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Safety, Efficacy, and Immunogenicity of a Salmonella Paratyphi A Vaccine
摘要
背景
甲型副伤寒沙门氏菌 （也称甲型副伤寒沙门氏菌）每年导致超过 200 万例肠热症病例。目前尚无获批的甲型副伤寒沙门氏菌疫苗。
方法
在一项双盲、随机、安慰剂对照试验中，我们采用受控人体感染模型评估了一种口服减毒活疫苗（CVD 1902）。英国健康成年人按 1:1 的比例随机分配接受两剂 CVD 1902 或安慰剂，两剂间隔 14 天。接种第二剂后 28 天，受试者经口接种甲型副伤寒沙门氏菌。主要终点为接种后 14 天内甲型副伤寒沙门氏菌感染的诊断。次要终点包括安全性和免疫原性。
结果
共有 72 名受试者被随机分组，其中 CVD 1902 组 34 人，安慰剂组 36 人接受了甲型副伤寒沙门氏菌（S. Paratyphi A）的攻击试验。受试者的中位年龄为 32 岁（范围：20 至 54 岁），其中 46%为女性。两组的不良事件发生率总体相似，未发现与疫苗相关的严重不良事件。CVD 1902 诱导了针对甲型副伤寒沙门氏菌 O 抗原的血清 IgG 和 IgA 抗体反应。安慰剂组未出现血清 IgG 或 IgA 抗体滴度的升高。在按意向治疗分析的人群中，CVD 1902 组 21% 的参与者在攻毒后 14 天内被诊断出甲型副伤寒沙门氏菌感染，而安慰剂组这一比例为 75% (P<0.001)，疫苗有效率为 73%（95% 置信区间 [CI]，46% 至 86%）。在按方案分析中，疫苗有效率为 69%（95% CI，42% 至 84%）。
结论
在受控的人体感染模型中，对感染甲型副伤寒沙门氏菌的健康英国成年人进行两剂 CVD 1902 疫苗接种后，受试者能够有效抵抗甲型副伤寒沙门氏菌感染，且未发现安全隐患。（由英国医学研究委员会资助；VASP ISRCTN 注册号： 15485902 。）
肠热是由伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）的伤寒和副伤寒血清型（也称伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌）A、B 和 C 引起的全身性发热性疾病。该疾病是严重的公共卫生问题，每年导致超过 10 万人死亡，并造成超过 800 万残疾调整生命年损失。 1 提供安全管理的饮用水（定义为现场可获取、不间断供应且无污染物的水）是控制肠热的有效途径，但仍有超过 20 亿人无法获得安全饮用水。 2 接种疫苗是另一种控制方法，伤寒结合疫苗的研发和应用是实现这一目标的重要一步。 3 然而，高达 30% 的肠热病例，即每年超过 200 万例，是由甲型副伤寒沙门氏菌引起的，目前尚无针对甲型副伤寒沙门氏菌的获批疫苗。 1
目前有多种针对甲型副伤寒沙门氏菌的疫苗正在研发中。 4 其中一种候选疫苗是 CVD 1902，这是一种由马里兰大学开发的口服减毒活疫苗。该疫苗是通过删除野生型甲型副伤寒沙门氏菌参考菌株 ATCC 9150 的 guaBA 染色体操纵子和 clpX 基因构建而成，I 期临床试验表明其安全性和免疫原性良好。 5 英国开展的一项再次感染试验表明，既往感染过野生型甲型副伤寒沙门氏菌可预防再次感染，这一发现进一步支持了减毒活疫苗的有效性。 6 口服疫苗相比注射疫苗还具有诸多优势，例如给药方便、生产工艺更简单。 7
由于副伤寒（也称副伤寒热）发病率相对较低，需要大量受试者进行现场试验，因此评估候选甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的有效性存在困难。 8,9 世界卫生组织近期认可将来自受控人体感染模型（也称人体挑战试验）的疫苗有效性数据与来自现场调查的安全性数据、免疫原性数据以及上市后有效性研究结果相结合，以支持甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的上市许可。 10,11 在本试验中，我们采用受控人体感染模型（即口服甲型副伤寒沙门氏菌）来评估 CVD 1902 疫苗在英国健康成年志愿者中的有效性、安全性和免疫原性。
方法
试验设计与监督
我们在英国的六个研究中心（分别位于牛津、伯明翰、南安普顿、布里斯托尔、谢菲尔德和利物浦）开展了这项 2b 期双盲、随机、安慰剂对照试验。所有参与者均签署了书面知情同意书，试验按照《赫尔辛基宣言》的原则进行。
参与者
本研究招募了 18 至 55 岁、无肠热病史的健康志愿者。志愿者需完成在线问卷调查，并通过电话访谈确认其既往病史。受邀参加现场访谈的志愿者将接受全面的评估，以确定其是否符合试验入组条件。完整的纳入和排除标准详见补充附录 。
参与者在其当地招募并接受随访。所有参与者均接种疫苗或安慰剂，并在牛津研究中心接受甲型副伤寒沙门氏菌的攻击试验。
审判程序
在入组当天，参与者按 1:1 的比例随机分配接受 CVD 1902 疫苗或安慰剂。采用不同区组大小的随机化列表。 2,4 疫苗的制备由一个非盲实验室团队完成。参与者的随机分组以及疫苗或安慰剂的给药由一个非盲临床团队完成，该团队不参与结果评估。试验期间，研究者和参与者均不知晓分组情况。分组揭盲计划在最后一位参与者完成挑战后第 28 天的访视后进行。
试验疫苗和安慰剂均采用两剂接种方案，两剂间隔 14 天。CVD 1902 疫苗以 30 毫升溶液（最小剂量为 2× 10¹⁰ 菌落形成单位）口服给药。安慰剂以 30 毫升碳酸氢钠溶液（1.3%重量/体积）口服给药。在接种疫苗或安慰剂前 1 分钟，受试者口服 120 毫升碳酸氢钠溶液以中和胃酸。每次给药后，受试者接受 30 分钟的监测，并在电子日记中记录症状，持续 7 天（第 0 至 6 天）。
在接种第二剂疫苗后约 4 周（预设窗口期为 23 至 60 天），受试者经口接种 1× 10³ 至 5× 10³ 菌落形成单位的野生型甲型副伤寒沙门氏菌 NVGH308 株（临床分离株 ED199）。该菌株于 2006 年从尼泊尔一名急性副伤寒患者体内分离得到，由 GeniBet BioPharmaceuticals 公司按照良好生产规范 (GMP) 生产。在摄入接种物前 1 分钟，受试者饮用 120 毫升碳酸氢钠溶液。接种后，受试者接受 15 分钟的监测，并被要求在 21 天内每天两次在电子日记中记录症状，包括体温。
症状在门诊进行管理。所有参与者在感染后 14 天内，每天在招募点接受临床评估并采集血培养样本。甲型副伤寒沙门氏菌感染的诊断依据预先设定的综合标准，即感染后 72 小时以上采集的血培养结果为甲型副伤寒沙门氏菌阳性，或持续发热（体温≥38°C）至少 12 小时。
确诊为甲型副伤寒沙门氏菌感染的受试者接受环丙沙星治疗 7 天或 14 天作为一线治疗；由于恢复期粪便样本阳性数量略有增加，试验期间环丙沙星的疗程从 7 天延长至 14 天。血培养阳性的受试者在血培养中鉴定出革兰氏阴性杆菌时开始治疗，随后进行确诊试验。临床诊断的受试者在记录到第二次发热时开始治疗。未确诊为甲型副伤寒沙门氏菌感染的受试者在感染后第 14 天开始接受环丙沙星治疗 7 天或 14 天。在完成抗生素治疗至少 1 周后，采集三次粪便培养样本（每次培养间隔至少 48 小时），以确认粪便中甲型副伤寒沙门氏菌的清除情况。参与者在挑战后第 28、90、180 和 365 天接受了额外的随访。有关试验设计和流程的更多详细信息，请参见补充附录 。
终点
主要终点是根据预先设定的复合标准（接种野生型甲型副伤寒沙门氏菌后 72 小时以上获得的甲型副伤寒沙门氏菌阳性血培养或持续发热至少 12 小时）在 14 天内诊断甲型副伤寒沙门氏菌感染。次要终点包括安全性、免疫原性以及接种后的临床和微生物学终点。安全性评估基于受试者在电子日记中记录的主动报告症状、接种后 90 天内发生的不良事件以及接种后 365 天内发生的严重不良事件。免疫原性终点包括首次接种后第 14 天和第 42 天血清中针对甲型副伤寒沙门氏菌 AO 脂多糖和 FliC（鞭毛蛋白）抗原的 IgG 和 IgA 抗体反应，采用内部标准化的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）进行评估。有关试验终点的更多详细信息，请参见补充附录 。
统计分析
基于先前采用相同受控人体感染模型和菌株进行的甲型副伤寒沙门氏菌感染挑战研究的数据，我们估计安慰剂组中约有 58%的参与者会在感染后 14 天内被诊断为甲型副伤寒沙门氏菌感染。 6,13 基于此估计，我们计算得出，每组需要 33 名参与者，才能使试验具有 90%的统计功效，以在双侧显著性水平为 0.05 的情况下，显示 CVD 1902 与安慰剂相比具有 70%的保护作用。
采用 Pearson 卡方检验评估了攻毒后 14 天内确诊甲型副伤寒沙门氏菌感染的受试者比例的组间差异。疫苗效力计算为 1 减去疫苗组与安慰剂组确诊甲型副伤寒沙门氏菌感染的受试者比例之比。疫苗效力分别在符合意向性治疗人群和符合方案人群中进行分析，所有免疫原性终点均基于意向性治疗进行分析。意向性治疗人群包括所有接受随机分组、接种两剂疫苗或安慰剂（无论试验组别）并在受控人体感染模型中成功攻毒的受试者。符合方案人群包括所有接受随机分组、接种两剂指定口服溶液（疫苗或安慰剂）并在受控人体感染模型中成功攻毒的受试者；受试者根据其接受的口服溶液进行评估。安全性人群包括所有至少接种过一剂疫苗或安慰剂，并在每次接种后提供所征求症状数据、提供至少一份粪便样本或两者兼有的参与者。
组间抗体滴度比较采用几何均值比值及其 95%置信区间进行评估。采用逻辑回归分析攻毒当日抗体水平与甲型副伤寒沙门氏菌感染诊断风险之间的关联。在免疫原性分析过程中，我们发现两名受试者的基线样本存在标签错误。因此，我们对免疫原性终点进行了敏感性分析，排除了这两名受试者的数据。根据基线抗 O IgG 滴度（≤148.5 vs. >148.5 EU/mL 和 ≤802.2 vs. >802.2 EU/mL）以及第二剂疫苗接种与攻毒之间的间隔时间（≤28 天 vs. >28 天），对疫苗效力进行了亚组分析。次要终点分析的 95%置信区间未进行多重性校正，因此不能替代假设检验。数据分析采用 R 软件 4.3.2 版本。
结果
参与者
从 2022 年 4 月至 2023 年 11 月，共有 1589 名志愿者接受了资格评估。在 171 名接受现场筛选的志愿者中，72 名符合入组条件，并被随机分配至 CVD 1902 组（35 名参与者）或安慰剂组（37 名参与者）。两组的基线特征相似（ 表 1 ）。
表1 参与者基线特征。
疫苗组有一名受试者在接种第一剂疫苗后退出研究，安慰剂组有一名受试者在接种第一剂疫苗后被研究者要求退出研究。共有 70 名受试者接受了两剂疫苗或安慰剂，并被纳入符合方案分析和意向性治疗分析（ 图 1 ）。一名被分配到安慰剂组的受试者接受了两剂疫苗；该受试者在意向性治疗分析中被纳入安慰剂组，在符合方案分析中被纳入 CVD 1902 组。
图 1 筛选、随机化和挑战。
疫苗安全性
接种第一剂疫苗后，疫苗组出现恶心、呕吐和全身不适的发生率高于安慰剂组（ 图 2 ）。大多数受试者报告的症状严重程度为轻度至中度（ 图 2 和补充附录表 S1）。接种第一剂疫苗或安慰剂后第 7 天，两组受试者出现生化和血液学指标异常的比例也大致相似，接种第二剂疫苗后第 7 天的指标也相似（表 S2 和 S3）。
图 2 接种疫苗或安慰剂后所询问症状的严重程度。
试验期间共报告了四例严重不良事件（疫苗组两例，安慰剂组两例）。研究者评估认为，所有严重不良事件均与疫苗或安慰剂无关（表 S4）。两组受试者的非预期不良事件发生率相似（表 S5）。
免疫原性
接种第一剂疫苗后第 14 天和第 42 天，血清中针对甲型副伤寒沙门氏菌 O 抗原的 IgG 和 IgA 抗体水平高于基线水平（ 图 3 和表 S7）。接种第一剂疫苗后，基线时抗 O IgG 几何平均滴度为 126 ELISA 单位/毫升（95%置信区间[CI]，66 至 241），接种后第 14 天升至 314 EU/毫升（95% CI，167 至 590）；基线时抗 O IgA 几何平均滴度为 20 EU/毫升（95% CI，16 至 26），接种后第 14 天升至 70 EU/毫升（95% CI，49 至 99）。接种第一剂疫苗后第 42 天（第二剂疫苗后 28 天），抗 O IgG 几何平均滴度与第 14 天相似（292 EU/毫升；95% CI，158 至 539），而抗 O IgA 几何平均滴度低于第 14 天（33 EU/毫升；95% CI，158 至 539）。 CI，24 至 45），但仍高于基线水平。安慰剂组中，第 14 天和第 42 天抗 O IgG 和 IgA 抗体滴度的几何平均值与基线水平相似。接种疫苗或安慰剂后，均未观察到针对甲型副伤寒沙门氏菌 FliC 抗原的 IgG 或 IgA 反应（图 S4）。在剔除两名标签错误受试者的数据后进行的敏感性分析中，结果与主要免疫原性分析的结果基本相似（表 S8）。
图 3 抗 O IgG 和 IgA 抗体反应。
在第 42 天激发试验前立即测得的抗 O IgG 和 IgA 抗体滴度以及抗 FliC IgG 和 IgA 抗体滴度，在最终感染甲型副伤寒沙门氏菌的受试者和未感染的受试者之间总体相似（图 S5）。未发现抗 O IgG 抗体滴度与诊断风险之间存在明显关联，但抗 O IgA 抗体滴度较高的受试者的风险似乎低于抗 O IgA 抗体滴度较低的受试者（图 S6）。
疫苗效力
根据预先设定的综合标准，在攻击后 14 天内（主要终点），CVD 1902 组有 7 名受试者（21%）诊断为甲型副伤寒沙门氏菌感染，安慰剂组有 27 名受试者（75%）诊断为甲型副伤寒沙门氏菌感染（P<0.001）（ 图 4 ）。在按意向性治疗分析中，疫苗有效率是 73%（95% CI，46%至 86%），在按方案分析中，疫苗有效率是 69%（95% CI，42%至 84%）（表 S9）。
图 4 诊断甲型副伤寒沙门氏菌感染的时间。
接种第二剂疫苗或安慰剂至进行病毒攻击试验的中位时间为 28 天（范围：26 至 85 天）。共有 68 名受试者在预设时间窗口内（接种第二剂疫苗后 23 至 60 天）接受了病毒攻击试验。另有 2 名受试者在接种第二剂疫苗后 85 天接受了病毒攻击试验；排除这 2 名受试者后，疫苗有效率仍为 72%（95% CI：44% 至 86%）。
根据基线抗 O IgG 抗体滴度和第二次接种疫苗与攻毒之间的时间间隔进行亚组分析。各亚组的疫苗效力相似（表 S10）。
在34名发生主要终点事件的受试者中，32名（94%）根据攻毒后72小时以上采集的阳性血培养结果确诊为甲型副伤寒沙门氏菌感染。另有2名受试者（均在安慰剂组）最初因持续发热而被诊断为甲型副伤寒沙门氏菌感染，但随后发现这两名受试者的血培养结果也呈阳性。
临床和微生物学终点
在确诊的受试者中，两组受试者的甲型副伤寒沙门氏菌感染临床表现相似。CVD 1902 组 29% 的受试者和安慰剂组 19% 的受试者出现与甲型副伤寒沙门氏菌感染相关的发热（体温≥38°C）。两组均无受试者被诊断为符合预设标准的严重肠热症（图 S1 和表 S6）。
CVD 1902 组从激发试验到确诊的中位时间为 7.0 天，安慰剂组为 6.1 天。两组从首次出现血培养阳性到首次出现持续血培养阴性的中位时间也相似（CVD 1902 组为 3.0 天，安慰剂组为 2.7 天）（图 S2）。激发试验 72 小时后粪便培养阳性的受试者人数，CVD 1902 组（34 例受试者中有 8 例；24%）低于安慰剂组（36 例受试者中有 18 例；50%）（图 S3）。
安慰剂组中有3名受试者在完成抗生素治疗后出现复发（定义为先前成功治疗后甲型副伤寒沙门氏菌菌血症的再次发生），另有7名受试者（疫苗组3名，安慰剂组4名）在完成抗生素治疗至少1周后粪便培养结果呈甲型副伤寒沙门氏菌阳性。所有这些受试者均再次接受抗生素治疗，并在试验结束时连续三次粪便培养结果均为阴性。
讨论
在这项随机、安慰剂对照试验中，我们使用受控的人体感染模型评估了一种候选甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的有效性。在按意向性治疗分析中，CVD 1902 组的甲型副伤寒沙门氏菌感染诊断风险比安慰剂组低 73%（95% CI，46% 至 86%）。
目前尚无获批的针对甲型副伤寒沙门氏菌的疫苗。FliC 和 O:2 脂多糖被认为是最有可能诱导保护性免疫反应的抗原，因为它们已被证明与针对其他肠道病原体的保护作用相关。 14 目前的试验表明，CVD 1902 可诱导针对甲型副伤寒沙门氏菌 O 抗原的血清学 IgG 和 IgA 反应。然而，尽管抗 O 抗体水平较高与保护作用之间存在一定的相关性趋势（尤其是 IgA），但攻毒前这些抗体的水平与预防感染之间并无相关性。
针对伤寒沙门氏菌的肌注疫苗试验表明，针对荚膜多糖 Vi 抗原的 IgA 和 IgG 抗体反应与感染保护作用相关。 15,16 与肌注伤寒沙门氏菌疫苗相比，口服减毒活疫苗的保护作用相关因素更难阐明。 17 在一项涉及两种口服减毒活疫苗（Ty21a 和 M01ZH09）的人体攻毒试验中，针对脂多糖的抗体反应与感染保护作用无关。 18 接种减毒活疫苗后对伤寒沙门氏菌的保护作用可能由涉及多种抗原的免疫反应驱动，而不仅仅由血清抗体驱动。事实上，先前已有研究表明，口服甲型副伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌疫苗能够诱导强烈的细胞介导免疫反应。 5,19
局部产生的黏膜抗体，以分泌型 IgA 的形式存在，可能在抵御甲型副伤寒沙门氏菌感染中发挥重要作用，正如其对其他肠道病原体（如霍乱弧菌和呼吸道病毒）的作用一样。 20,21 在目前的试验中，两组感染者的临床终点和微生物学终点总体相似。这些发现提示，CVD 1902 的保护机制可能位于黏膜水平。分泌型 IgA 可能通过直接阻断病原体与上皮细胞的黏附，或通过免疫排斥（例如，将病原体捕获在黏液中或通过肠蠕动清除）和抗体介导的凝集作用来促进保护，正如体外对鼠伤寒沙门氏菌所观察到的那样。 22 未来需要开展更多研究，以阐明接种疫苗后的粘膜反应，以及体液和细胞免疫的其他方面，从而建立针对甲型副伤寒沙门氏菌的保护相关性。了解这种相关性将加速疫苗的开发、评估，并有可能获得许可。
本试验中显示的疫苗效力高于三种已获许可的伤寒沙门氏菌疫苗，这三种疫苗均在伤寒沙门氏菌控制的人体感染模型中进行了评估：Ty21a（疫苗效力为 35%；95% CI，-5 至 60）、肌注 Vi-破伤风类毒素结合疫苗（54.6%；95% CI，26.8 至 71.8）和 Vi 非结合疫苗（52.0%；95% CI，23.2 至 70.0）。 15,18 这三种疫苗在伤寒沙门氏菌流行地区开展的 3 期临床试验中均显示出更高的效力。 23 然而，副伤寒沙门氏菌 A 控制的人体感染模型使用的攻击剂量低于伤寒沙门氏菌模型，因此引起的症状更少或更轻，尽管菌血症的发生率相似，但受试者发热的发生率更低。 13 对此差异的一种假设是，甲型副伤寒沙门氏菌（S. Paratyphi A）引起的无症状感染和少症状感染的数量远高于伤寒沙门氏菌（S. Typhi），后者通过无症状粪便排毒持续传播，而无需住院治疗。目前的试验表明，接种疫苗可能降低接触病原体人群的粪便排毒率，从而可能中断传播链或降低传播风险。
当前试验的局限性包括受控人体感染模型的虚构性，以及纳入的是英国健康成年人而非目标人群——甲型副伤寒沙门氏菌流行地区的学龄儿童（表 S11）。未来需要开展涉及此类地区儿童的现场试验。在病原体流行地区使用受控人体感染模型评估 CVD 1902 疫苗，也是评估既往免疫对疫苗反应影响的有效中间步骤；目前正在开展此类研究。然而，其他已用于疫苗研发的受控人体感染模型，例如 Vi 多糖-破伤风类毒素结合疫苗、R21/Matrix-M 疟疾疫苗和灭活全细胞单价霍乱毒素 B 亚单位疫苗，均显示出与现场试验相似的效力。 24-29
针对甲型副伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的二价疫苗是甲型副伤寒沙门氏菌疫苗获得许可的最可能途径，因为此类疫苗能够全面预防肠热病。目前 CVD 1902 的配方需要当日配制；因此，需要一种适合临床使用的配方才能获得许可。这种配方可以包括口服的减毒活伤寒疫苗。另一种选择是肌内注射的二价结合疫苗，该疫苗将甲型副伤寒沙门氏菌 AO:2 结合疫苗与伤寒结合疫苗结合。目前已有两种二价结合疫苗候选产品完成了 I 期临床试验，但尚未进行疗效评估，尽管相关研究已在计划中。 30,31
在本次试验中，CVD 1902 在受控的人体感染模型中显示出对甲型副伤寒沙门氏菌的有效性。这些发现是研发急需的甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的重要一步。
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