来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价 Q5A（R2）

为推动药品注册技术标准与国际接轨，经研究，国家药品监督管理局决定适用《Q5A（R2）：来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价》国际人用药品注册技术协调会指导原则（以下简称Q5A（R2）指导原则）。现就有关事项公告如下：

一、申请人需在现行药学研究技术要求基础上，按照Q5A（R2）指导原则的要求开展研究；自2025年5月21日开始的相关研究（以试验记录时间点为准），均适用Q5A（R2）指导原则。

二、相关技术指导原则可在国家药品监督管理局药品审评中心网站查询。国家药品监督管理局药品审评中心负责做好本公告实施过程中的相关技术指导工作​​​​⁠⁠​​⁠⁠​⁠⁠​​⁠。

特此公告。

国家药监局

2024年5月21日

人用药品技术要求国际协调理事会

ICH协调指导原则

来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价

Q5A（R2）

草案版本
于年/月/日签署

当前为征求公众意见阶段

本指导原则由ICH专家工作组制定，并根据ICH流程征求了监管方的意见。在该流程的第4阶段，建议将最终草案提交ICH地区的监管机构采用。

Q5A（R2）
文件历史

Q5A

Q5A修订版

Q5A（R1）修订版

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ICH协调指导原则

来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价

Q5A（R2）

ICH共识指导原则

目录

1. 简介 8
2. 潜在的病毒污染源 10

2.1 主细胞库可能存在的病毒

2.2 生产过程中可能引入的外源病毒

3. 细胞系检定：病毒检测

3.1 对主细胞库、工作细胞库及达到体外细胞传代限次的生产用细胞进行病毒检测

3.1.1 主细胞库

3.1.2 工作细胞库

3.1.3 达到体外细胞传代限次的生产用细胞

3.2 对病毒检测和鉴别方法的建议

3.2.1 逆转录病毒检测

3.2.2 体外细胞培养感染性试验

3.2.3 体内检测

3.2.4 特异性病毒检测

3.2.5 分子生物学方法 20

3.3 细胞系的可接受性

4. 未加工收获液的病毒检测
5. 对纯化后产品进行病毒清除研究和病毒检测的依据和行动计划
6. 病毒清除工艺的评价和表征

6.1 用于评价和表征病毒清除的病毒选择 30

6.1.1 相关病毒和模型病毒 30

6.1.2 其他考虑

6.2 病毒清除评价和表征的设计和影响

6.2.1 设施和人员

6.2.2 生产工艺的缩小模型

6.2.3 渐进式病毒清除分析

6.2.4 确定物理去除或灭活

6.2.5 灭活评估

6.2.6 层析柱的功能和再生

6.2.7 特别注意事项

6.3 病毒清除研究的说明

6.4 病毒清除研究的局限性 40

6.5 统计 41

6.6 应用先验知识评价病毒清除情况 41

6.7 病毒清除的再评价

7. 连续制造的考虑要点

7.1 连续制造中的病毒安全性

7.2 连续制造中病毒清除的一般考虑

7.3 连续制造中病毒清除的特殊考虑

7.3.1 与较长的细胞培养时间相关的潜在风险

7.3.2 病毒清除研究方法

8. 总结
9. 术语表
10. 参考文献 54

附件1：病毒清除研究用病毒的选择

1.1 实用的“模型”病毒举例

1.2 已用于病毒清除研究的病毒举例

附件2：评估病毒和病毒下降因子的统计学考虑 62

附件3：确定病毒清除研究中下降因子的计算 64

附件4：每剂量病毒颗粒的估算 65

附件5：应用先验知识（包括内部经验）以减少特定产品验证工作的举例 67

5.1 简介 67

5.2 溶剂/去污剂或单独去污剂灭活 68

5.3 低pH孵育

5.4 病毒过滤 72

附件6：基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品 76

6.1 简介 76

6.2 病毒检测 77

6.3 病毒清除 79

1. 简介

本指导原则描述了生物技术产品的病毒安全性评价（包括病毒清除和检测），并概述了此类产品上市申请时应提交的研究资料。生物技术产品包括生物治疗药物和来源于人或动物（例如，哺乳动物、鸟类、昆虫）细胞系的特定生物制品。本文件所述“病毒”不包括非常规传染性因子，如与哺乳动物朊病毒（如疯牛病（BSE）、瘙痒病（scrapie））相关的传染性因子。鼓励申请人与相应监管机构讨论不在本指导原则范围内的与疯牛病相关问题。

本指导原则涵盖利用重组DNA技术并通过体外细胞培养生产的产品，如细胞因子、单克隆抗体（mAbs）和亚单位疫苗。本指导原则还适用于某些能够开展病毒清除但不会对产品产生负面影响的特定基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品（例如，病毒疫苗和基因治疗产品）。此类产品可能包括病毒载体，如使用瞬时转染或稳转细胞系、或使用重组病毒感染生产的腺相关病毒（AAV）。还包括病毒载体衍生产品，例如杆状病毒表达的病毒样颗粒（VLPs）、蛋白质亚基和基于纳米颗粒的蛋白质疫苗和治疗药物。AAV基因治疗载体包括依赖辅助病毒，如单纯疱疹病毒或腺病毒，生产的产品。关于基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品的具体指南见附件6。

灭活疫苗和含自我复制因子的减毒活疫苗不在本指导原则范围内。细胞治疗不在本指导原则范围内，但相关原则可在适用的情况下参考使用（如生物起始原材料）。

由于污染风险以及受到替代、减少和优化（3R）动物使用的全球倡议的影响，不再鼓励使用在腹水内培养的杂交瘤细胞来生产原材料。此类情况，应遵循本指南的原则，包括采用下一代测序（NGS） 代替体内检测。

病毒污染的风险是所有来源于细胞系的生物技术产品所关注的问题，需要降低，因为这种污染在临床上可产生严重的后果。这种风险可能来自源细胞系（细胞基质）本身的污染，也可能来自生产过程中偶然引入的外源病毒。然而，细胞系来源的生物技术产品既往尚未发生过传播病毒的情况。这些产品的病毒安全性通过实行全面的病毒检测程序和评估生产过程中实现的病毒去除和灭活得到切实保证，如下所述。应用三条互补的原则控制生物技术产品的潜在病毒污染：

• 选择和检测细胞系以及其他原材料（包括培养基组分），以确保其不含非预期感染性病毒
• 评估生产工艺清除外源性和内源性病毒的能力
• 在生产的适当步骤对产品进行检测，以确保产品未受感染性病毒的污染。

基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品生产过程中使用的一些病毒清除步骤可能无法达到与重组蛋白相同的效果。在这种情况下，应考虑实施进一步降低风险的策略，如原材料的处理和广泛的病毒检测（见附件6）。

病毒检测具有其局限性。例如由于统计原因，检测低浓度病毒的能力取决于样本量。因此，没有单一的方法能够确定产品的病毒安全性。多数情况下，要确保终产品中没有感染性病毒，不能单凭是否能够直接检测到病毒而定，还需证明纯化工艺能够去除和/或灭活（清除）病毒。

在不同生产步骤中开展的病毒检测的类型和程度以及病毒清除研究取决于多种因素，应根据具体情况和步骤具体分析。应考虑的因素包括：细胞系的来源、细胞库表征和检定程度、所测定病毒的性质、培养基组成、培养方法、设施和设备设计、细胞培养后病毒检测结果、生产工艺清除病毒的能力和产品类型及其预期临床用途。

应根据特定产品及其生产工艺调整本指南推荐的方案。此外，还应对用于确保病毒安全性的方法作出合理解释并说明依据。除了提供详细数据外，还应提供一份病毒安全性评估的全面总结。该总结应包含病毒安全性研究的各方面内容和用于预防病毒污染的策略的概述。

2. 潜在的病毒污染源

生物技术产品的病毒污染可能来自细胞系的原始来源或在生产细胞系和/或细胞库构建过程中以及生产过程中偶然带入的外源病毒。使用充分表征的细胞库和病毒种子可降低病毒污染的风险。在附件6中讨论了从主病毒种子（MVS）或工作病毒种子（WVS）中可能引入的潜在外源病毒和控制。此外，用于生产附件6所述产品（生产病毒）的病毒也被视为工艺相关杂质。

2.1 主细胞库可能存在的病毒

外源病毒污染物可通过多种途径被引入主细胞库（MCB），例如：（1）从受感染动物制备的细胞系；（2）使用病毒建立细胞系；（3）使用受污染的生物试剂（例如用于选择的抗体）或用于细胞培养的原材料（例如动物或人血清和猪胰蛋白酶）；或（4）细胞处理和建库过程中受到的污染。

细胞的内源性逆转录病毒在传代过程中被保留下来。内源性病毒序列可能组成性表达，也可能被激活从而产生感染性或有缺陷的病毒颗粒。细胞也可能含有潜伏性或持续的病毒（例如疱疹病毒）。

2.2 生产过程中可能引入的外源病毒

外源病毒可通过多种途径污染生产过程，包括但不限于以下途径：（1）在细胞培养期间使用受污染的生物原材料或试剂，如动物血清组分；（2）使用受污染的病毒种子生产（见附件6）；（3）在下游纯化过程中使用受污染的原材料或试剂，例如用于产品选择或纯化的哺乳动物来源的抗体偶联亲和树脂；（4）在处方配制中使用受污染的辅料；（5）来自环境的污染，包括非生物原材料的储存或细胞培养和培养基处理期间所受的人为污染。

对细胞培养参数（例如，细胞生长和活率）的监测有利于早期发现潜在的外源病毒污染。制造商应尽可能避免在生产过程中使用人和动物来源的原材料（例如人血清、牛血清、猪胰蛋白酶）。在无法做到这一点的情况下，使用人和动物来源的原材料应基于相应的风险提供相关证明文件或资质予以支持。应提供包括诸如原产国、组织来源、材料生产过程中应用的病毒灭活/去除步骤以及对原材料进行的病毒检测类型等信息。基于风险评估，如必要应尽可能在灭活前开展病毒检测。

应尽可能对引入外源病毒风险高的生物材料（如动物或人血清或猪蛋白胰酶）进行病毒灭活处理，如电离辐照。其他降低病毒风险的策略还包括细胞培养基或基质的补充处理等，如病毒过滤、高温短时处理或UV-C辐照。

3. 细胞系检定：病毒检测

适当的病毒检测是确定细胞系是否适用于生物技术产品生产的重要部分。

3.1 对主细胞库、工作细胞库及达到体外细胞传代限次的生产用细胞进行病毒检测

对生产用主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）和达到体外细胞传代限次（LIVCA）的细胞进行一次病毒检测的建议详见表1。

3.1.1 主细胞库

应对MCB进行内源性病毒和外源性病毒污染的全面筛查。对于含一种或一种以上人或非人灵长目动物配体的异种杂交细胞系，由于这些细胞引起的病毒污染可能造成特殊的危害，应进行人或非人灵长目病毒的测定。

外源病毒的检测应包括表1中所述的广谱和特异性病毒检测试验。鼓励采用NGS等新方法检测多种外源病毒。为确保测出污染性病毒，应基于风险评估开展检测，检测方法应考虑亲本细胞系的来源和历史，以及在生产细胞系构建和MCB建库过程中暴露于人或动物来源材料的可能性。另外，不对MCB进行全检，而对WCB进行全面检测来作为替代手段也是可以的。

3.1.2 工作细胞库

应根据表1对每个WCB开展外源病毒检测。在适当的情况下，如果已对MCB进行相应的外源病毒检测，并且对WCB来源的培养至己达到或超过LIVCA的细胞进行过外源病毒检测，则不必再对WCB开展类似检测。

3.1.3 达到体外细胞传代限次的生产用细胞

应基于有代表性的缩小模型和/或在中试规模或商业化规模条件下达到或超过设定的体外细胞胞龄的生产细胞的数据来确定用于生产的LIVCA。一般通过扩增WCB或MCB得到LIVCA细胞。应对 LIVCA 细胞进行一次病毒评估，有些病毒可能在 MCB 和/或 WCB 中未检测到。针对用于生产的达到LIVCA的细胞应进行一次适当的检测（如表1所示），以进一步确保生产工艺不会导致内源病毒诱导、潜伏性病毒再激活或低水平或生长缓慢的病毒扩增。如果此时检测到外源病毒，应对工艺流程，包括MCB和WCB，进行仔细检查以确定污染源。达到LIVCA的细胞也称为生产终末细胞（EOPC）。

3.2 推荐的病毒检测和鉴定方法

对内源病毒和外源病毒的检测方法有很多。表2列举了一些检测方法。推荐采用此类检测方法，但表中所列方法并不能涵盖全部也并非固定不变。大部分适用的方法会随科学的发展而变化，因此在有充分数据支持的情况下可采用替代方法。应依据病毒风险评估制定全面的检测策略，包括以下考虑要点：细胞系来源；传代历史；在细胞系构建、细胞库制备以及生产过程（例如，可灭活或去除病毒的步骤）中使用的生产用原材料和试剂。该策略应根据风险评估适当增加其他检测。例如，如果存在特异性病毒的可能性相对较高，除非另有说明，否则应包括针对该病毒的特定检测或其他方法。应包括适当的对照，以证明有足够的检测灵敏度和特异性。此外，在适用的情况下，还应考虑潜在的基质干扰。

以下简要介绍制造商应使用的一般框架，用以开发一个全面的针对特定（或适当）产品和生产工艺的病毒检测方案。检测策略应随附检测方法的适用性说明。

3.2.1 逆转录病毒检测

细胞系应进行逆转录病毒表征。应对MCB和用于生产的培养至或超过LIVCA的细胞进行逆转录病毒检测。这些检测包括通过直接接种细胞上清液或细胞共培养进行的感染性测定、使用无细胞上清检测逆转录酶（RT）活性和通过透射电子显微镜（TEM）评估细胞病毒颗粒。TEM还能检测其他试剂，因此通常被推荐用于细胞库表征。

如果细胞系会产生逆转录病毒颗粒（常出现在一些来源于啮齿类动物、昆虫和鸟类细胞系），RT活性是可以预料的，因此可能不需要进行基于PCR的RT测定（例如，产品增强的逆转录酶活性（PERT）检测法 ）。应采用 TEM 确定所含逆转录病毒颗粒的类型（例如 A 型和 C 型）。为了确认内源性逆转录病毒颗粒是否具有感染性，应使用相关的允许细胞（如Mus dunni一般用于鼠逆转录病毒检测，SC-1 细胞用于单嗜性鼠逆转录病毒检测），采用检测逆转录病毒灵敏的测定法（如PERT测定法，肉瘤-阳性、白血病-阴性（S⁺L^–）测定法，或XC空斑试验）进行感染性试验。

如果不知道细胞系是否产生逆转录病毒颗粒，则应对细胞进行TEM检测，并对澄清的上清液进行RT测定（例如 PERT测定法）。基于PCR的RT测定法极具应用价值，原因在于其检测逆转录病毒的RT活性具有高灵敏度；然而，RT活性可能与感染性或非感染性逆转录病毒有关。由于某些细胞DNA聚合酶可导致RT阳性结果，在确认RT活性（由于逆转录病毒污染）或阳性TEM结果后，应进一步开展允许细胞的逆转病毒感染性检测，包括采用人细胞系和检测逆转录病毒灵敏的测定法。

判读逆转录病毒检测结果时应将所有可用数据纳入考量。基于第3.3节和第5节中讨论的风险评价，表达内源性逆转录病毒颗粒的细胞系亦可用于生产。

无需对已充分表征内源性逆转录病毒的细胞系（例如中国仓鼠卵巢（CHO）、NS0、Sp2/0和 Vero 或其他基于先验知识的细胞系）进行化学诱导研究。然而，此类研究可能有助于评价新的细胞基质是否存在未知的诱导的内源性逆转录病毒。此外，基于风险评估，对潜伏的DNA病毒（例如，人类细胞中的疱疹病毒）和潜伏的RNA病毒（例如，昆虫细胞中的诺达病毒）开展诱导研究也可能是适用的。这些研究将有助于对来源于新细胞基质产品的病毒检测和清除策略提供依据。

3.2.2 体外细胞培养感染性试验

进行体外检测时，应将供试品（见表2）接种到多种指示细胞培养物中，以确保能较为广泛地检测到人和相关动物病毒。指标细胞系组应包括来源物种的细胞系、人类二倍体细胞（如MRC-5）和猴肾细胞系（如Vero）。也可纳入其他细胞系。检测用细胞应依据待测细胞基质的物种来源的风险评估而选择。

感染性试验和待测样本的特性应根据细胞的来源或细胞处理过程中可能存在的病毒类型而定。应根据现有的区域法规和指南，监测指示细胞培养物中的致细胞病变、红细胞吸附或红细胞凝集病毒。对于MCB、WCB和LIVCA的检定，应开展28 天的允许细胞检测，且每两周至少进行一次亚传代。

NGS或其他分子生物学方法可作为补充或替代检测。这可解决体外细胞培养感染性试验的一般局限性（如细胞系对感染物的易感性）和生产系统的特定局限性（如供试品介导的干扰或毒性）。

3.2.3 体内检测

可依据风险评估开展体内检测，评估应考虑细胞库的构建和历史以及检定策略。然而，基于先验知识，无需对广泛使用的已充分表征的细胞系（如 CHO、NS0 和 SP2/0）开展体内测试。基于风险的考虑包括先前对亲本未转染的细胞系进行的体内病毒检测或NGS检测，以及对来源于亲本细胞库的MCB的控制。还应考虑对来自同一亲本细胞库的其他MCB进行病毒安全性检测的先验知识，包括用于建立MCB的方法。如果WCB是在经批准的受控条件下制备的，则通常不需要再对其进行检测。对于LIVCA细胞，根据先验知识和其他基于风险的考量，也可能不需要进行检测。

如果仍有风险，可考虑保留检测或用非靶向NGS替代，以检测MCB构建期间或细胞培养至LIVCA阶段期间可能引入的病毒。

体内检测可能包括将供试品（见表2）接种到哺乳期小鼠、成年小鼠和鸡胚中。应监测动物的健康状况，如有异常应进行调查以确定原因。

由于非靶向NGS在病毒检测方面的广度和灵敏度以及体内检测的局限性，鼓励将非靶向NGS作为体内检测的替代方法。此外，其还可促进替代、减少和优化动物试验使用的全球倡议的推进。

3.2.4 特异性病毒检测

待检测特异性病毒的列表是基于病毒污染风险评估确定的，其还考虑（但不限于）了细胞的来源和潜在的病毒污染源（例如，生物原材料，尤其是人或动物来源的材料）。对于暴露于人或动物来源的原材料（如牛血清和猪胰蛋白酶）的细胞系，应进行人、牛和猪病毒检测。对于啮齿类动物源性细胞系或暴露于啮齿动物材料的细胞系，则采用核酸扩增技术（NAT）或小鼠、大鼠或仓鼠的抗体产生试验来检测种属特异性病毒。当存在暴露于特定种属病毒的可能性时，应开展这类检测。例如，啮齿类动物来源的细胞系中存在啮齿类动物病毒，或通过啮齿类动物的传代和使用可能来自啮齿类动物材料的试剂产生的细胞系，可以通过将供试品（见表2）接种到无特定病原体的动物（例如小鼠、大鼠和仓鼠）中， 随后对特定病毒的抗体进行检测。

这种试验包括：小鼠抗体产生（MAP）试验、大鼠抗体产生（RAP）试验和仓鼠抗体产生（HAP）试验。表3讨论了目前在抗体产生试验中筛查出的病毒。

NAT（如PCR检测或靶向、非靶向NGS或其他分子生物学方法）可用来替代表3中所述的动物试验，且无需开展头对头比较。

3.2.5 分子生物学方法

NAT和NGS等分子生物学方法可用于病毒检测。NGS适用于已知和新型病毒的广谱（非靶向）检测。NGS也适用于通过测序策略或生物信息学分析对病毒进行靶向检测。非靶向NGS可用来替代体内检测，补充或替代体外细胞培养检测，在证明方法达到其预期目的的基础上无需进行头对头比较。由于检测体系的试验终点不同，并且与NGS对已知和未知病毒的广泛检测能力相比，体外和体内方法的病毒检测广度存在局限性，因此不建议进行头对头比较。体外和体内检测的结果依赖于在特定检测系统中的病毒复制和生物学特性，这限制了检测的广度。用NGS替代体内检测也符合替代、减少和优化动物试验使用的全球倡议。

NATs（如基于PCR的方法）可用于病毒特异性检测。靶向或非靶向NGS可用于替代大量PCR法进行病毒特异性检测，且无需头对头比较。这也有助于克服病毒变异检测的局限性。应对阳性结果进行研究，以确定检测到的核酸是否与感染性病毒相关。

3.2.5.1 核酸扩增技术

NATs，如基于PCR的方法，通常单独使用或以多重形式使用，以检测已知病毒或已知密切相关病毒家族的病毒序列。这些分子生物学方法可用于补充因检测干扰受限的细胞培养检测法，还可作为在感染性试验细胞培养中无法生长的特异性病毒检测的有效工具。NAT还适用于广谱的病毒检测（例如，简并PCR），但是特异性可能会降低。由于方法特异性，多种病毒特异性的PCR检测可能被用于检测更广泛的病毒，而这些病毒也可以采用单一的更通用的生物学方法检测到。应针对NAT检测方法的预期用途进行适当的验证。包括方法验证及基质特异性验证（如适用）。

3.2.5.2 下一代测序

NGS（也称为高通量测序）已证明具有广谱病毒检测的能力。NGS可以提供明确的病毒检测的灵敏度和广度，并减少动物的使用和缩短检测时间。非靶向NGS可以替代体内检测，对未知或非预期的病毒种类进行广谱病毒检测，且无需进行头对头比较。

非靶向NGS也可以在未进行头对头比较的情况下，补充或替代体外细胞培养试验，以检测已知和未知或非预期的病毒。这可以解决体外细胞培养感染性试验的一般局限性（例如，细胞系对感染的易感性）和生产系统的特定限制（例如，供试品介导的干扰或毒性）。

NGS可根据已知病毒的序列信息对其进行靶向检测。另外，NGS生物信息学分析可靶向检测特异性病毒。

NGS（靶向或非靶向）可替代病毒特异性PCR检测和啮齿类动物抗体产生试验（第3.2.4节），而无需进行头对头比较。采用NGS替代体内检测也符合替代、减少和优化动物试验使用的全球倡议。

可考虑使用NGS进行细胞系表征或细胞库、病毒种子或未加工收获液检测。这在因缺乏对病毒载体的有效中和（见附件6）或由产品或培养基成分引起的毒性而导致的检测干扰的情况下尤为有用。在此类应用中，NGS可用于分析所有基因组病毒核酸（基因组学）、病毒mRNA（转录组学）或包膜病毒基因组（病毒组学）。在分析细胞培养衍生材料时，从细胞中制备的核酸用于基因组学和转录组学，而细胞培养上清液或无细胞病毒制备物则用于病毒组学。应提供选择这些不同策略的依据。

在应用NGS对已知和新型病毒进行灵敏的和广谱的检测时，需要考虑NGS工作流程中的几个关键步骤：（1）样品预处理（如开展）和病毒富集步骤，可能需要根据样品材料的类型最大限度地检测病毒；（2）病毒核酸提取（从包膜和无包膜颗粒）和文库制备（DNA和RNA病毒）的效率；（3）选择合适的测序平台进行灵敏的病毒检测；（4）利用广谱的病毒检测策略，针对多样性数据库（具有不同病毒家族病毒序列）进行生物信息学分析。可能需要采取后续策略来确认检测到的病毒特异性信号，以便与数据库中可能存在的非病毒序列区分开来。

应使用合适的参比物质进行方法确认和验证，以评估工作流程中所涉及不同步骤的性能，并证明病毒检测的灵敏度、特异性和广度。这可包括使用当前可用的具有不同物理（大小、有包膜和无包膜）、化学（低、中和高抗性）和基因组（DNA、RNA、双链和单链、线性、环状）特征的病毒的参比病毒试剂/组合，以评估整个NGS工作流程或特定步骤的性能。应使用具有不同病毒序列的综合病毒数据库进行广谱病毒检测。其他类型的参比物质也可用于评估特定技术和生物信息学步骤。

对于所使用的任何NGS方法，都应提供验证/确认材料以支持其在申请中的预期用途。这包括用作替代方法时的方法验证和基质特异性验证。当用作补充方法时，包括方法确认和基质特异性验证。方法验证需要预定义的性能标准，而方法确认仅评估方法的性能特征。NGS用作限度检测时，用于方法验证/确认的性能特征（特异性/检测广度和灵敏度）应参考ICH Q2。

3.3 细胞系的可接受性

生产用的某些细胞系含有内源性逆转录病毒、其他病毒或病毒序列，这些病毒可能会被重新激活为感染性病毒。在这种情况下，第5节中介绍了推荐的生产行动计划。对于含有内源性逆转录病毒以外的病毒的细胞系的可接受性，应由相应的监管机构根据产品的收益及其预期临床用途的风险-获益分析、污染病毒的性质、对人类潜在的感染性和致病性、产品的纯化工艺（如病毒清除评价数据）及对纯化后产品进行病毒检测的程度进行综合考量。

4. 未加工收获液的病毒检测

建议制造商制定计划，将外源病毒纳入生产批次的常规检测。对未加工收获液病毒检测的程度应考虑以下几点：用于生产预期产品的细胞系特性，细胞系检定过程中开展的病毒检测的结果和程度，培养方法，原材料和试剂来源以及病毒清除研究结果等。有关基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品的未加工收获液检测，请参见附件6。

对于批生产，未加工收获液包括一批或多批细胞和培养基的混合收获物。对于涉及从细胞培养中连续收获产品的工艺，可能会从流出液中收集中间体或未加工收获液样品。在进行进一步处理前，从生产反应器中获取的具有代表性的未加工收获液，最适合于检测外源病毒污染，若存在病毒污染，在该步骤最有可能被检测出来。因此，应对未加工收获液进行适当的病毒检测。应考虑细胞分离技术对检测发酵罐中细胞相关病毒的潜在影响。如果未加工收获液有毒或对细胞培养方法的病毒检测造成干扰，则可以考虑采用最小样本稀释或替代检测（例如NGS）（见第3.2节）。为了检测细胞相关病毒，应检测从生产反应器中取出的完整细胞和细胞裂解液（破碎细胞和细胞培养上清）的混合物。对于灌流培养或连续制造（CM）工艺，细胞可能不易获取（例如，因使用中空纤维或类似的微滤系统）。在此类情况下，可以使用从细胞培养中收获的无细胞产品。对于涉及从细胞培养中连续收获产品的工艺，应证明取样策略（包括样本的周期性和组成）的合理性，原因在于外源病毒和内源病毒颗粒水平有可能随着细胞培养持续时间而变化（见第7节）。

应对每一批未加工收获液进行常规的外源病毒检测。这可能包括不同指示细胞体外检测法或非靶向NGS（见第3.2节）。指标细胞培养应观察28天，包括每两周至少进行一次亚传代。基于风险评估（考虑细胞基质、生产培养周期、动物源性原材料或试剂的使用以及工艺的病毒清除水平），可将细胞系的检测时间缩短至14天。此外，基于对潜在污染物引入的风险评估，NAT或靶向NGS等方法也适用于检测特异性病毒（如小鼠细小病毒）或病毒家族。此类快速检测方法有助于实时决策。

如果在未加工收获液阶段检出任何外源病毒，除非有合理解释，否则不得将此细胞培养收获液用于产品生产。（有关使用检出外源病毒收获材料的指南，请参见第5节）。应仔细检查工艺，以确定污染的根本原因和程度，并采取适当措施。对于CM工艺，一个批次的最终放行应包括用于生产该批次产品的收获液在细胞培养期间无病毒污染的记录。如果检测到外源病毒，应制定隔离潜在污染材料的程序，以降低对更广泛的生产的影响。

5. 对纯化后产品进行病毒清除研究和病毒检测的依据和行动计划

设计一个相关且合理的病毒检测方案非常重要，该方案覆盖从MCB、到药品生产的各个阶段、直至最终产品的整个过程，包括对未加工收获液病毒清除的评价和表征。病毒清除的评价和表征在此病毒检测方案中起着至关重要的作用。其目标应是确保产品无病毒污染。

在选择清除研究用病毒时，区分评估工艺清除己知病毒的能力和通过表征非特异模型病毒（后文叙述）的清除来评估工艺稳健性是有用的。关于相关模型病毒、特异模型病毒和非特异模型病毒的定义，见术语表。病毒风险评估应包括了解在工艺过程（如未加工收获液）中可能存在的病毒量，以及能被清除的病毒量去评价产品的安全性。了解灭活过程的时效性对确保灭活工艺的有效性十分必要。在评价病毒清除能力时，根据具体情况，应开展对灭活的时效关系的深入研究，证实灭活或去除的重现性，和工艺参数评价。当使用非特异模型病毒对生产工艺清除病毒的稳健性进行表征时，研究设计中应对非包膜病毒予以特别关注（对于模型病毒的解释，请参见第6.1.1节）。病毒清除的程度研究可能会受到细胞系和未加工收获液检测结果的影响。这些研究应按下文所述方法开展（见第6节）。

表4提供了针对细胞或未加工收获液病毒检测结果而采取的行动计划示例。该计划包括工艺评价、病毒清除表征和纯化后产品的病毒检测。表中列出了多种情况，并在下文加以说明。在所有情况中，都应采用非特异模型病毒开展病毒清除能力表征。A、B和F三种情况是最常见的。被病毒污染的生产系统通常不能用于生产，啮齿类动物逆转录病毒污染除外。如果有充分理由需使用C、D、E情况中的细胞系来生产药物时，须与相应的监管机构进行讨论。在C、D、E情况中，重要的是生产工艺中有经过验证且能灭活或去除可疑病毒的有效步骤。

情况A：如果在细胞或未加工收获液中未发现药物成分（如病毒载体颗粒）以外的病毒、病毒样颗粒（VLP）或逆转录病毒样颗粒（RVLP），则应使用非特异模型病毒进行病毒去除和灭活研究（如上所述）。如果未检出逆转录病毒样颗粒且PERT检测呈阴性，则无需估计每个剂量的逆转录病毒颗粒。

情况B：在啮齿类动物细胞系中，如果仅有啮齿类动物逆转录病毒（如啮齿类动物A型、C型和R型颗粒），则除了开展情况A中的非特异病毒清除评价外，还应使用特异模型病毒（如鼠白血病病毒（MLV））进行工艺评价。对于上市许可，通常应提供3个批次或以上中试规模或商业化规模纯化后产品的RVLP定量数据。常用于药物生产且已充分表征的细胞系，例如CHO、C127、BHK和小鼠杂交瘤细胞系（如NS0或SP2/0细胞）等，目前尚未有关于其产品病毒污染安全问题的报道。对于这些细胞系，由于其内源性颗粒己进行广泛表征，病毒清除也己证实，通常不建议再开展纯化后产品或原液中的非感染性颗粒检测。这也适用于其他已经充分表征的细胞系（如Sf9昆虫细胞系），此类细胞系所产生的内源性逆转录病毒样颗粒已得到广泛表征。

情况C：当已知细胞或未加工收获液中含有除啮齿类动物逆转录病毒以外的病毒，而又无证据证明这些病毒对人有感染性（如Sf9弹状病毒），则病毒去除和灭活评价研究应使用已鉴定的病毒。如果不能使用己鉴定的病毒，则应使用相关病毒或特异模型病毒来证明可接受的清除能力。在关键的灭活步骤中，应对己鉴定的病毒（或相关病毒或特异模型病毒）进行时效性地灭活，作为对这些病毒工艺评价的一部分。应采用具有高特异性和高灵敏度的合适方法对纯化后产品中的可疑病毒进行检测。上市申请时，应提供3批次或以上中试规模或商业化生产规模纯化后产品的代表性数据。

情况D：当检测出含有对人类具有感染性的病毒（例如表3脚注a所指示的病毒）时，则该产品只有在特殊情况下才可被考虑接受。在这种情况下，应使用己鉴定的病毒进行病毒去除和灭活评价研究，并使用具有高特异性和高灵敏度的特异性方法对可疑病毒进行检测。如果无法使用己鉴定的病毒，应使用相关和/或特异模型病毒（后文叙述）。应证明在下游工艺中己去除和灭活所选病毒。应在关键灭活步骤中取得时效关系的灭活数据，以作为工艺评价的一部分。对于纯化后产品，应采用具有高特异性和高灵敏度的合适方法对可疑病毒进行检测。对于上市许可，应提供3批次或以上中试规模或商业化规模纯化后产品的代表性数据。

情况E：当在细胞或未加工收获液中检测到用现有方法无法分类的病毒时，该产品一般不予接受，因为这种病毒可能具有致病性。在极个别的情况下，且有充分正当理由要使用该细胞系生产药物时，在开展下一步行动前，须与相应的监管机构进行讨论。

情况F：当生产病毒（辅助病毒或用于表达重组蛋白或VLP的病毒载体）用于产品生产时，应使用生产病毒或特异模型病毒（例如杆状病毒、腺病毒或疱疹病毒）证明病毒清除情况。除非有已证明的稳健的过量清除率，否则应对每批纯化后产品进行检测确保无生产病毒残留（第6.3节）。此类情况下，应提供至少3批次纯化后产品的检测结果来证明无生产病毒残留。

6. 病毒清除工艺的评价和表征

病毒清除/灭活工艺的评价和表征对生物技术产品的安全性起着重要的作用。过去发生的多例污染事件是由于使用未知或甚至未被怀疑的受污染的原材料。尽管这种情况并不发生在经充分表征的细胞系制备的产品，而是发生在从其他原材料中制备的生物制品中，但是病毒清除评价可使我们确信那些未知、非预期和有害的病毒都有可能被清除。研究必须被详细记录并在受控条件下进行。

病毒清除工艺表征/评价的目的是为了证明已知存在于细胞基质中的内源病毒的清除率，以及确保由于使用生产病毒产生的病毒，无法检测到的或生产过程中引入的外源病毒将被清除。病毒清除研究的目的是：（1）评估有效灭活或去除病毒的工艺步骤，以及（2）定量估计通过该工艺获得的病毒的整体降低水平。具体做法是有目的地将一定量的病毒加入（即“加标”）到未加工收获液或各工艺步骤的中间体中，并在后续步骤中证明其去除或灭活的效果。如果使用较少工艺步骤就能证明足够的病毒清除率，则无需对生产工艺的每一步都进行评价和表征。应注意的是，生产的其他工艺步骤可能会对已取得的病毒灭活或去除结果产生间接影响。制造商应解释并证明用于评价病毒清除研究的方法的合理性。在适当的情况下，为了确定进入纯化工艺的病毒颗粒的数量，应对三个批量/批次细胞培养物进行定量。这些数据应作为上市许可的一部分提交。

降低病毒感染性可通过去除病毒颗粒或灭活病毒的感染性来实现。对于所评估的每一生产工艺步骤，应说明病毒感染性丧失的可能机制，即是被灭活还是被去除。对于灭活步骤，应对研究进行设计，在不同时间取样并建立灭活曲线（见第6.2.5节）。

除了对已知存在的病毒进行清除研究外，还应进行研究以确定去除或灭活其他病毒的能力。使用具有不同生物化学和生物物理特性的病毒进行研究的目的是表征清除未知或非预期病毒工艺的稳健性，而非实现特定灭活或去除目标。应对生产工艺中的病毒灭活或去除的能力加以证实（见第6.3节）。这种研究并不是要对某一特定安全风险作出评价，因此，无须达到特定的清除值。

6.1 用于评价和表征病毒清除的病毒选择

为了测试生产工艺清除病毒的总体能力，供清除评价和工艺表征研究用的病毒应与可能污染产品的病毒相似，而且要有广泛的理化特性。制造商应根据本指导原则中提供的评价和表征研究的目的对病毒的选择作出合理解释。

6.1.1 相关病毒和模型病毒

病毒清除研究中的一个主要问题是确定选择何种病毒。此类病毒可分为三类：（1）“相关”病毒，（2）特异“模型”病毒，以及（3）非特异“模型”病毒。“相关”病毒用于病毒清除研究。“相关”病毒是指已被鉴定的病毒，或是已被鉴定的病毒的同类病毒，或可能会污染细胞基质或污染生产过程中使用的其他试剂或材料的病毒。应证明下游工艺有去除和/或灭活此种病毒的能力。如果得不到“相关”病毒，或不太适用于病毒清除的工艺评价研究（如不能体外培养到足够的滴度），应使用特异“模型”病毒代替。适用的特异“模型”病毒是与已知病毒或可疑病毒密切相关（同种或同属），并与所观察到的或可疑的病毒具有类似理化特性的病毒。啮齿类动物细胞系一般都含内源性逆转录病毒颗粒或RVLPs，它们可能具有感染性（C型颗粒），也可能没有感染性（细胞浆A型和R型颗粒）。应确定所用生产工艺具有去除和/或灭活啮齿类动物逆转录病毒的能力。此项工作可使用鼠白血病病毒作为啮齿类动物源性细胞的特异“模型”病毒。

对于CHO细胞衍生的产品，CHO衍生的内源病毒颗粒可用于病毒清除试验。目前还没有针对这些颗粒的感染性检测方法，其检测方法（如分子或生化）应符合其预期用途。当通过EB病毒使B淋巴细胞永生化而获得人细胞系时，应确定生产工艺去除和/或灭活疱疹病毒的能力。伪狂犬病毒也可用作特异“模型”病毒。

当研究目的是表征生产工艺去除和/或灭活病毒的总体能力（即表征病毒清除工艺的稳健性）时，应使用具有不同特性的非特异“模型”病毒进行病毒清除表征研究。从“相关”病毒和/或特异“模型”病毒研究中所获取的研究数据也有助于这种评估。一般不需要对所有病毒进行测试。应对那些对物理和/或化学方法处理具有显著耐受性的病毒加以关注。因为从这些病毒所获取的结果可为评价生产工艺去除和/或灭活病毒的总体能力提供有用的信息。选用病毒的种类和数量与细胞系质量和特性及生产工艺有关。一般说来，应至少使用三种不同特性的病毒对工艺的清除病毒能力进行评估。

附件1和表A-1例举了代表不同理化结构的“模型”病毒以及已用于病毒清除研究的一些病毒。

6.1.2 其他考虑

其他需要考虑的问题如下：

• 尽管有时不可能，但最好能培养出高滴度的病毒；
• 应有一种有效和可靠的方法，用于检测每个待评价生产阶段中用到的每种病毒；
• 有些病毒可能会对从事研究的人员造成健康损害，对此应加以重视。

6.2 病毒清除评价和表征研究的设计和影响

6.2.1 设施和人员

根据药品生产质量管理规范规定，不能将任何病毒引入生产设施。因此，病毒清除研究应在配备有病毒学工作设备的隔离实验室进行，并由具有病毒学专业知识的工作人员与涉及在设计和建立纯化工艺的缩小模型有特定工艺经验的生产人员合作进行。

6.2.2 生产工艺的缩小模型

缩小模型应尽可能接近生产工艺 ，并确认其代表性。缩小模型还应考虑病毒清除的稳健性（比如工艺或工艺步骤耐受原材料变化和工艺变更而不产生负面影响的能力）。此类情况下，建议在相关参数的最差情况下进行病毒清除研究。为了证明病毒清除的稳健性，并为潜在的生产变更做好准备，还可接受超出生产范围的条件。应确认缩小模型的性能可代表生产工艺（如收率和纯度相当）。对于层析步骤，如柱床高度、线性流速、流速/柱床体积比（即过柱时间）、缓冲液及树脂类型、pH、温度、电导率和产品浓度均应代表商业化生产规模水平。所得层析图谱应类似。对于其他生产工艺步骤，亦应有类似考量。有些偏差是不可避免的，但应讨论其对结果的影响。

6.2.3 渐进式病毒清除分析

在进行病毒清除研究时，应考虑评估多个生产步骤对病毒清除的贡献。应对每个可能参与病毒清除的步骤的去除或灭活病毒的能力分别进行评估，并关注各个步骤的确切作用。每一个步骤的测试样本中应含足够量的病毒，以便对每一步骤的有效性进行充分评估。一般来说，应将病毒加入到待测试的每一步的工艺中间体中。在某些情况下，需将高滴度病毒加入早期工艺中间体中，并在后续各步骤间测定其浓度即可。当通过分离步骤去除病毒时，建议在适当和可能的情况下，研究病毒载量在不同分离组分中的分布情况。当生产过程中有多个生产工艺步骤使用灭活病毒缓冲液时，也可用替代的方法，如用较弱的灭活病毒缓冲液（如 pH调整缓冲液）进行平行加标，作为总体工艺评估的研究组成部分。缓冲液本身的灭活作用可在单独的加标实验中检测。与感染性无关的定量检测可适用于确定病毒颗粒的分布。另外应对每一被评估工艺步骤之前和之后的病毒滴度进行测定。感染性定量测定方法应有足够的灵敏度和重现性，还要有足够的重复实验以确保结果具有充分的统计学可信度。如有正当理由，也可使用与感染性无关的定量分析。在进行感染性测定时，要有相应的病毒对照组以确保方法的灵敏度。如样品病毒的浓度较低，其统计结果也应该考虑（见附件2）。

一般原则为，除非先验知识可说明减少研究的合理性，否则至少应在两次独立的实验中确认病毒清除的可重复性（见第6.6节）。实验可在同一场所，采用相同的实验设置和相同批次的料液开展，但并不期望两次独立实验的结果完全相同。

6.2.4 确定物理去除或灭活

可通过去除或灭活病毒降低病毒感染性。对于所评估的每一个生产步骤，都应说明病毒感染性丧失的可能机制，即灭活和/或去除。对某一特定步骤，需要区分其是去除还是灭活作用。例如，当多个病毒清除步骤中使用的某种缓冲液可能具有灭活作用（即多个层析步骤共同使用的缓冲液有灭活作用）时，应明确每个层析步骤对病毒的清除效果。

6.2.5 灭活评估

为了对病毒灭活作出评估，应在工艺中间体中加入感染性病毒，并计算下降因子。要知道病毒灭活比较复杂，不是一个简单的一级反应，通常包含最初的快速阶段和随后的慢速阶段。因此，要在不同的时间点取样研究并建立灭活曲线。建议灭活研究中，取样点除最短作用时间外，至少还应包含一个大于零和小于最短作用时间的时间点。如果该病毒是一种已知人致病性“相关”病毒，研究工作必须取得更多的数据，并设计出一种有效的灭活工艺。但是，如使用非特异“模型”病毒进行灭活研究，或使用特异“模型”病毒作为病毒颗粒的替代物，如CHO RVLPs，必须分别作两次独立的研究来证实清除工艺的可重复性。如可能，应根据在加标起始物料中检测到的病毒量来确定初始病毒载量。如果不可行，可根据加入病毒的滴度计算初始病毒载量。如果由于灭活太快，来不及根据工艺条件建立灭活曲线，应进行相应的对照试验（如灭活剂浓度较低的样品）以证实病毒经灭活处理已失去感染性。

6.2.6 层析柱的功能和再生

纯化工艺中的层析树脂和膜经一段时间重复使用后，其清除病毒的能力可能会发生变化。应标明层析介质/树脂的寿命，并确定可能影响病毒清除的参数。应该进行病毒清除研究，以支持介质/树脂的重复使用。

对于蛋白A亲和捕获层析，先验知识表明，使用过的（如寿命末）层析介质/树脂，其病毒去除效率不受影响甚至略有增加。因此，不建议使用已使用过的树脂进行产品特定研究。先验知识也可能适用于病毒清除中涉及的其它层析类型（如阴离子交换或阳离子交换）。因此，为支持其他层析类型的树脂可重复使用，应当提供包括内部经验在内的等效先验知识以及详细的依据，而不需要用使用寿命末的树脂开展产品特定病毒清除研究（第6.6节）。

在设备再次使用前，必须保证生产设备可能残留的任何病毒都被充分灭活或去除。例如，在病毒清除评价过程中，可提供证据证明清洗和再生过程可以灭活或去除病毒，且可得到先验知识的佐证。

6.2.7 特别注意事项

应考虑下述特别注意事项：

• 采用高纯度、高浓度的病毒母液进行加标，有助于最大限度地降低产品中间体的稀释，并减少可能影响工艺性能的非代表性杂质的引入。然而，制备高滴度病毒时应注意避免聚集，聚集的病毒更容易被物理方式去除，但同时更难被灭活，因此，与实际生产不符。
• 须注意有效分析方法的最低病毒检出量。
• 应进行平行对照分析研究，以评估病毒在滴定前是否由于样品稀释、浓缩、过滤或贮存等原因而失去感染性。
• 加入产品中的病毒“加标”体积要小，从而不会使产品稀释或改变产品的性质。
• 诸如缓冲液、介质或试剂等的微小差异都会对病毒清除产生影响。
• 病毒灭活具有时间依赖性，因此，加标产品在特定缓冲溶液中或特定层析柱中停留的时间长短应能反映商业化生产规模的工艺条件。
• 应分别评估缓冲液和产品的毒性以及对病毒滴度检测方法的干扰，因为这些因素可能会对指示细胞产生不良影响。如果溶液对指示细胞有毒性，可能需要对含有加标病毒的缓冲液进行稀释、调整pH值或者透析。如果产品本身具有抗病毒活性，进行病毒清除研究时，应采用无产品的空白“模拟”试验，可适用如第6节所述的先验知识。然而，不加入产品或用无抗病毒活性的类似蛋白替代品进行研究，会影响某些生产步骤的病毒行为。应纳入足够的对照品，以表明仅用于制备检测样本的程序（如透析、储存）对加标病毒去除/灭活的影响。
• 如果使用分子生物学检测方法对病毒基因组进行定量，则应注意考虑非包膜病毒核酸的影响，在某些工艺步骤中，它可能无法代表完整病毒颗粒的去除。
• 许多纯化工艺的多个纯化步骤中都使用相同或相似的缓冲液或层析柱。当一个完整生产工艺的总体病毒下降因子是基于此类纯化工艺的下降因子之和时，此方法应该是合理的，例如，某一特定工艺步骤的病毒清除效果会因其所处的生产阶段不同而有所不同，同时伴随蛋白质和其他杂质的存在也会明显影响病毒清除能力。
• 当生产条件或缓冲剂具有很强细胞毒性或杀病毒作用时，可能会高估或低估总体下降因子，因此需具体问题具体分析讨论。由于病毒清除研究本身的局限性或因设计不够完善，也可能会高估总体下降因子。

6.3 病毒清除研究的说明

评估病毒灭活/去除的目的是对灭活/去除病毒有效工艺步骤作出评价和表征，并对生产过程中病毒下降的总体水平进行定量分析。就情况B-F所述的病毒而言，不仅要证明病毒已被去除或灭活，还要证明下游工艺具有额外的病毒清除能力，从而确保最终产品具有相当的病毒安全性。生产工艺中去除或灭活的病毒量应与可能进入下游工艺的病毒量相比较。

为了进行这种比较，必须对未加工收获液中的病毒总量进行评估。可采用感染性检测方法或诸如TEM或定量NAT等方法进行估计。整个纯化工艺应能够清除比产成单剂量所需未加工收获液所含病毒量更多的病毒。病毒下降因子计算见附件3；每个剂量颗粒的估算见附件4。制造商应认识到，清除机制可能因病毒类别而异。当判断病毒灭活/去除过程的有效性时，应综合考虑以下各种因素：包括：

• 所用评估病毒是否合适；
• 清除研究的设计；
• 所获得的病毒下降因子值；
• 病毒灭活的时效性；
• 工艺参数变化对病毒灭活/去除的潜在影响；
• 检测方法的灵敏度；
• 灭活/去除方法对某些种类病毒可能具有的选择性

建议设计一种能清除各种潜在病毒（潜在外源病毒污染物、内源和/或生产病毒）的下游工艺。在这种情况下，只要可行且不会对产品产生不利影响，建议采用两种不同的病毒清除步骤，其中一个应能有效清除非包膜病毒，两者在其作用方式上相互补充。一个有效的病毒清除步骤通常至少在两个独立研究中会使病毒量可重复地减少达到4 log₁₀或更多。然而，需认识到可重现地降低1至3 log₁₀的步骤有助于确保病毒安全性，可用于总体病毒下降的评估。专门用于病毒灭活/去除的工艺步骤（例如溶剂/去污剂处理、单独去污剂处理或低pH孵育），在清除各种包膜病毒方面非常有效。病毒过滤基于病毒大小去除病毒。对较小的病毒（如细小病毒或多瘤病毒），使用设计用于去除小病毒的病毒过滤器也是一个有效的的病毒清除步骤。最后，经验表明，mAbs纯化过程中蛋白A捕获步骤之后，低pH孵育可有效灭活MLV和伪狂犬病毒。

以下任何一种方法都能实现可接受的总体清除率：多步互补灭活法，多步互补去除（分离）法，或灭活与去除结合法。病毒去除法对病毒的物理化学特性具有很强的依赖性，这会影响病毒与层析固定相（如树脂或层析膜）的相互作用和其沉淀特性。因此“模型”病毒可采用与“相关”病毒不同的方法进行分离。应正确定义和控制影响去除的生产工艺参数。尽管存在这些潜在的可变因素，仍可采用将几种互补去除步骤结合的方法或将灭活与去除相结合的方法达到有效清除病毒目的。因此，完善设计去除步骤，如层析步骤、过滤步骤和提取，只要适当控制条件，都可以成为有效的病毒去除步骤。

总体下降因子一般以各因子之和来表示。除另有合理解释，否则病毒滴度下降1 log₁₀以下可忽略不计。

如所用生产工艺去除病毒感染性的能力较低，而病毒清除对于产品安全又是一个主要因素，则应另外增加一个或多个有针对性的灭活/去除步骤。制造商应对获得的所有病毒下降因子的可接受性作出合理性说明。在评估结果时将考虑上述因素。

6.4 病毒清除研究的局限性

病毒清除研究有助于保证最终产品达到可接受的安全水平，但其本身并不能完全安全可靠。这是由于病毒清除研究设计和执行过程中的许多因素会导致对生产工艺去除病毒感染的能力作出不正确的估计，其中包括如下因素：

• 用于生产工艺病毒清除研究的病毒制品通常来自特定的细胞培养物。这种生产步骤中进行病毒加标的行为可能与来自细胞培养基中生物原材料的天然病毒污染物或在生产细胞中复制的病毒污染物不同。例如，用于加标的病毒颗粒和来自各自生产中间体的天然病毒可能在纯度或聚集程度上存在差异。
• 病毒感染性的灭活通常是一条双相曲线：先有一个快速起始阶段，接着是一个较慢的阶段。这就可能使最初灭活阶段逃逸的病毒对后续阶段具有更强的耐受性。如具有耐受性的那一部分病毒形成病毒聚集物，则其感染性可能对多种不同的化学处理及热处理都产生耐受性。
• 生产工艺去除或灭活病毒的总体清除能力以每一个工艺步骤病毒下降log值之和表示。将下降不显著（如低于1 log₁₀）步骤的下降因子相加，可能会高估实际的病毒清除能力，故不应如此操作。生产过程中相似灭活机制的病毒下降因子的相加也可能会对整体清除病毒能力产生过高估计。此外，除非有合理的理由，否则亦不能将重复相同或几乎相同的方法所获得的下降值包含在其中；
• 下降因子用滴度的对数降低值来表示，说明尽管残留的病毒感染性可能已大大降低，但是决不会降至0。例如，当每毫升（mL）含8 log₁₀感染单位的制品感染性降低8 log₁₀后，每毫升（mL）的感染性为0 log₁₀或是一个感染单位，此时应考虑检测方法的检测限。
• 尽管已对缩小规模的工艺进行精心设计，但缩小规模的病毒清除验证研究中的工艺仍可能不同于商业化生产规模。

6.5 统计

病毒清除研究结果评估时应引入统计学分析。研究结果应具有统计学意义才能支持所得出的结论（见附件2）。

6.6 应用先验知识评价病毒清除情况

一般而言，病毒清除情况通过实验来评价，即把病毒添加到每个待研究步骤的产品特定工艺中间体中。如果制造商正在通过既定且充分表征的工艺（如使用相同平台技术）开发类似产品，则其他产品的病毒清除数据可能适用于同一工艺步骤的新产品。然而，为了利用该工艺步骤的数据，应充分了解该工艺步骤。应明确论证特定工艺步骤先验知识的代表性。由外部和内部经验组成的先验知识应涵盖下述方面：

• 应该了解病毒清除的机制。
• 应该全面了解可能影响病毒清除的工艺参数。
• 应该明确病毒和产品之间的相互作用不会影响病毒清除。如果存在病毒与产品相互作用可能影响病毒清除的潜在风险，则应合理应用生产其他产品时获得的先验知识。如果特定步骤有一种以上产品的数据，则每种情况下的病毒下降效果应相当。
• 特定工艺中间体的组分可能会影响病毒清除。对于某些工艺步骤，即使在诸如缓冲液、介质、试剂、杂质水平等方面存在微小差异，也可能对病毒清除产生影响。因此，其他产品的工艺中间体组分的代表性应加以论证。除非先验知识表明与工艺中间体组分相关的病毒清除具有稳健性，否则新产品和已确立产品特定步骤之前的工艺应遵循相似的策略。
• 在将先验知识应用于特定产品时，应考虑第4节中概述的病毒清除研究的一般局限性。

外部先验知识（包括已公布数据）可用于支持说明某个步骤灭活/去除病毒的潜力，及相关机制的理解。此类数据也可用于特定病毒清除步骤中关键工艺参数及最差条件的确定。在最差条件下进行病毒清除研究有助于减少特定产品实验的数量。然而，将已公布的下降因子应用于特定产品时，需要通过证明所涉及的不同产品生产工艺具有相似性、产品中间体具有相似性，并保证产品特定属性不会影响病毒的下降水平。因此，需要仔细评估已公布数据，并且以特定平台的内部经验（内部先验知识）作为补充。

对于未开展特定产品病毒清除验证研究的情况，应在具体案例具体分析的基础上，考虑药品整体病毒安全性策略，包括细胞基质和原材料的性质和特性，以及整体病毒清除策略，以确定其可接受性。如果数据资料不足以支持先验知识的使用，则应开展特定产品的病毒清除研究。

当使用先验知识推导下降因子时，应考虑到相关平台数据中的所有下降因子，以证明其合理性。建议保守使用下降因子，以避免工艺步骤降低病毒能力被高估的风险。

附件5提供了一些情况，根据当前理解，先验知识包括来自其他产品的病毒降低水平数据的内部经验，可用于说明来自相同生产平台的新产品的病毒下降因子。

6.7 病毒清除的再评价

当上游或下游生产工艺发生重大变更时，要考虑这种变化对病毒清除直接和间接的影响，必要时应对该工艺进行再评价。例如，上游生产工艺的变更可能会使细胞系产生的病毒数量发生明显变化；生产工艺的变化也可能会改变病毒清除的程度。

可利用内部知识和平台概念对全生命周期管理中可能影响病毒清除效率的生产工艺变更进行评估。如果无法将其他产品的内部知识（内部经验）外推到特定产品和/或平台概念也不再适用，则应开展特定产品的病毒清除研究。

7. 连续制造的考虑要点

CM可能涉及连续地将输入材料放入到可将其转换的由一系列相关联的单元操作组成的生产工艺中，并提供输出材料（即产品）的连续流。CM可应用于生产工艺的部分或全部单元操作。除每个单元操作外，了解整个工艺及其动力学对于识别和降低病毒安全性相关风险至关重要。关于治疗性蛋白生产的CM工艺模式的描述可参见ICH Q13（附件III）。

在病毒安全性方面，CM的技术方面可能与批工艺中使用的有所不同，包括病毒检测和去除方法，材料可追溯性，工艺动力学，监测频率启动/关闭。

然而，基于工艺理解的基本原则和预期（例如基于科学和风险的方法及其控制病毒污染风险的实施）则与批生产相同。同时还包括污染预防策略（见第2.2节）。例如，来自批生产的经验或先验知识的物理和化学条件灭活或去除病毒可能也适用于CM工艺（见第6.6节）。

7.1 连续制造中的病毒安全性

CM工艺中的病毒安全性策略应基于潜在污染源的风险评估（例如，起始物料和原材料以及延长的细胞培养持续时间），工艺去除病毒的能力，以及确保不存在病毒的检测能力。第3节和第4节中提供的关于检测的指南也适用于CM。基于该评估，应制定一个策略，包括所开展的外源病毒检测的类型和频率，以证明该工艺在生产期间是无污染的。

7.2 连续制造中病毒清除的一般考虑

为了设计生产工艺和病毒清除研究，应考虑以下内容：

• 生产工艺可部分以整体（连接）或连续的操作模式运行，并且如果适用，可以使用基于批工艺的病毒清除性能的科学理解来评价单元操作（参见第3.2节）。
• 应评估每个单元操作和设备之间连接的潜在风险（例如，在单元操作之间使用缓冲罐或混合罐，以缓解质量流速差异或输入物料的不均匀性），以强调对病毒降低能力所产生的任何影响。
• 应有适当的工艺监测来检测a)工艺干扰（例如，影响病毒清除的压力/流量中断），b)外源病毒污染。工艺干扰的最终影响可能因事件类型而异，应视具体情况而定。

如果执行实时决策，应包括一个确定a)病毒清除的工艺干扰，或b)污染对输出材料质量和产品影响的程序。基于这些考虑，应将潜在不合格物料从产品流中的转移或所生产物料的处置纳入考量。（第4节）。

• 如适用，病毒清除研究设计应考虑以下因素的潜在影响：
  • 输入物料属性的差异（例如，蛋白质或杂质的浓度和均一性，以及聚集水平）
  • 停留时间
  • 计划事件（例如，过程启动、关闭和暂停）和计划外的瞬时事件（例如，干扰）
  • 操作负载能力
  • 其他负载策略，例如多柱循环和串行负载
  • 病毒控制策略

7.3 连续制造中病毒清除的特殊考虑

CM还提供了针对病毒安全性的如下特殊考虑方面。

7.3.1 与较长的生产培养时间相关的潜在风险

在生产培养中，内源性病毒的水平可能随时间发生波动，因此应制定适当的取样策略进行评估，以免影响制剂的剂量风险因子计算（见第4节和第3节中有关细胞系鉴定的考虑）。

7.3.2 病毒清除研究方法

尽管预计CM将维持控制状态，但生产工艺可能包括在启动、终止和工艺干扰期间工艺输出可能发生变化的时期（例如，在病毒污染的情况下，短时间内可能存在高病毒载量）。此类时间段的风险可以使用本指导原则其他部分（第6.2节）阐述的内容解决。

此外，根据设备设计和系统集成情况，可以选择同时验证两个或更多连接的单元操作。

针对CM的特殊考虑包括：

• 层析
  • 在重复循环的情况下（例如，多柱处理），一个具有合理的目标工艺条件（例如，流速、树脂负荷与色谱柱过载、树脂可清洁性）的批工艺可以作为缩小规模的模型，关于缩小规模同样可参见本指导原则第2.2节。
  • 可考虑同时验证两个或多个连接的层析步骤（例如，阳离子交换层析的结合和洗脱模式以及阴离子交换层析的流穿模式）。对于连接的单元操作，如果生产过程中的操作条件充分反映于负载物料，则可以使用常规的批缩小规模的模型来评价病毒清除。
• 病毒灭活
  • 在经过充分论证的目标工艺条件下进行的批工艺验证可能是合适的。
  • 对于病毒灭活（例如，pH和溶剂/洗涤剂），应确保相关动态工艺参数的控制（例如，pH、溶剂/洗涤剂浓度、均一性和混合、温度、停留时间分布）。
  • 当在动态过程中应用缩小规模的模型进行灭活时，应注意评价/证明规模对过程动力学的影响（例如，停留时间分布）和控制策略。
• 病毒过滤
  • 如果影响病毒清除的参数设置变化不超过病毒清除研究中检测的范围（例如，最坏情况设定值），则进行批工艺验证可能是合适的。
  • 应定义工艺控制，以允许过滤器变更和进行使用后完整性检测，同时保持病毒清除能力。

8. 总结

本指导原则就评估产品病毒污染风险、控制潜在病毒污染源及对生产工艺进行病毒清除鉴定方法提出建议，从而有助于从动物或人细胞系生产出安全的生物技术产品。其中的控制和清除方法包括：

• 对细胞基质起始物料进行全面鉴定/检测，以明确存在哪些病毒污染物（如有）
• 通过确定人体细胞嗜性或人体感染知识评估病毒污染的潜在风险
• 制定一项适当的检测未加工收获液中外源病毒的计划
• 制定一项适当的病毒清除计划
• 病毒清除研究的仔细设计和实施，在同一生产过程中使用不同的病毒灭活或去除方法。

9. 术语表

外源性病毒

非故意引入的污染病毒。见病毒。

细胞基质

用于生产产品的细胞。

对照细胞

在生产病毒或病毒载体的同时培养的细胞，不接种病毒/病毒载体种子。对照细胞的培养条件与生产细胞的培养条件基本相同，包括使用相同批次的培养基和替换培养基。

生产终末细胞（EOPC）

从MCB或WCB培养至传代水平或群体倍增水平（相当于或超过生产中达到的最高水平）收获的细胞（在与生产中使用的条件相当的条件下）。在某些情况下，可以测量培养时间。EOPC也被称为扩展细胞库（ECB），二者可与体外细胞传代限次（LIVCA）细胞互换使用。

内源性病毒

逆转录病毒，其基因组是细胞系起源物种种系的一部分，并稳定地整合到衍生亲本细胞系的宿主物种的基因组中。在本指导原则中，还包括故意引入的非整合病毒，如用于永生化细胞基质的EB病毒或牛乳头瘤病毒。

扩展细胞库（ECB）

从MCB或WCB中培养的细胞，并传代到用于生产的建议的体外细胞胞龄或更高。也可称为EOPC。

体外细胞胞龄

从MCB复苏到生产反应器收获之间的培养时间，即以固定的稀释传代程序，得到预期的细胞群体倍增水平或者细胞传代水平所需的时间。

体外细胞传代限次（LIVCA）细胞

LIVCA细胞来源于由MCB或WCB扩增而来的处于体外细胞胞龄或超过体外细胞胞龄的生产用细胞。LIVCA细胞也可称为EOPC或扩展细胞库（ECB），三者可互换使用。

灭活

用化学或物理的方法使病毒感染性降低。

主细胞库（MCB）

一个细胞池的混合物，通常是在规定的条件下从细胞基质或选定的细胞克隆中制备的，分配到多个容器中并在规定的条件下存储。

主病毒种子（MVS）

MVS（批或库）是载体病毒、病毒载体或生产病毒（即辅助病毒或病毒蛋白表达载体），所有未来产品都将直接或通过WVS获得。其为一种活病毒制剂，具有统一的组分（但不一定为克隆），由单一培养工艺产生，等分至适当的储存容器中，并在适当的条件下储存。

最低作用时间

一个处理步骤所保持的最短时间。

下一代测序（NGS）

也称为高通量测序或大规模平行测序或深度测序，基于具有广泛功能的多步核酸的技术对已知和未知外源病毒进行非靶向（不可知）检测。在某些情况下，NGS可通过测序策略或生信分析用于靶向检测已知病毒。

平台工艺（ICH Q11）

制定新药的生产策略方式，所用的生产工艺与同一申请人在生产相同类型的其他药物相似（例如，在mAbs的生产中，使用预先确定的宿主细胞、细胞培养和已有丰富经验的纯化工艺）。

平台验证

在本指导原则中，该术语仅指病毒清除的平台工艺验证。由此而论，平台验证定义为使用其他产品的先验知识（包括病毒降低数据的内部经验），以便根据目前的理解说明新的类似产品的下降因子情况。

先验知识

先验知识是指现有知识，包括内部知识（如开发和生产经验）、外部知识（如科学和技术出版物，包括供应商数据、文献和同行评审的出版物）或既定科学原理（如化学、物理和工程原理）的应用。

病毒清除工艺表征

病毒清除研究中，用非特异性“模型”病毒评价生产工艺去除和/或灭活病毒的稳健性。

病毒清除工艺评价研究

病毒清除研究中，用“相关”和/或特异性“模型”病毒确定生产工艺去除和/或灭活这些病毒的能力。

病毒清除工艺稳健性

术语稳健性用于描述两种不同特征或其中之一。其一是工艺或工艺步骤耐受材料变化和工艺变更而不对病毒清除产生负面影响的能力。另一个特征是清除各种特异和非特异性“模型”病毒的能力。

生产用细胞

用于生产产品的细胞基质。

纯化后产品

术语“纯化后产品”是指纯化工艺结束时的物料。虽然在大多数情况下代表原液，但也可以使用不含辅料的纯化物料，以避免对实验分析的干扰。

生产病毒

生产病毒是一种与工艺相关病毒，可包括辅助病毒或用于蛋白表达的病毒载体。

辅助病毒

一种提供辅助功能的病毒，使原本存在复制缺陷的共感染病毒得以复制。

用于蛋白表达的病毒载体

一种重组病毒，如杆状病毒，可用于表达重组蛋白或病毒样颗粒，或生产病毒载体。

补充检测方法

用于提供额外数据以支持常规检测的试验方法。

未加工收获液

一次或多次收获后汇集起来的细胞和培养基。当细胞不能直接获得时，未加工收获液是从生物反应器中收获的液体。

病毒清除

去除病毒颗粒或灭活病毒感染性。

病毒载体

一种重组病毒，可在体内作为药品应用或在体外应用于其他先进治疗。

病毒载体衍生产品

由病毒载体编码和表达的产品，这里的重组病毒是指用于生产的病毒载体，如杆状病毒。

病毒

在细胞内复制并有潜在致病性的感染性因子，只有一种单一类型的核酸（RNA或DNA），不能以其遗传物质形式生长、二分裂和繁殖。

非特异性模型病毒

用于鉴定生产工艺清除病毒能力的病毒，其目的是对生产工艺去除和/或灭活病毒的总体能力进行鉴定（即鉴定下游工艺的稳健性）。

相关病毒

工艺评价研究用病毒，可以是己鉴定的病毒或是己知病毒的同一种类，或是生产过程中使用的任何易污染细胞基质或其他生产用试剂或材料的病毒。

复制型病毒（RCV）：

将病毒载体与反式互补病毒序列重组，生成复制型病毒。

特异性模型病毒

与己知或可疑病毒密切相关（同种或同属）的病毒，与所观察到的或可疑的病毒具有类似的理化特性。

病毒样颗粒

形态上似乎与己知病毒相关的结构。可能含或不含病毒基因组。

工作细胞库（WCB）

在规定培养条件下扩增MCB获得匀质的细胞悬液，并经分装成多个等份制备而成。

工作病毒种子（WVS）

WVS（批或库）产生于MVS。

10. 参考文献

ICH Q2(R2)/Q14: Analytical Procedure Development and Revision of Q2(R1) Analytical Validation

ICH Q11: Development and Manufacture of Drug Substances

ICH Q13: Continuous Manufacturing of Drug Substances and Drug Products

表1.建议用于表征细胞基质的病毒检测

3. 更多详细信息请参见第2.1节。
4. 适用于已知含有此类因子的细胞系。
5. 可直接对WCB或直接来源于该WCB的LIVCA细胞进行体外病毒检测。
6. 可根据风险评估进行体内检测。如果仍有风险，可考虑保留检测或用非靶向NGS替代，以检测MCB构建期间或LIVCA阶段细胞培养期间可能引入的病毒。详细信息请参见第2.3节。
7. 非靶向NGS可替代体内检测（第2.3节），并补充或替代体外检测（第3.2.2节）。
8. 检测基于风险评估开展，评估包括细胞基质的来源和历史，以及人或动物源性原材料的潜在暴露。可使用基于细胞培养的感染性检测、抗体产生试验（MAP、HAP、RAP）、病毒特异性NAT或其他分子方法（例如，NGS）等方法。详细信息请参见第2.4节。如果使用血清或胰蛋白酶，则可能包括种属特异性病毒检测，例如昆虫细胞中的虫媒病毒以及牛或猪的病毒。针对生产用细胞基质的病毒检测所采取的行动步骤参见表4（情况B、C和E）。

表2.用于病毒检测的方法的应用与局限性举例

a.此外，可能很难将供试品与指示细胞区分。

表3.抗体产生试验中的病毒检测^d

1. 有证据表明能感染人或灵长类的病毒。
2. 无证据表明能感染人的病毒。
3. 能在人或灵长类来源的细胞中体外进行复制的病毒。
4. NAT（如PCR检测法或靶向或非靶向NGS或其他分子生物学方法）可用做替代方法。
5. 也称为3型鼠疱疹病毒。

表4.针对细胞或未加工收获液病毒检测结果的推荐行动计划

1. 细胞基质和/或在未加工收获液阶段病毒检测结果。除非经过特定的病毒清除和风险评估，否则一般不应使用被病毒污染的细胞培养物进行生产。内源性病毒（如逆转录病毒）或是MCB组成部分的病毒，在经过适当的病毒清除评价后可接受。
2. 当源材料受到病毒污染时，无论其是否已知对人类具有传染性和/或致病性，将只能在极个别情况下经过特定的病毒清除证明和风险评估后才被允许使用。
3. 采用直接或间接的方法观察到的病毒。
4. 被认为对人无致病作用。
5. 应使用非特异性“模型”病毒对病毒清除进行表征。
6. 应使用“相关”或特异性“模型”病毒进行工艺评价。
7. 见正文中情况E。
8. 应对可疑病毒使用适当的具有高特异性和高灵敏度的方法进行检测，确认纯化后产品中无可检测到的病毒。对于上市许可，应至少提供三批中试规模或商业化规模纯化后产品的检定数据。
9. 病毒可能对人类致病，也可能不致病。应对生产病毒进行工艺评价。如果不可行，则应使用特异性模型病毒。当用于生产时，在未加工收获液阶段，针对至少三个细胞培养批次的生产病毒进行定量检定，以确定病毒清除的目标。对于纯化后产品，针对相关允许细胞系使用感染性试验进行病毒敏感性检测，确认无可检测到的生产病毒。此外，也可使用分子生物学方法进行检测。除非有可靠的清除证明，否则应对每一个纯化后产品进行无残留生产病毒检测（第3节）。
10. 请参见第5节，情况B的描述。

附件1：病毒清除研究用病毒的选择

1.1 实用的“模型”病毒举例

1. 代表一定理化结构的非特异性“模型”病毒：

• 多瘤病毒（如SV40），动物细小病毒或其他一些小的具有理化抗性的非包膜病毒。
• 副流感病毒或流感病毒、辛德比斯（Sindbis）病毒或其他一些中到大型脂包膜RNA病毒。也可以使用其他非包膜病毒，如呼肠孤病毒、SV40或细小核糖核酸病毒，以扩大非包膜病毒的范围。
• 疱疹病毒（如单纯疱疹病毒（HSV-1）或伪狂犬病毒（PRV）），或其他一些中到大型DNA病毒。

以上所列病毒仅为示例，不强制使用。

1. 对于产生逆转录病毒样颗粒的细胞基质，鼠逆转录病毒常用作特异性“模型”病毒。也可以使用内源性鼠或其他啮齿动物逆转录病毒颗粒。

1.2 已用于病毒清除研究的病毒举例

表A-1列举了已用于病毒清除研究的一些病毒。但是，由于其仅仅是示例，对表中任何病毒的使用均为非强制性规定。制造商也可考虑使用其他病毒，特别是对其自身生产工艺更适合的病毒。一般说来，要用三种或以上不同特性的病毒对工艺的清除病毒能力进行评估。

表A-1：已用于病毒清除研究的病毒举例

1. 指生产工艺研究中，对理化处理具有的耐受性。耐受性与特定的处理有关，只有在了解病毒生物学特性和生产工艺性质的情况下才能使用。实际结果会随着处理情况而变化。
2. 在昆虫细胞中发现杆状病毒的特异性模型病毒。
3. 用于病毒载体生产的辅助病毒或病毒蛋白表达载体的特异性模型病毒或相关病毒。
4. 在验证病毒过滤器时，可用作较大球形/二十面体病毒和脂包膜病毒的单个最坏情况模型病毒。

以上所列病毒仅为示例，不强制使用。

附件2：评估病毒和病毒下降因子的统计学考虑

所有生物学检测方法在测定病毒滴度时都会碰到变异的问题。应对病毒滴定和从中获得的下降因子的准确性以及检测方法的有效性进行评估，从而确定研究的可靠性。统计学评价的目的是确认病毒清除研究工作是在病毒学可接受水平上进行的。

1. 检测方法可以是定性的或是定量的。定性法包括动物感染性检测或组织培养感染剂量测定，该法是按动物或细胞培养感染与否来记分。然后根据动物或培养物感染的比例测定感染滴度。在定量分析方法中，所测定的感染性随病毒的不断加入而变化。定量法包括基于分子的方法或空斑检测，即计算每一感染单位的相应空斑。定性和定量分析都可进行统计学评估。
2. 变异可来自稀释误差、统计效应和检测体系中未知的或难以控制的差异。不同检测运行间的变异（试验间变异）将大于同一检测运行间的变异（试验内变异）。
3. 试验内变异的95%置信限一般应在均值±0.5 log₁₀范围内。试验内变异可用教科书上的标准方法进行评估。试验间变异可引入参考品进行监测，其效价的估计值应在实验室平均估计值的5 log₁₀左右（试验可接受）。如有正当理由，较低精密度的分析方法也是可以接受的。
4. 只要可能，在进行“相关”和特异性“模型”病毒清除研究时，应计算所观察到的下降因子的95%置信限。如果起始材料病毒测定的95%置信限是+s，此后的材料病毒测定95%置信限是+a，下降因子的95%置信限为：

±

低浓度病毒检测的概率

显然，在低病毒浓度时（如每升含10-1000个感染性颗粒），几毫升样本中可能含有也可能不含感染性颗粒。该样本不含感染颗粒的概率p为：

p=((V-v)/V)ⁿ

其中V（升）是待检测材料的总体积，v（升）是样本体积，n是在V中统计学分布的感染颗粒的绝对数目。

如果V>>v，这一公式可用泊松分布近似计算：

p=e^-cv

其中c为每升感染性颗粒浓度。

或：c=ln p/-v

举例：如果测试样本体积为1 mL，在病毒浓度为每升10~1000个感染性颗粒，则概率p为：

c 10 100 1000

p 0.99 0.90 0.37

这说明，在每升含1,000个病毒的浓度下，在37%的采样中，1 mL样本中不含一个病毒颗粒。

如果仅对样本的一部分进行病毒检测，且检测结果为阴性，则应计算整个样本中达到阳性结果所需的病毒数量，并在计算下降因子时将此值考虑在内。应达到95%置信限。但是，在某些情况下，由于材料的局限性，这一操作可能不实际。

附件3：确定病毒清除研究中下降因子的计算

单个去除或灭活步骤的病毒下降因子是指处理前样本中病毒载量与用以下一步工艺的处理后样本中病毒载量之比的log₁₀。如使用以下缩写：

起始物料：

体积v’；滴度10^a’；

病毒载量：(v’)(10a^‘)，

最终材料：

体积v”；滴度10^a”；

病毒载量：(v”)(10a”)，

单个下降因子Ri按如下公式计算：

10^Ri=(v’)(10^a’)/(v”)(10^a”)

这一公式同时考虑了处理前后样本的滴度和体积。

由于有些病毒滴定本身不精确，用于计算总下降因子的单个下降因子应大于1。

整个生产过程的总下降因子是各单个步骤下降因子对数之和。它代表了第一个清除工艺步骤开始时的病毒载量与最后一步清除工艺结束时的病毒载量之比的对数。下降因子一般用log表示，说明尽管残留的病毒感染性可能已大大降低，但是决不会降至0。

附件4：每剂量病毒颗粒的估算

本附件适用于可估计起始数量的病毒，如内源性逆转录病毒。

举例：

1. 假设

进入纯化过程中的测得或估计的病毒浓度（例如，细胞培养收获液中的病毒浓度）=10⁶/mL

计算得病毒清除因子=>10¹⁵

制备一个剂量产品所需的培养收获液体积=1升（10³ mL）

2. 每剂量病毒颗粒的估算

（10⁶病毒颗粒/mL）×（10³ mL/剂量）

清除因子>10¹⁵

=10⁹颗粒/剂量

清除因子>10¹⁵

=<10^-6颗粒/剂量

因此，可以预计每一百万剂量中的病毒颗粒少于一个。

上述情况是采用啮齿类动物细胞生产mAbs或其他重组蛋白期间内源性逆转录病毒减少的典型情况（情况B）。在针对特异性病毒的综合风险评估中，应考虑其他因素，如病毒的宿主范围、病毒的感染性和致病性、避免污染的措施、检测措施、给药途径和人类感染剂量。

在CHO细胞的情况B中，内源性逆转录病毒已被广泛定性为非感染性病毒，因此，如果未能检测到感染性逆转录病毒的存在，则认为mAbs或其他重组蛋白的逆转录病毒样颗粒值<10^-4颗粒/剂量可接受。

附件5：应用先验知识（包括内部经验）以减少特定产品验证工作的举例

5.1 简介

根据平台验证方法的一般原则，需要证明来自同一平台的产品具有稳健的病毒清除能力，而且病毒清除的程序需遵循既定且经充分表征的条件。此外，应证明工艺中间体组分与病毒清除研究中使用的中间体组分类似，除非先验知识表明病毒清除工艺对工艺中间体组分具有稳健性。

由此而论，与针对特定产品的工艺验证不同，平台验证定义为使用其他产品的先验知识，包括病毒清除数据验证的内部经验（申请人拥有的数据），说明新的类似产品的下降因子情况。一般而言，基于先验知识（包括内部经验）的新产品病毒清除声明应包括对所有相关平台可用数据的讨论以及支持平台验证方法的基本原理（参见第6.6节）。用于减少产品特定验证的部分先验知识和内部数据可以作为新产品及其生产工艺与其他内部产品、相关工艺条件和工艺中间体的比较予以提供。

专门用于清除病毒的工艺步骤，如通过去污剂、低pH值灭活以及通过病毒过滤去除，适用于平台验证方法。

因此，以下内容给出了通过去污剂、低pH值孵育灭活异嗜性小鼠白血病病毒（XMLV），以及通过病毒过滤去除XMLV的先验知识应用示例。

这些示例仅用于说明目的，表明如何应用平台验证方法，而不应用作监管提交的模板或唯一依据。

基于当前对整个行业应用的各种工艺条件的理解，工艺参数及其对各个工艺步骤的潜在重要性汇总见表A-2至A-4。应根据先验知识和内部经验评估工艺参数和中间体对病毒清除的实际影响。

基于工艺理解不断发展，未来可能会考虑更多的工艺步骤用于平台验证。

5.2溶剂/去污剂或单独去污剂灭活

基于作用机制，去污剂浓度是溶剂/去污剂（SD）灭活或去污剂单独灭活的一个重要工艺参数。

此外，疏水性杂质（如脂质、细胞碎片或细胞培养基的成分（如消泡剂））可通过影响去污剂或SD混合物溶解病毒脂质包膜而影响病毒灭活，因此应进行评估。

迄今为止，尚未有迹象表明病毒与特定治疗性蛋白之间的相互作用会影响去污剂的灭活作用。聚集体（例如，细胞碎片或聚集的病毒颗粒）可能会包埋病毒颗粒并防止其与去污剂接触。因此在生产时，产品中间体（例如细胞培养收获液（HCCF）），应从细胞/细胞碎片中澄清，包括在去污剂灭活之前进行一步≤0.2 µm标称孔径的过滤。

以下段落以SD或Triton X-100为例，描述了如何将平台验证方法应用于XMLV灭活。该方法也可能适用于已证明可强而有效进行XMLV灭活的替代去污剂。

Triton X-100是一种非离子去污剂，常在膜研究中用于溶解脂双层。其通过溶解病毒脂质包膜来灭活脂包膜病毒，从而使病毒失去感染性。多年来，Triton X-100已广泛用于血浆衍生产品生产过程中的病毒灭活，以及添加到HCCF中用于mAbs平台纯化过程中的病毒灭活。

由于在环境中的降解物具有类激素活性，Triton X-100被欧洲化学品管理署列入授权清单（附件XIV）。因此，尽管其被广泛使用，制药行业正在寻找可替代去污剂。其他具有类似理化特性的去污剂可于市场上购买，也可实现有效的XMLV灭活。由于对Triton X-100的特性已有很好的了解，而且有足够多关于其有效性的知识，因此本指导原则将Triton X-100灭活作为示例。

由于Triton X-100的非离子性质，其有效性不应受pH值、离子强度或HCCF中反离子性质的影响。既往经验表明，在0.2% Triton X-100浓度、15°C和60分钟的孵育条件下，来自平台工艺的多种产品均可有效灭活包含一系列典型脂质和总蛋白的HCCF中的XMLV。然而，如下所述，在不进行特定产品实验时，建议应用0.5%的Triton X-100浓度，以确保有效和可靠的灭活。

基于去污剂的脂质包膜病毒灭活的工艺参数及其潜在重要性汇总如表A-2所示，使用Triton-X100或SD试剂和MLV作为示例。

表A-2：工艺参数或因素及其对去污剂灭活或SD处理的潜在影响总结

因此，基于目前对使用Triton X-100处理澄清HCCF的工艺理解，在≥15°C条件下使用浓度≥0.5% Triton X-100进行≥60分钟的处理，可有效灭活用于多种细胞培养衍生产品的XMLV。使用SD试剂时，用1%的Triton X-100和0.3%的磷酸三丁酯处理≥30分钟，或在≥23°C条件下使用1%的聚山梨酯80和0.3%的磷酸三丁酯处理≥6小时，可有效灭活逆转录病毒。根据目前的工艺理解，平台验证方法可应用于通过SD处理或单独使用Triton X-100处理的XMLV灭活。

5.3低pH孵育

低pH处理是通过使病毒包膜中的蛋白质变性来灭活脂包膜病毒，从而防止病毒吸附到细胞上并感染细胞。捕获色谱后工艺中间品的低pH处理已广泛用于细胞培养衍生产品（如mAbs）生产过程中的逆转录病毒灭活。

灭活效率取决于作为灭活剂的氢离子浓度，以pH值、孵育时间和温度以及缓冲液基质来衡量。极高的离子强度也可能影响灭活效率。

工艺参数及其对低pH灭活XMLV的潜在影响汇总如表A-3所示。

表A-3：工艺参数或因素及其对低pH灭活的潜在影响和对XMLV的影响总结

(a)：迄今为止，关于其他缓冲液离子强度影响的数据有限。

基于目前的工艺理解，在≤pH 3.6、≥15°C、≤500 mmol/L氯化钠浓度下，≥30分钟的低pH处理可有效灭活XMLV。乙酸盐和枸橼酸盐缓冲液是最常用的缓冲液，可有效灭活XMLV。

根据目前的工艺理解，平台验证方法可应用于低pH处理的XMLV灭活。

5.4 病毒过滤

病毒过滤的主要作用机理是基于粒径的病毒颗粒去除。一般而言，产品中间体的体积通量以及冲洗过滤器的缓冲液的体积通量和压力（包括压力/流量中断）是病毒过滤的潜在关键参数。

在病毒粒径远大于过滤器孔径的情况下，病毒颗粒与产品的潜在相互作用并不重要。然而，在病毒粒径和孔径相似的情况下，尚未完全了解潜在相互作用对病毒截留的影响。

本节其他内容重点介绍利用其他产品在病毒过滤方面的先验知识和内部经验，说明通过小型和大型病毒截留过滤器去除大型病毒的相关信息。先验知识对小型和大型病毒截留过滤器都适用，但本节重点关注小型病毒截流过滤器，因为其更为常用。

已充分了解影响小型病毒截留过滤器有效去除逆转录病毒的因素，如膜类型（型号和特性）、流速或压力控制过滤模式，切向或死端过滤以及压力中断等工艺参数的变化。基于病毒去除的可预测性和稳健性，该工艺步骤适用于平台验证方法。

针对使用小型病毒截留过滤器进行的病毒去除，一种选择是对较大的球形/二十面体病毒和脂包膜病毒应用细小病毒的下降因子，从而避免对大型病毒进行验证研究。然而，这可能导致因细小病毒通过而低估病毒清除能力（例如大型病毒清除能力）。鉴于基于粒径的作用机理，以及使用小型病毒截留过滤器彻底去除逆转录病毒的行业经验，公司可以使用其从细小病毒和大型病毒去除中获得的内部数据，为常用小型病毒截留过滤器建立平台大型病毒清除声明。

根据基于粒径的去除机理，理论上小型病毒通过小型病毒截留过滤器的风险比大型病毒高。

需要充分了理解压力/流量中断的影响，以及采用反映生产条件下的体积通量和过滤器冲洗量。应当考虑，低压/低流量或压力/流量中断可能会对特定类型的病毒过滤器产生一定负面影响。

如果利用其他产品的先验知识和内部经验来声明细小病毒的去除情况，则至少需要使用细小病毒在最差条件下进行一次特定产品的确认验证（参见表A-4）。病毒截留过滤器的品牌/型号对于病毒去除及其在工艺参数影响方面的稳健性非常重要，应在设计平台数据时纳入考量。

表A-4总结了工艺参数及其对小型病毒截留过滤器截留细小病毒的潜在影响。

表A-4. 小型病毒截留过滤器截留细小病毒的工艺参数或因素及其潜在影响汇总

附件6：基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品

6.1 简介

生物技术的进步导致新的和先进的生产平台的出现，用以呈现使用人或动物来源的已表征细胞库（即鸟类、哺乳动物或昆虫）生产的新产品类型。附件6的范围包括使用辅助病毒和蛋白表达病毒载体（统称为生产病毒）或稳定转化或瞬时转染的细胞系生产的基因工程病毒载体以及病毒载体衍生产品。根据对产品理化特性的考虑，这些产品适合进行病毒清除。这些产品包括使用杆状病毒/昆虫细胞生产的蛋白质亚基和VLPs、基于纳米颗粒的蛋白疫苗以及病毒载体产品（如AAV）。这些载体可应用于体内或体外。

辅助病毒非依赖性产品可以使用稳定转化或瞬时转染的细胞系，或通过感染重组蛋白表达病毒载体或VLP（例如重组杆状病毒）生产。辅助病毒依赖性产品需要辅助病毒来使产品表达或病毒载体复制（例如AAVs需要单纯疱疹病毒病毒或腺病毒）。

生物制药产品病毒污染的潜在来源如主要指导原则第2节中所述。应考虑额外的病毒污染风险，例如由表达系统引入的风险，以及复制型病毒污染的可能性。在评估产品生产过程中外来污染的可能性时，应仔细考虑细胞基质对外源病毒的易感性。使用充分表征的细胞库和病毒种子可降低病毒污染的风险。生产病毒被视为与工艺相关杂质。

新产品类型的病毒安全性和污染控制应通过材料采购的综合方案的应用、在适当的生产工艺步骤进行病毒检测以及通过生产工艺去除和/或灭活外源病毒和生产病毒得到保证。在病毒清除受限的情况下，病毒安全性应集中在原材料和试剂以及生产工艺的检测和控制。

因此，应采用基于风险的方法来证明产品的病毒安全性。

6.2 病毒检测

应在适当的生产阶段对内源性病毒和外源性病毒进行大量检测和表征，以支持产品的整体安全性。基于产品类型及其相关风险因素，检测方案应适用于整个产品生命周期。在生产过程中各个工艺步骤所要进行的检测概述如下表A-5所示。对适用于病毒种子、未加工收获液和纯化后产品/原液的检测进行了描述。用于病毒载体生产的细胞基质所需的检测和表征方案参见主要指导原则中的表1；表1中还列出了可能适用于这些产品类型的其他注意事项。生产细胞无法在生产过程中存活的情况下，LIVCA适用于未转染细胞。

检测类型和程度取决于风险评估，且应考虑与细胞基质和生产工艺相关的特定风险因素。应考虑的因素包括细胞基质和病毒种子/载体的来源、传代历史和特性，所用原材料和试剂的来源与生产，所用的细胞培养工艺，生产病毒的使用以及生产工艺灭活和/或去除病毒的能力。

表A-5：在适当的生产阶段应进行的检测 

^a对MCB、WCB、LIVCA、MVS和WVS的允许细胞的28天检测应每两周至少进行一次亚传代。对于未加工收获液，根据风险评估（考虑细胞基质、生产培养期、动物源性原材料或试剂的使用以及工艺的病毒清除水平），在有正当理由的情况下，可缩短至 14 天。应根据现有的地区法规和指南，监测指示细胞培养物中是否存在致细胞病变、红细胞吸附或红细胞凝集病毒。对于在昆虫细胞系中生产的产品，检测应包括用于虫媒病毒的允许细胞系（例如BHK细胞）。如果病毒载体或病毒载体衍生产品无法被中和，NGS可作为替代检测方法且格外有效。应对病毒种子和未加工收获液进行检测。在某些情况下，未加工收获液可能与原液相同。

^b非靶向NGS可替代体内试验（第3.2.3节），补充或替代体外试验（第3.2.2节）。

^c检测以风险评估为基础，包括细胞基质的来源和历史、病毒种子的来源以及人或动物源性原材料的潜在暴露。可使用基于细胞培养的感染性试验、抗体产生试验（MAP、HAP、RAP）、病毒特异性NAT或其他分子方法（如NGS）。详细信息请参见第3.2.4节。如果使用血清或胰蛋白酶，则可能包括种属特异性病毒检测，例如昆虫细胞中的虫媒病毒以及牛或猪的病毒。

^d如果MCB或病毒种子的逆转录病毒为阳性，则接下来应对来自至少3个批次的未加工收获液进行潜在逆转录病毒颗粒的定量检定，以确定病毒清除的目标水平。对于MVS，如果仍存在残余风险，则可考虑对未加工收获液进行检测。

^e应在未加工收获液阶段使用至少3个细胞培养批次对生产病毒进行量化，以确定病毒清除的目标。对于原液（纯化后产品），应针对相关允许细胞系使用感染性试验进行病毒敏感性检测，确认无可检测到的生产病毒。此外，也可使用分子生物学方法进行检测。除非有可靠的清除证明，否则应对每个纯化后产品进行无残留生产病毒检测（情况F，表4）。

^f复制型病毒（RCV）可能在生产过程中的任一步骤出现。建议在生产的多个阶段检测RCV。如适用，应在病毒种子/库和每一批未加工收获液、原液或制剂上进行RCV检测，以达到最大的检测效果。

^g当体外或体内检测可能受到干扰时，在病毒种子和/或未加工收获液阶段检测平行培养的对照细胞。在使用NGS检测病毒种子和未加工收获液时，无需检测对照细胞培养物。

^h如果细胞库未检测，则应对病毒种子进行检测。

ⁱ检测应对病毒种子进行。根据产品类型，病毒种子可用于生产疫苗病毒、病毒载体或辅助病毒。病毒种子由已确立的细胞系生成。与基于风险的方法一致，病毒检测应考虑细胞系的来源以及用于制备病毒种子的原材料和试剂，以确保不存在外源性病毒和复制型病毒。由于WVS直接来源于MVS，因此基于风险评估，进行一部分外源病毒检测。另外，不对MVS进行全检，而对每一个WVS进行全检来作为替代手段也是可以的。

^j基于风险评估检测。

6.3 病毒清除

应尽可能按照本指导原则的一般原则降低外源性病毒、内源性病毒和残留生产病毒污染的风险。一些病毒载体产品（如AAVs）适用于病毒清除步骤，确保外源病毒和生产病毒的清除（灭活或去除）。

应采用代表性及经表征的缩小模型评估病毒清除情况。

病毒载体和病毒载体衍生产品的理化特性将决定在下游工艺中病毒清除方法的应用。病毒清除研究应包括生产病毒本身或特异性“模型”病毒（如杆状病毒、腺病毒、疱疹病毒）以及代表外源和内源病毒的“模型”病毒（见表A-1）。关于表4所述的特异和非特异“模型”病毒选择的行动计划，请参见第5节和第6节。生产工艺应对用于蛋白表达的病毒载体或辅助病毒有稳健的清除率。常见的病毒灭活步骤，如用去污剂或溶剂/去污剂处理，可能适用于与其兼容的产品（如无包膜的病毒载体）。此外，病毒过滤可能更适合于小病毒载体，如AAV或基于纳米颗粒的疫苗，其中病毒去除可以基于粒径排阻而实现。层析步骤可以清除表面特性与病毒载体不同的病毒。适当时，应当进行病毒清除研究，以确定生产工艺相关步骤的病毒下降因子。例如，可被纯化的使用杆状病毒/昆虫细胞生产的亚单位蛋白和VLP，并且可以通过生产工艺实现病毒清除。

这些产品的病毒安全性可能依赖于封闭式处理、检测和其他预防性控制措施（见第2.2、3和4节）。由于生产过程中的病毒清除工艺可能无法达到与重组蛋白相同的稳健性，因此这些产品的病毒安全性应基于风险评估。