稀释，绘制标准曲线。采用四参数逻辑曲线拟合标准曲线，并用于计算血浆中 MARV16 的浓度。每个样本进行两次技术重复。

FcγRIIa 或 FcγRIIIa 激活检测

采用生物发光报告基因检测法，研究了人 FcγRIIIa 和 FcγRIIa 的抗体依赖性激活。将瞬时表达膜锚定野生型 MARV/Musoke GP 的 ExpiCHO 细胞（靶细胞）与不同浓度的单克隆抗体孵育。25 分钟后，加入稳定表达 FcγRIIIa 受体（V158 变体）或 FcγRIIa 受体（H131 变体）以及 NFAT 驱动的荧光素酶基因的 Jurkat 细胞（效应细胞）。FcγRIIIa 检测中效应细胞与靶细胞的比例为 6:1，FcγRIIa 检测中效应细胞与靶细胞的比例为 5:1。通过 NFAT 通路激活产生的荧光素酶信号进行定量分析。在 37°C、5% _CO₂ 条件下孵育 22 小时后，使用 Bio-Glo-TM 荧光素酶检测试剂，按照制造商的说明（Promega）用发光仪测量发光情况。

冷冻电镜样品制备和数据采集

为了制备 MARV GPΔMuc _WT – MARV16 Fab 复合物，将 100 µg MARV GPΔMuc _WT 和 150 µg MARV16 Fab 在 37 °C 下孵育 30 分钟，然后将复合物加入 100 kDa 离心过滤器中，用 TBS 洗涤 5 次，并浓缩至 5.5 mg ml ^–1 。在冷冻前，向 MARV GPΔMuc _WT – MARV16 Fab 复合物中加入 CHAPSO，使其最终浓度为 5.45 mM。将复合物添加到新鲜辉光放电处理的 2.0/2.0 UltraFoil 网格（200 目） ^{64 上} ，然后使用 Vitrobot MarkIV（ThermoFisher）在 100% 湿度和 23 °C 的条件下进行速冻，等待时间为 10 秒，压吸力为 0，压吸时间为 5 秒。数据采集在 FEI Titan Krios 透射电子显微镜上进行，该显微镜工作电压为 300 kV，配备 Gatan K3 直接探测器和 Gatan Quantum GIF 能量过滤器，工作模式为零损耗模式，狭缝宽度为 20 eV。使用 Leginon ⁶⁵ 软件进行自动数据采集，标称放大倍数为 ×105,000，像素尺寸为 0.829 Å，离焦范围为 -0.4 至 -3.0 µm，载物台倾斜角度为 0° 或 25°。剂量率调整为每秒每像素 15 次计数，每个视频以 40 秒 75 帧的速度采集。

冷冻电镜数据处理

使用 WARP ⁶⁶ 对视频帧进行对齐，并将像素尺寸下采样至 1.658 Å。使用 cryoSPARC (v.4.6.2) 进行显微镜 CTF 参数估计、粒子拾取和提取（盒大小为 256 像素 ^² ）。使用 cryoSPARC ⁶⁷ 进行无参考二维分类，以选择清晰的粒子图像。接下来，使用 cryoSPARC 进行从头算三维重建和异质精修，以选择清晰的粒子类别。然后，使用 cryoSPARC ⁶⁸ 进行三维精修，采用 C3 对称性的非均匀精修 ⁶⁸ 和逐粒子散焦精修。最后，使用 Relion ⁶⁹ 对粒子图像进行贝叶斯抛光，在此过程中，将盒大小调整为 512 像素 ² ，像素尺寸调整为 0.829 Å。在 cryoSPARC 中进行了另一轮非均匀精修，包括全局和逐颗粒散焦精修。接下来，使用包含 GP 残基 171–219 的掩模，在 Relion ^70,71 中以 tau 因子 10 进行聚焦三维分类，无需颗粒对齐。选择局部密度分辨率最高的颗粒，并使用包含 MARV GP 和 Fab 可变区的掩模，在 cryoSPARC 中以 C3 对称性进行局部精修。报告的分辨率基于 0.143 的黄金标准傅里叶壳相关性准则，并通过高分辨率噪声替代 ^72,73 对傅里叶壳相关性曲线进行了软掩蔽效应校正。

模型构建与改进

使用 UCSF ChimeraX ⁷⁴ 和 Coot ⁷⁵ 将 MARV GP（PDB 标识符： 6BP2 ）和 MARV16 Fab 的初始模型拟合到图谱中，其中 MARV16 Fab 的预测使用了 AlphaFold2（参考文献 ⁷⁶ ）。然后使用 Coot、Rosetta ^77 , 78 、ISOLDE ⁷⁹ 和 Phenix ⁸⁰ 构建并优化该模型，使其与图谱吻合。图表使用 UCSF ChimeraX 生成。

差示扫描荧光法

将原始和稳定的 MARV GPΔMuc 胞外结构域用 TBS 稀释，并按照制造商的建议与蛋白质热迁移缓冲液和染料（ThermoFisher）混合，使反应混合物中蛋白质的最终浓度为 0.25 µg ^ml⁻¹ 。将反应混合物加入 96 孔 qPCR 板（ThermoFisher），并用 MicroAmp 光学粘合膜（ThermoFisher）密封。使用 QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统（ThermoFisher）在 25 °C 至 99 °C 范围内测量荧光强度（ 激发_波长 ：470 ± 15 nm； 发射_波长 ：586 ± 10 nm）。使用 QuantStudio Design and Analysis Desktop 软件（ThermoFisher）和 GraphPad Prism 10 对数据进行分析和可视化。数据以荧光强度对温度的负一阶导数表示。通过对荧光强度关于温度的二阶导数进行计算，并对所得函数在四个相邻点上进行平滑处理，确定了 T m 值。使用不同批次的蛋白质，进行了四次生物学重复实验，每次生物学重复实验包含六个技术重复实验。

负染电子显微镜

如上所述，制备了 MARV GPΔMuc _WT –MARV16 Fab-MR78 Fab、MARV GPΔMuc _WT –MARV16 Fab–MR191 Fab、MARV GPΔMuc _WT –MARV7 Fab、MARV GPΔMuc _WT –MARV14 Fab、MARV GPΔMuc _WT –MARV18 Fab 和 MARV GPΔMuc _WT –MARV20 Fab 复合物。将纯化的 MARV GPΔMuc 突变体或 MARV GPΔMuc _WT –Fab 复合物用 TBS 稀释至 0.01 mg ^ml⁻¹ ，滴加到新鲜辉光放电处理的碳涂层铜网格上，并用 2% 甲酸铀酰染色。数据采集​​使用配备 Gatan Ultrascan 4000 4k × 4k CCD 相机的 120 kV FEI Tecnai G2 Spirit 显微镜，标称放大倍率为 ×67,000，并使用 Leginon ⁶⁵ 软件。离焦范围为 −3.0 至 −1.0 µm，像素尺寸为 1.6 Å。显微照片随后在 cryoSPARC ⁶⁷ 中处理，使用 PatchCTF 估计显微镜 CTF 参数，并使用 Blob picker 提取颗粒。颗粒提取后，进行无参考二维分类以选择清晰的颗粒图像。然后，使用选定的颗粒图像，应用 C3 对称性进行从头算三维重建和均匀精修。图像使用 UCSF ChimeraX ⁷⁴ 生成。

利用具有复制能力的 VSV-MARV/Musoke GP 进行抗体逃逸研究

这些实验在获得批准前，已由华盛顿大学生物安全委员会进行评估。复制型 VSV-MARV/Musoke GP（缺乏 VSV G 蛋白）的构建方法如前所述 ^{81 ，但进行了一些修改。将 BHK-21/WI-2 细胞接种于 6 孔板中，并在 37℃、5% CO ₂ 条件下培养过夜，直至细胞汇合度达到约 90%。然后，以约 3 的感染复数（MOI）用痘苗病毒 vTF7-3 株（美国典型培养物保藏中心，VR-2153）感染细胞 45 分钟。之后，去除病毒，并加入新鲜培养基（DMEM，10% FBS 和 1% PS）。使用 Lipofectamine 2000 将 VSV-MARV/Musoke GP 反基因组、VSV N、VSV P、VSV L 和 VSV G 构建体以 1:3:5:1:8 的质量比转染至细胞中。4 天后，收集上清液，离心澄清，并用 0.22 µm 滤膜过滤。将所得上清液加入到 6 孔板中过夜培养至 90-95% 汇合度的 Vero E6 细胞中。在病毒培养基（DMEM，5% FBS 和 1% PS）中加入浓度为 25 µg ml⁻¹ 的阿糖胞苷，以抑制残留痘苗病毒的生长。72 小时后，通过检测 GFP 表达和病毒细胞病变效应 (CPE) 来评估 VSV-MARV/Musoke GP 的复制情况。收集显示 GFP 表达和病毒 CPE 的孔中的上清液，离心澄清，用 0.22 µm 滤膜过滤，并储存于 −80 °C 直至使用。为了提高拯救病毒的感染滴度，将病毒在 Vero E6 细胞上进行连续传代，具体步骤如下。 将 400 万个 Vero E6 细胞接种于 10 cm 培养皿中，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养过夜，直至细胞汇合度达到约 90-95%。将拯救的病毒加入细胞中，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。之后，移除病毒并更换为新鲜的病毒培养基。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养 72 小时。之后，检测细胞的病毒细胞病变效应（CPE），并收集上清液，经离心澄清后，用 0.45 µm 滤膜过滤。取十分之一的上清液加入新的 Vero E6 细胞中。病毒传代 5 次，直至观察到明显的病毒 CPE，表明该病毒在 Vero E6 细胞中能够高效复制。}

为了分离单个 VSV-MARV/Musoke GP 克隆，将传代病毒加入到接种于 6 孔板中的 Vero E6 细胞中，并过夜培养至 90-95%汇合度。2 小时后，去除病毒，并在细胞上覆盖一层由 MEM、5% FBS、1% PS 和 1% SeaPlaque 琼脂糖组成的琼脂糖层。细胞培养 72 小时后，筛选单个噬斑，并将所得病毒在 12 孔板中培养至 90-95%汇合度的 Vero E6 细胞上进行扩增。然后，将两个单个克隆 2B2 和 2B4 按照上述方法在 15 cm 培养皿中培养至 90-95%汇合度的 Vero E6 细胞上进行两次传代。经过两次传代后，收集病毒上清液，离心澄清，用 0.45 µm 滤膜过滤，再用 100 kDa Amicon 超滤管浓缩 10 倍，最后储存于−80 °C 直至使用。病毒原液的感染滴度采用噬斑试验测定，具体步骤如下：将 Vero E6 细胞接种于 6 孔板中，过夜培养至汇合度达到 90–95%。将传代后的病毒用 DMEM 培养基进行系列稀释，然后加入 Vero E6 细胞中。细胞在 37 °C、5% CO₂ _条件下孵育 2 小时后，去除病毒，并用琼脂糖覆盖层代替。细胞在 37 °C、5% CO₂ _条件下继续孵育 72 小时。最后，用 2%多聚甲醛在室温下固定细胞 15 分钟，然后去除琼脂糖覆盖层。用 0.1% 结晶紫溶液对细胞进行染色，随后用 PBS 洗涤 3 次，之后手动计数斑块。

为了筛选逃逸突变体，将 Vero E6 细胞接种于 12 孔板中，并在 37℃、5% _CO₂条件下培养过夜，直至细胞汇合度达到 90-95%。将 MARV16（单独存在）、MARV16 与 MR78 或 MARV16 与 MR191 混合，用 DMEM 稀释至起始浓度为 100 µg/ ^{ml 的}总抗体，然后以 1:5 的比例进行系列稀释，最终浓度为 1.28 ng/µl ^。 将约 ^10⁶ PFU 的 VSV-MARV/Musoke GP 分离株 2B2 或 2B4 加入到系列稀释的抗体中，并将​​病毒-抗体混合物在 37℃下孵育 1 小时。然后将病毒-抗体混合物加入 Vero E6 细胞中，并在 37℃、5% _CO₂条件下孵育 72 小时。对细胞进行细胞病变效应（CPE）检测，收集抗体浓度最高且 CPE 达到 3%至 20%的孔中的上清液，离心澄清后用 0.45 µm 滤膜过滤。重复上述步骤，直至抗体浓度为 100 µg/ ^ml 的孔中 CPE 达到 3%至 20%时，再次收集上清液，离心澄清后用 0.45 µm 滤膜过滤，并于-80 °C 保存备用。

为了鉴定逃逸突变，使用 Zymo Quick-Viral RNA 试剂盒从储存的病毒上清液中提取病毒 RNA。cDNA 的合成方法如前所述 ^82,83 ， 使用 Turbo DNase 去除基因组 DNA (gDNA)，使用 Superscript IV 和随机六聚体引物合成单链 cDNA，使用 Sequenase 2.0 聚合酶合成双链 cDNA，并使用 AMPure XP 磁珠纯化所得 cDNA。使用 Illumina DNA 制备试剂盒构建测序文库，并在 Element Aviti 测序仪上进行 2 × 150 bp 的测序。使用 Trimmomatic (v.0.39) 84 对测序读段进行接头序列去除和质量控制，并使用 Geneious Prime 85 比对至 VSV-MARV/Musoke GP 基因组。使用 Geneious Prime 鉴定频率为 10% 或更高的变异体。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，请参阅本文链接的《 自然投资组合报告摘要》 。